高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

摘要

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。

摘要

目前尚未发现针对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治愈方法，该疾病是55岁以上人群视力丧失的首要原因。AMD是一种复杂的多因素疾病，其病因尚不明确，但普遍认为主要由视网膜色素上皮细胞（RPE）的死亡或功能障碍引起。RPE是一层位于视网膜下方的单层细胞，为光感受器提供关键支持。RPE细胞替代策略可能为大量AMD患者提供有效的治疗缓解。包括我们实验室在内的多个独立研究团队已成功生成了与原代人类RPE细胞（hRPE）高度相似的RPE细胞。此外，iPS来源的RPE细胞不仅可用于细胞治疗，还被广泛用于构建RPE相关疾病的体外模型。此类研究不仅能揭示疾病的分子机制，还可作为开发和测试新型药物的宝贵工具。本文介绍了一种优化的干细胞定向分化为RPE细胞的实验方案。在特定时间点加入烟酰胺以及Activin A或其功能模拟小分子IDE-1，可显著提高RPE细胞的诱导效率。利用该技术，我们可在短短三个月内获得大量低传代次数的RPE细胞。

引言

构成视网膜的各种细胞类型以特定的功能结构排列。位于视网膜后部的光感受器负责通过光转导过程将光转化为电信号。然而，若无邻近其他细胞类型（包括穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞）的协同作用，光转导无法完成。单层RPE细胞将感光视网膜与脉络膜毛细血管（光感受器的主要血液供应来源）分隔开，并处于理想位置以调控多种对光感受器稳态至关重要的功能。事实上，RPE细胞与光感受器之间高度相互依赖，通常被认为共同构成一个单一的功能单位。（有关RPE多种功能的综述，参见Strauss, 2005¹。）视网膜色素上皮细胞的死亡或功能障碍可引发年龄相关性黄斑变性（AMD），这是工业化国家永久性视力丧失的首要原因^2-4。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种影响视网膜色素上皮（RPE）、光感受器和脉络膜血管系统的多因素疾病，其风险因素多种多样，包括环境与遗传因素的共同作用^5,6。目前对AMD的治疗手段非常有限，而一种有前景的潜在疗法是RPE细胞替代治疗^7,8。尽管已有报道的结果不一，但在AMD患者（以及其他视网膜变性患者）以及视网膜变性动物模型中移植RPE细胞，有可能暂时防止显著的光感受器萎缩^9-23。（这些研究中常用的动物模型是皇家外科医师学院（RCS）大鼠，其携带MerTK基因的突变，该突变导致RPE细胞无法吞噬光感受器外节段，从而促进视网膜变性²⁴。）尽管在RCS大鼠和小鼠视网膜下腔移植的RPE细胞存活率报道差异较大，但这些细胞有可能存活数月甚至数年^9,10,12,20。

通过多能干细胞可以获得足量的视网膜色素上皮（RPE）细胞用于移植^9-14,25-28。多个独立研究团队已证实，这些细胞在功能上与其体细胞来源的对应细胞相似，长期研究也表明它们在大鼠和小鼠疾病模型中植入后具有良好的安全性^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}。使用诱导性多能干细胞（iPS细胞）替代胚胎干细胞可能具有优势，因为可避免异体RPE细胞相关的伦理问题和免疫学挑战^33,34。iPS技术另一项令人振奋的应用是疾病建模³⁵。利用来自RPE疾病患者的细胞衍生出大量RPE细胞，将有助于深入理解这些疾病的分子基础，具有重要价值。此类研究已在Best病患者的RPE细胞中开展，并可能为其他遗传性黄斑病变的类似研究铺平道路³⁶。

由干细胞诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞是一个相对简单的过程，且可在完全无异源成分的条件下完成。最简单的方法是自发诱导形成RPE细胞单层，但通过定向分化技术可显著提高产量。然而，这些技术需要使用外源性蛋白质因子，这类因子通常价格昂贵，且常在细菌或其他非人类来源系统中生产^10,12,37。在我们的研究中，我们采用了一种已建立的方案¹⁰，该方案使用烟酰胺和激活素A（Activin A）——一种已被证明足以诱导RPE特化的信号分子³⁸。本文将证明，小分子IDE-1可有效替代Activin A，从而降低成本，并减轻使用重组蛋白所带来的相关顾虑³⁹。此外，我们使用无异源成分的血清替代物，并将正在分化的RPE细胞培养在一种合成的无异源成分基质上。先前研究已表明，采用该方法可非常有效地诱导RPE细胞分化⁴⁰。

当以单层形式分化时，最早在五周后即可观察到含有视网膜色素上皮（RPE）细胞的色素化克隆¹²。一旦克隆达到足够大小，可手动切除并转移至另一培养皿中进行扩增。RPE细胞在传代过程中极易发生去分化，因此应避免使用超过五代的细胞（我们发现，经过两到三代传代后，即可轻松获得足够数量的细胞，用于表征及在动物模型中的移植）。细胞完全分化后，我们采用多种技术从解剖学和功能学层面对其进行表征，以确保其能够有效替代病变的RPE细胞。这些表征技术的具体描述以及将iPS来源的RPE细胞植入啮齿类动物视网膜下腔的实验方案，已在此前发表的研究中详细阐述^12,32,41，不再赘述于本方法学论文中。

尽管开发用于高效诱导iPS-RPE的标准化方案对于临床应用显然至关重要，但在动物模型中仍需开展大量临床前研究。目前对iPS来源细胞的免疫原性仍存在担忧，多种不同的移植技术（包括在人工基质上移植细胞）正在被探索^42,43。基于这些原因，我们认为发表标准化操作方案将有助于推动临床及临床前研究的开展，特别是当需要对不同实验室、不同研究团队所获得的iPS-RPE细胞进行直接比较时。

方案

1. 干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的定向分化

注意：所有孵育步骤均在 37 °C、5% CO₂ 条件下进行

1. 使用维持培养基（MM；表1）每日换液，维持hES或hiPS细胞系的培养。当细胞系达到足够的质量控制标准后，将其培养在接种密度为每六孔板孔250,000的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上。也可按照Tucker et al.⁴⁰建立的方案制备无异源成分的培养体系。
2. 让干细胞集落生长至融合状态。
3. 更换为含烟酰胺的分化培养基（DM/NIC；表1），每日换液。
4. 培养三周后，更换为含烟酰胺以及Activin-A或IDE-1的分化培养基（DM/NIC/AA或DM/NIC/IDE1；表1），以促进视网膜色素上皮（RPE）的分化。
5. 培养五周后，重新换回DM/NIC培养基。当培养基中的pH指示剂在换液后第二天不再变黄时，可停止每日换液。
6. 等待出现足够大、可用于切割和分离的色素化细胞岛（见图2D-F和图3A）。

2. 分离色素性胰岛

1. 用一种模拟天然细胞环境的基质包被24孔板的孔（优选无异源成分的基质）。
   注意：角膜刀和尖细的精细镊子在挑取操作中非常有用。在挑取过程中，整个分化细胞层可能脱落。为避免此情况，请小心操作，并从培养皿中央开始挑取克隆。
2. 根据所收集的色素化克隆数量，向24孔板中加入适量的分化培养基（DM；表1）。
3. 在配备解剖显微镜的细胞培养罩内，手动切割出带有色素的细胞岛。使用手术刀在原培养板底部将每个细胞岛切成约2–6小块，并用尖头镊子夹取带色素的部分。
4. 将1–2个带色素的组织块转移至每个24孔板孔中。
5. 在细胞贴壁前，3–5天内不更换培养基；贴壁后开始每周更换培养基三次。（若超过该时间仍未能贴壁，则很可能无法贴壁。）
6. 在分化培养基（DM；表1）中培养3–4周——典型培养状态如图3B所示。此时细胞可能仍未完全铺满孔底，但延长培养时间通常无明显改善。每周喂养细胞三次。
7. 约3周后，如有必要，可使用尖头镊子手动去除成团的白色细胞簇。除非确有必要，否则不要进行此操作——该步骤容易引入污染。理想情况是在第1.6步中即从原始色素化克隆获得最纯的视网膜色素上皮（RPE）细胞群体。

3. 干细胞来源的视网膜色素上皮细胞传代

1. 使用200 µl细胞解离液（建议避免使用胰蛋白酶，优先选择可通过稀释失活的试剂）在37 °C条件下处理5–8分钟，通过加入DM培养基稀释以终止反应。用200 µl移液器冲洗并重悬所有细胞（若所选孔中细胞数量较少，可考虑合并两个24孔板中的细胞）。
2. 离心（800 × g，5分钟），弃去上清液，用3 ml DM培养基重悬细胞。
3. 将一个（或两个）24孔板中的细胞重新接种至一个经基质包被的6孔板中，每孔加入3 ml DM培养基（按1:5比例扩增）。
4. 扩增培养1–2周，直至细胞融合度达到约90%；完全分化的纯化培养物图像见图3C。
5. 使用1 ml细胞解离液在37 °C条件下处理约5–8分钟，通过加入DM培养基稀释以终止反应，用1,000 µl移液器冲洗并收集所有细胞，重悬细胞悬液。
6. 离心（800 × g，5分钟），弃去上清液，用18 ml DM培养基重悬细胞。
7. 将一个6孔板中的细胞分别接种至六个经基质包被的6孔板中，每孔加入3 ml DM培养基（按1:6比例扩增），或接种至一个包被的75 cm²培养瓶中（按1:7.5比例扩增）。
8. 根据需要重复步骤3.4–3.8，直至获得足够数量的细胞。
   注意：应尽可能多地收集克隆用于扩增，而非依赖传代扩增培养物，因为每次传代均可能诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞去分化。

结果

本文所述步骤如图1所示，可便捷地从干细胞诱导生成视网膜色素上皮（RPE），方法如先前报道^10,12。在维持iPS细胞系数周后，5至7周后细胞集落中开始出现色素化集落（7周龄培养物见图2A-C）。随着培养的持续，这些集落可继续生长数周。当集落达到足够大小时（8周龄培养物见图2D-F），可按图3A所示进行手动切除。仔细切除以避免非RPE细胞污染，将极大有助于获得纯度足够的RPE细胞培养物（图3B-C）。

图 1：诱导性多...

讨论

在本论文中，我们概述了高效生成大量高纯度iPS-RPE培养物的步骤。我们先前已证明，采用Activin A的定向分化方案可获得在转录组学、蛋白质组学、代谢组学及功能特性上均与hRPE高度相似的iPS-RPE，并且在植入RCS大鼠后能够延缓视网膜退行性病变^12,31,32。生成iPS-RPE的过程耗时较长，但操作并不繁琐（图1）。一旦iPS细胞培养至融合状态，需每日更换分化培养基。我们在培养基中添加Activin A或成本较低的小分子IDE-1，并持续喂养两周，同时监测出现色素的iPS-RPE克隆，这些克隆通常在5至7周后显现（图2A-C）。当克隆达到足够大小时（图2D-F和图3A），需手动将其分离并转移至新培养板中进行扩增。此步骤大约在第8周进行，是整个实验流程中最费力的环节。

最具挑战性的环节是在扩增培养过程中避免混入非RPE细胞，即在收集色素化克隆时意外获取了邻近的无关细胞。根据污染程度的不同，可在扩增过程中手动去除非RP...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
角膜刀	Surgipro	SPOI-070	刀 x 1
DMEM/F-12 培养基，含 HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
杜氏磷酸盐缓冲液（1×），不含 Ca 或 Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
胎牛血清，常规（热灭活）	VWR	45000-736	500 ml x 1
碱性成纤维细胞生长因子（氨基酸 10-155），重组人蛋白	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM 培养基	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut 血清替代物	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-谷氨酰胺 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM 非必需氨基酸溶液（100×）	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
重组人/小鼠/大鼠 Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T 表面 6 孔板	Corning	3877	每箱(12) x 1
TrypLE-Express 酶（1×），不含酚红	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
真空过滤/储存瓶系统，孔径 0.1µm，500 ml	Corning	431475	每箱(12) x 1