高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

摘要

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。

摘要

目前尚未发现针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治愈方法，该疾病是55岁以上人群视力丧失的首要原因。AMD是一种复杂的多因素疾病，其病因尚不明确，但普遍认为主要由视网膜色素上皮细胞（RPE）的死亡或功能障碍引起。RPE是一层位于视网膜下方的单层细胞，为光感受器提供关键支持。RPE细胞替代策略可能为大量AMD患者提供有效的治疗缓解。包括我们实验室在内的多个独立研究团队已成功生成了与原代人类RPE细胞（hRPE）高度相似的RPE细胞。此外，iPS来源的RPE细胞不仅可用于细胞治疗，还被广泛用于构建RPE相关疾病的体外模型。此类研究不仅能揭示疾病的分子机制，还可作为开发和测试新型药物的宝贵工具。本文介绍了一种优化的干细胞定向分化为RPE细胞的实验方案。在特定时间点加入烟酰胺以及Activin A或其功能模拟小分子IDE-1，可显著提高RPE细胞的诱导效率。利用该技术，我们可在短短三个月内获得大量低传代次数的RPE细胞。

引言

构成视网膜的各种细胞类型以特定的功能结构排列。位于视网膜后部的光感受器负责通过光转导过程将光转化为电信号。然而，若无邻近其他细胞类型（包括穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞）的协同作用，光转导无法完成。单层RPE细胞将感光视网膜与脉络膜毛细血管（光感受器的主要血液供应来源）分隔开，并处于理想位置以调控多种对光感受器稳态至关重要的功能。事实上，RPE细胞与光感受器之间高度相互依赖，通常被认为共同构成一个单一的功能单位。（有关RPE多种功能的综述，参见Strauss, 2005¹。）视网膜色素上皮细胞的死亡或功能障碍可引发年龄相关性黄斑变性（AMD），这是工业化国家永久性视力丧失的首要原因^2-4。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种影响视网膜色素上皮（RPE）、光感受器和脉络膜血管系统的多因素疾病，其风险因素多种多样，包括环境与遗传因素的共同作用^5,6。目前对AMD的治疗手段非常有限，而一种有前景的潜在疗法是RPE细胞替代治疗^7,8。尽管已有报道的结果不一，但在AMD患者（以及其他视网膜变性患者）以及视网膜变性动物模型中移植RPE细胞，有可能暂时防止显著的光感受器萎缩^9-23。（这些研究中常用的动物模型是皇家外科医师学院（RCS）大鼠，其携带MerTK基因的突变，该突变导致RPE细胞无法吞噬光感受器外节段，从而促进视网膜变性²⁴。）尽管在RC....

方案

1. 干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的定向分化

注意：所有孵育步骤均在 37 °C、5% CO₂ 条件下进行

1. 使用维持培养基（MM；表1）每日换液，维持hES或hiPS细胞系的培养。当细胞系达到足够的质量控制标准后，将其培养在接种密度为每六孔板孔250,000的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。也可按照Tucker et al.⁴⁰建立的方案制备无异源成分的培养体系。
2. 让干细胞集落生长至融合状态。
3. 更换为含烟酰胺的分化培养基（DM/NIC；表1），每日换液。
4. 培养三周后，更换为含烟酰胺以及Activin-A或IDE-1的分化培养基（DM/NIC/AA或DM/NIC/IDE1；表1），以促进视网膜色素上皮（RPE）的分化。
5. 培养五周后，重新换回DM/NIC培养基。当培养基中的pH指示剂在换液后第二天不再变黄时，可停止每日换液。
6. 等待出现足够大、可用于切割和分离的色素化细胞岛（见图2D-F和图3A）。

2. ....

结果

本文所述步骤如图1所示，可用于从干细胞快速生成视网膜色素上皮（RPE），方法此前已有报道^10,12。在维持iPS细胞系数周后，5至7周时细胞集落中开始出现色素化集落（图2A-C显示7周龄培养物）。这些集落可在培养过程中持续生长数周。当集落生长至足够大小时（如图2D-F所示8周龄培养物），可按图3A所示方法进行手动切除。仔细切除以避免混入非RPE细胞，将极大有助于获得纯度足够的RPE培养物（图3B-C）。

图1：iPS-RPE分化.......

讨论

在本论文中，我们概述了高效生成大量高纯度iPS-RPE培养物的步骤。我们先前已证明，采用Activin A的定向分化方案可获得在转录组学、蛋白质组学、代谢组学及功能特性上均与hRPE高度相似的iPS-RPE，并且在植入RCS大鼠后能够延缓视网膜退行性病变^12,31,32。生成iPS-RPE的过程耗时较长，但操作并不繁琐（图1）。一旦iPS细胞培养至融合状态，需每日更换分化培养基。我们在培养基中添加Activin A或成本较低的小分子IDE-1，并持续喂养两周，同时监测出现色素的iPS-RPE克隆，这些克隆通常在5至7周后显现（图2A-C）。当克隆达到足够大小时（图2D-F和图3A），需手动将其分离并转移至新培养板中进行扩增。此步骤大约在第8周进行，是整个实验流程中最费力的环节。

最具挑战性的环节是在扩增培养过程中避免混入非RPE细胞，即在收集色素化克隆时意外获取了邻近的无关细胞。根据污染程度的不同，可在扩增过程中手动去除非RP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
角膜刀	Surgipro	SPOI-070	刀 x 1
DMEM/F-12 培养基，含 HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
杜氏磷酸盐缓冲液（1×），不含 Ca 或 Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
胎牛血清，常规（热灭活）	VWR	45000-736	500 ml x 1
碱性成纤维细胞生长因子（氨基酸 10-155），重组人蛋白	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM 培养基	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut 血清替代物	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-谷氨酰胺 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM 非必需氨基酸溶液（100×）	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
重组人/小鼠/大鼠 Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T 表面 6 孔板	Corning	3877	每箱(12) x 1
TrypLE-Express 酶（1×），不含酚红	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
真空过滤/储存瓶系统，孔径 0.1µm，500 ml	Corning	431475	每箱(12) x 1