由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
目前尚未发现针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治愈方法，该疾病是55岁以上人群视力丧失的首要原因。AMD是一种复杂的多因素疾病，其病因尚不明确，但普遍认为主要由视网膜色素上皮细胞（RPE）的死亡或功能障碍引起。RPE是一层位于视网膜下方的单层细胞，为光感受器提供关键支持。RPE细胞替代策略可能为大量AMD患者提供有效的治疗缓解。包括我们实验室在内的多个独立研究团队已成功生成了与原代人类RPE细胞（hRPE）高度相似的RPE细胞。此外，iPS来源的RPE细胞不仅可用于细胞治疗，还被广泛用于构建RPE相关疾病的体外模型。此类研究不仅能揭示疾病的分子机制，还可作为开发和测试新型药物的宝贵工具。本文介绍了一种优化的干细胞定向分化为RPE细胞的实验方案。在特定时间点加入烟酰胺以及Activin A或其功能模拟小分子IDE-1，可显著提高RPE细胞的诱导效率。利用该技术，我们可在短短三个月内获得大量低传代次数的RPE细胞。
引言
构成视网膜的各种细胞类型以特定的功能结构排列。位于视网膜后部的光感受器负责通过光转导过程将光转化为电信号。然而，若无邻近其他细胞类型（包括穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞）的协同作用，光转导无法完成。单层RPE细胞将感光视网膜与脉络膜毛细血管（光感受器的主要血液供应来源）分隔开，并处于理想位置以调控多种对光感受器稳态至关重要的功能。事实上，RPE细胞与光感受器之间高度相互依赖，通常被认为共同构成一个单一的功能单位。（有关RPE多种功能的综述，参见Strauss, 20051。）视网膜色素上皮细胞的死亡或功能障碍可引发年龄相关性黄斑变性（AMD），这是工业化国家永久性视力丧失的首要原因2-4。
年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种影响视网膜色素上皮（RPE）、光感受器和脉络膜血管系统的多因素疾病，其风险因素多种多样，包括环境与遗传因素的共同作用5,6。目前对AMD的治疗手段非常有限，而一种有前景的潜在疗法是RPE细胞替代治疗7,8。尽管已有报道的结果不一，但在AMD患者（以及其他视网膜变性患者）以及视网膜变性动物模型中移植RPE细胞，有可能暂时防止显著的光感受器萎缩9-23。（这些研究中常用的动物模型是皇家外科医师学院（RCS）大鼠，其携带MerTK基因的突变，该突变导致RPE细胞无法吞噬光感受器外节段，从而促进视网膜变性24。）尽管在RC....
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方案
1. 干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的定向分化
注意：所有孵育步骤均在 37 °C、5% CO2 条件下进行
- 使用维持培养基（MM；表1）每日换液，维持hES或hiPS细胞系的培养。当细胞系达到足够的质量控制标准后，将其培养在接种密度为每六孔板孔250,000的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。也可按照Tucker et al.40建立的方案制备无异源成分的培养体系。
- 让干细胞集落生长至融合状态。
- 更换为含烟酰胺的分化培养基（DM/NIC；表1），每日换液。
- 培养三周后，更换为含烟酰胺以及Activin-A或IDE-1的分化培养基（DM/NIC/AA或DM/NIC/IDE1；表1），以促进视网膜色素上皮（RPE）的分化。
- 培养五周后，重新换回DM/NIC培养基。当培养基中的pH指示剂在换液后第二天不再变黄时，可停止每日换液。
- 等待出现足够大、可用于切割和分离的色素化细胞岛（见图2D-F和图3A）。
2. ....
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结果
本文所述步骤如图1所示，可便捷地从干细胞诱导生成视网膜色素上皮（RPE），方法如先前报道10,12。在维持iPS细胞系数周后，5至7周后细胞集落中开始出现色素化集落（7周龄培养物见图2A-C）。随着培养的持续，这些集落可继续生长数周。当集落达到足够大小时（8周龄培养物见图2D-F），可按图3A所示进行手动切除。仔细切除以避免非RPE细胞污染，将极大有助于获得纯度足够的RPE细胞培养物（图3B-C）。
图 1：诱导性多.......
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讨论
在本论文中，我们概述了高效生成大量高纯度iPS-RPE培养物的步骤。我们先前已证明，采用Activin A的定向分化方案可获得在转录组学、蛋白质组学、代谢组学及功能特性上均与hRPE高度相似的iPS-RPE，并且在植入RCS大鼠后能够延缓视网膜退行性病变12,31,32。生成iPS-RPE的过程耗时较长，但操作并不繁琐（图1）。一旦iPS细胞培养至融合状态，需每日更换分化培养基。我们在培养基中添加Activin A或成本较低的小分子IDE-1，并持续喂养两周，同时监测出现色素的iPS-RPE克隆，这些克隆通常在5至7周后显现（图2A-C）。当克隆达到足够大小时（图2D-F和图3A），需手动将其分离并转移至新培养板中进行扩增。此步骤大约在第8周进行，是整个实验流程中最费力的环节。
最具挑战性的环节是在扩增培养过程中避免混入非RPE细胞，即在收集色素化克隆时意外获取了邻近的无关细胞。根据污染程度的不同，可在扩增过程中手动去除非RP.......
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披露
所有作者均无任何商业利益需要声明。
致谢
我们谨向以下人士致以诚挚感谢：Tim Krohne 博士和 Eyal Banin 博士（以及 Mandy Lehmann 博士和 David Friedlander）在建立分化方案过程中提供了慷慨帮助。Felicitas Bucher 博士协助完成了本研究中所用视网膜色素上皮（RPE）细胞的分化工作。我们同时感谢美国国家眼科研究所（NEI 资助项目 EY11254 和 EY021416）、加州再生医学研究所（CIRM 资助项目 TR1-01219）以及 Lowy 医学研究所（LMRI）为本项目提供的大力支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 角膜刀 | Surgipro | SPOI-070 | 刀 x 1 |
| DMEM/F-12 培养基，含 HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（1×），不含 Ca 或 Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| 胎牛血清，常规（热灭活） | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| 碱性成纤维细胞生长因子（氨基酸 10-155），重组人蛋白 | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM 培养基 | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut 血清替代物 | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100×） | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| 重组人/小鼠/大鼠 Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T 表面 6 孔板 | Corning | 3877 | 每箱(12) x 1 |
| TrypLE-Express 酶（1×），不含酚红 | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| 真空过滤/储存瓶系统，孔径 0.1µm，500 ml | Corning | 431475 | 每箱(12) x 1 |
参考文献
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S.
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重印与许可
