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方法文章

从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

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⸱

DOI：

10.3791/52215

⸱

2015年1月18日

 ,  , 
1Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California

本文内容

摘要

我们介绍一种用于培养具有肌成纤维细胞表型的小鼠和人食管间质细胞原代培养物的实验方案。培养的细胞呈梭形形态，表达α-SMA和波形蛋白（vimentin），且不表达上皮细胞、造血细胞和内皮细胞的表面标志物。经鉴定的间质细胞可用于上皮-间质相互作用的功能研究。

摘要

通过酶消化法获取小鼠和人类食管肌成纤维细胞。取新生小鼠（8–12日龄）食管组织，切碎、洗涤后，用胶原酶和分散酶消化25分钟。人类食管切除标本去除固有肌层和外膜后，将剩余黏膜组织切碎，并用胶原酶和分散酶消化长达6小时。培养所得细胞表达α-SMA和波形蛋白，对结蛋白呈弱表达或不表达。培养条件不利于上皮细胞、造血细胞或内皮细胞生长。通过流式细胞术检测潜在污染的造血细胞和内皮细胞表面标志物的表达，进一步确认培养细胞的纯度。该方法操作简便，可稳定获得非造血、非内皮的间质细胞。该技术的局限性源于分子生物学研究中使用原代培养细胞所固有的问题。 即，不同小鼠或人类个体间建立的培养体系所不可避免的变异性。然而，原代培养更能真实反映 体内 与细胞系相比具有更接近生理状态的优势。这些方法还使研究人员能够从不同的临床和实验条件下分离并培养间质细胞，从而实现组间比较。经鉴定的食管间质细胞还可用于功能研究，以探讨食管疾病中的上皮-间质相互作用。

引言

上皮-间质相互作用参与调控多种胃肠道功能，包括黏膜再生、修复、纤维化以及癌变过程1,2。这些相互作用在小肠和结肠中研究最为深入，可能在食管黏膜疾病中也发挥类似作用3。已发现一类称为肌成纤维细胞的肠道和结肠间质细胞亚群，可介导组织损伤、炎症及修复过程4,5。在远端胃肠道中，这些纺锤形细胞位于上皮与固有层交界处的基底膜旁，其表型定义为α-SMA和波形蛋白阳性，广谱细胞角蛋白阴性，且弱阳性或结蛋白阴性5。

食管间质在细胞或分子水平上尚未得到充分表征。我们在小鼠食管中的研究已证实食管间质中存在α-SMA和波形蛋白（vimentin）阳性细胞，这些细胞偶尔位于复层鳞状上皮下方6。上皮-间质相互作用已被认为参与了食管黏膜疾病的发生，例如胃-食管反流介导的损伤6和嗜酸性粒细胞性食管炎3。纤维化性狭窄也是食管损伤的已知并发症，间质细胞被认为参与了胃肠道纤维化的发病机制。分离这些细胞将有助于开展必要的研究，以探究异常的信号通路。

本投稿提供了建立α-SMA阳性、波形蛋白（vimentin）阳性肌成纤维细胞原代培养所必需的技术，从而有助于填补关于介导这些相互作用的信号通路的知识空白。作者已成功应用该技术建立小鼠结肠肌成纤维细胞原代培养体系7，并进一步优化用于建立小鼠6和人源肌成纤维样食管间质细胞。

本文描述了在将小鼠或人类食管来源的培养物用于后续功能研究之前，建立和鉴定这些培养物所需的条件。这些培养物可传代培养并使用至多15代。通过下述方法分离并建立的原代培养物可获得具有肌成纤维细胞表型的间质细胞，其表现为α-SMA和波形蛋白（vimentin）阳性，结蛋白（desmin）弱阳性或阴性，以及细胞角蛋白（cytokeratin）阴性。该表型不同于食管成纤维细胞的表型（主要为波形蛋白阳性、α-SMA阴性3），也不同于黏膜肌层细胞的α-SMA阳性、波形蛋白阴性表型6。

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方案

动物实验方案、研究的原理和目的已提交并获得南加州大学机构动物护理和使用委员会的批准。

从匿名的人类食管切除标本建立原代培养物的方案已获得南加州大学机构审查委员会的批准。

1. 获取小鼠或人类食管

  1. 获取小鼠食管：
    1. 使用2%异氟烷吸入过量麻醉处死8至12日龄小鼠，随后进行颈椎脱位。
    2. 将动物仰卧固定，并用70%乙醇润湿腹侧表面。用镊子夹住尿道口前方的皮肤并提起，使用标准直手术剪沿腹中线从尿道口剪至下颌。注意仅剪开皮肤。
    3. 从尿道口沿两侧向下至膝部做切口，形成倒置的“Y”形。再沿动物两侧肋骨 cage 做切口。
    4. 小心将两侧皮肤从下方的腹膜和肋骨 cage 上剥离，并向两侧翻开。检查覆盖胸腔的肋骨 cage 及覆盖腹腔的腹膜。
      1. 用镊子提起腹膜，剪开至横膈膜和肋骨 cage，剪刀尖朝上，以防损伤腹腔内容物。轻轻提起肝脏左叶，暴露下方的胃、食管-胃交界处及食管的腹段。
    5. 使用高压灭菌的手术剪沿中线剪开胸骨和肋骨 cage，直至颈环。剪刀尖朝上，以防损伤胸腔内容物。将肋骨 cage 向两侧拉开，充分暴露胸腔内容物。
    6. 轻柔移除心脏和两叶肺组织，用棉签吸除多余血液。胸段食管是一条细长而柔韧的管道，位于气管后方和胸椎前方。
      注：在新生小鼠中，食管可能较难辨认。通过定位食管-胃交界处可简便地识别食管。
    7. 从胃部开始沿食管向上仔细分离，剔除周围血管、脂肪和系膜组织，直至食管在颈腔的起始部位。钝头手术剪最适用于此操作。
    8. 完整切除整段食管，并置于Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，用于后续处理（如下所述）。如需定位，可同时取部分胃组织保留。
      注：由于组织体积较小，无法在新生小鼠食管中分离肌层和黏膜肌层，因此整个食管将直接进行如下所述的处理。
  2. 获取人食管组织：
    1. 用HBSS清洗食管切除标本（通常不超过5 cm），并去除附着的结缔组织、脂肪或血管组织。
    2. 如需进行后续组织学检查，可取部分标本置于福尔马林中固定。
    3. 通过锐性解剖将剩余黏膜层与下方的固有肌层分离。
    4. 将黏膜切成小于1厘米的碎片，并按如下所述方案进行处理。
      注：人食管切除标本可在PBS中保存最多6小时后再进行如下处理。食管切除标本的来源将决定标本大小，具体操作依实验室条件而定。

2. 分离小鼠和人类食管间质细胞

  1. 通过机械法与酶消化法相结合，从鼠源和人源组织中分离食管间质细胞。
    1. 使用剪刀将组织剪碎，并用HBSS多次洗涤，进行机械消化。通过将组织与300 U/ml胶原酶XI和0.1 mg/ml中性蛋白酶在37°C下孵育25分钟（小鼠组织）或最长6小时（人组织），进行酶消化。确保用于剪碎组织的器械已经过高压灭菌和灭菌处理。
      注意：胶原酶是一类可降解胶原蛋白的酶，胶原蛋白是一种细胞外基质蛋白，负责维持动物组织的完整性。胶原酶XI具有较高的胶原酶活性，在本分离方案中已取得良好效果。Dispase是一种具有温和蛋白水解解离活性的细菌酶，可保持细胞膜活性，常与胶原酶联合用作辅助酶。
    2. 将从小鼠或人体组织获取的黏膜碎片分别置于含有HBSS的1.7 ml微量离心管或5 ml试管中。使用尖端开口宽度可插入相应试管的剪刀，将组织进一步剪切成2–3 mm大小的片段。静置足够时间，使食管黏膜碎片充分沉降至管底。
    3. 缓慢倾倒出HBSS，注意不要意外丢弃组织。更换新鲜的HBSS，并轻轻振荡。或者，使用1 ml移液器移除HBSS。
    4. 以该方式清洗组织共8次，每次清洗之间轻轻振荡，并留出时间使食管碎片在每次清洗间隔中沉淀。
      注意：人体组织比新生小鼠组织需要更充分的剪碎。
  2. 将小鼠组织与 300 U/ml 胶原酶 XI 和 0.1 mg/ml 中性蛋白酶在室温下于低速摇床上孵育 25 分钟。
    1. 将人组织与300 U/ml XI型胶原酶和0.1 mg/ml中性蛋白酶在室温下置于摇床上，以低速振荡孵育，时间最长可达6小时。
      注意：人食管的可获取性存在差异。人食管黏膜在酶中孵育最长6小时，可成功建立原代培养。
  3. 酶消化后，用剪刀进一步剪碎组织，并在200 × g离心10分钟。
  4. 弃去上清液。将含有混合细胞悬液的沉淀转移至5 ml离心管中，用添加2%山梨醇的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤5次，以去除非活细胞和碎片。
  5. 在6孔板中接种细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）、10 mg/ml胰岛素、10 µg/ml转铁蛋白、10 µg/ml庆大霉素和2 ng/ml表皮生长因子（EGF）的DMEM培养基进行培养。除EGF外，所有组分均需经0.22 µm滤膜真空过滤，EGF可在过滤后加入。根据切除标本的大小，将从人手术切除组织中获得的细胞分配至多个6孔板中。
  6. 当培养孔细胞融合度达到80%时，使用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）将贴壁细胞传代至T25培养瓶中。用培养基中和后，在400 × g条件下离心。
    1. 6 孔板传代至 T25 培养瓶时，按 1:1 比例传代。汇合的 T25 培养瓶可按 1:2 或 1:3 比例传代。从 T25 培养瓶传代至 T75 培养瓶时，使用 1:1 比例。无论培养容器如何，每 2–3 天更换一次培养基。
    2. 在37 ºC、5% CO₂的湿化培养箱中培养细胞2 培养箱中，使用上述培养基培养肌成纤维细胞。
      注意：上皮细胞在这些培养或传代条件下无法存活。用于表征及下述研究中的细胞传代次数在5至15代之间。
    3. 在液氮中冷冻保存细胞2 通过向成肌纤维细胞培养基中添加10%二甲基亚砜。

3. 表征小鼠和人类食管间质细胞

  1. 使用倒置显微镜观察细胞形态。观察贴壁细胞的梭形形态（图1）。
  2. 通过评估以下细胞骨架标志物来表征培养的细胞：α-SMA、波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）和细胞角蛋白（cytokeratin）。具有成肌纤维细胞样表型的间质细胞表达细胞骨架成肌纤维细胞标志物 α-SMA 和波形蛋白（图2）。
    1. 为了进一步区分培养的间质细胞与肌细胞，可对结蛋白进行免疫染色。对培养细胞进行免疫染色时，将 1.5 × 104 个细胞接种于4孔板腔载玻片中，在成肌纤维细胞培养基中培养24小时。具有成肌纤维细胞样表型的间质细胞结蛋白表达微弱或缺失。间质细胞不表达上皮标志物广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）（数据未显示）。
      注意：细胞培养物的评估包括通过免疫细胞化学法检测细胞骨架标志物，以及通过流式细胞术检测细胞表面标志物。免疫细胞化学法作为主要的表征方法，因为成纤维细胞、成肌纤维细胞或肌细胞的细胞骨架蛋白表达谱具有特异性。流式细胞术通过检测上皮、内皮和造血细胞标志物的细胞表面表达来确定培养物的纯度。CD90 可作为辅助手段用于鉴定人源间质细胞，因其在人成纤维细胞和成肌纤维细胞上均有表达；但 CD90 不适用于小鼠间质细胞的表征，因为小鼠T细胞也表达 CD90。
  3. 当细胞达到60%融合度时，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片，并用甲醇固定。将细胞在 -20 °C 的甲醇中孵育10分钟，随后保存于4 °C 的 PBS 中备用。
  4. 按照标准免疫染色流程操作。
  5. 简要地，在加入一抗之前，用含5%山羊血清的PBS对固定后的细胞进行封闭。一抗和二抗也均用含5%山羊血清的PBS稀释。
    1. 检测 α-SMA 和波形蛋白时，使用以下抗体及其稀释比例：小鼠单克隆抗体抗 α-SMA，稀释比例为1:250；兔多克隆抗体抗波形蛋白，稀释比例为1:500。
    2. 一抗在室温下孵育过夜（4 °C），用 PBS 洗涤3次后，加入二抗：罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG（稀释比例1:200）和Cy2标记的山羊抗兔IgG（稀释比例1:1,000），室温孵育1小时。
    3. 用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，浓度为1 µg/mL，孵育1分钟，随后用PBS洗涤。使用倒置显微镜观察载玻片。
  6. 通过流式细胞术检测小鼠和人食管细胞的造血细胞标志物（CD45）和内皮细胞标志物（CD31），以评估培养物的纯度（图3）。进一步通过间质细胞表面标志物 CD90 的表达情况对人源细胞进行表征。
    注意：CD90 不能用于鉴定小鼠间质细胞，因为小鼠T细胞也表达 CD90。
    1. 使用非酶解细胞解离液在37 °C 处理10分钟，将培养的小鼠食管间质细胞从培养瓶中分离，用FACS缓冲液洗涤两次，计数后根据标准染色程序，使用FITC标记的CD45抗体和APC标记的CD31抗体进行染色，并设置相应的同型对照。
    2. 使用FACS Calibur仪器收集细胞，并用FlowJo软件分析数据。在染色前，需使用同型对照、正常小鼠脾脏和骨髓细胞优化抗体并滴定最佳浓度。

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结果

采用机械法和酶消化法分离的食管间质细胞最初接种并培养于6孔板中。接种后数小时内，通过倒置显微镜观察可见混合细胞悬液松散地贴附于培养板底部（图1A）。在接下来的24小时内，可见从混合细胞悬液中长出的梭形细胞牢固贴附于培养板底部（图1B）。这些出芽状细胞在5天内可覆盖整个孔板区域，并可成功传代，且至少在15次传代过程中保持形态稳定。在低密度（图1C）以及接近融合状态时（图1D）均可观察到梭形贴壁细胞。

在培养皿中培养的食管间质细胞原代培养物的免疫染色显示，肌成纤维细胞细胞骨架标志物 α-SMA 和波形蛋白表达丰富（图2），结蛋白表达微弱，细胞角蛋白则无表达。

可通过检测造血细胞和内皮细胞表面标志物来进一步评估食管肌成纤维细胞原代培养物的细胞纯度。首先确定小鼠食管间质细胞原代培养物的前向散射和侧向散射信号，随后对活细胞进行设门并分析其细胞表面蛋白（图...

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讨论

使用小鼠或人类组织进行原代培养的建系技术总体相似，仅需根据组织大小调整剪切和消化时间。我们使用小鼠组织的经验表明，采用上述方法能够稳定成功地建立原代培养体系。该实验方案中的关键步骤包括手术器械的灭菌以及严格遵循组织培养的标准无菌操作技术。小鼠的年龄也是一个关键因素。8至12日龄的新生小鼠 consistently 能够成功获得原代培养物。从未能成功建立来自更年轻新生小鼠的间质细胞。目前仍在尝试从较年长的小鼠中建立类似肌成纤维细胞的间质细胞。其他研究者曾报道可从4至8周龄小鼠中成功分离食管成纤维细胞8。

与结肠肌成纤维细胞的培养不同，在培养小鼠肌成纤维细胞时，只要在培养基中添加抗生素，污染通常较少见。由于培养物来源于新生小鼠，限制因素在于组织体积较小，难以完整剥离肌层。相比之下，在人食管中，肌层与黏膜肌层易于区分并可顺利分离。无论是来源于小鼠还是人食管的培养物，所采用的酶消化及培养条件均不利于免疫细胞或上皮细胞的生长。尽管在培养基中使用了抗生素，人切除标本仍容易受到细菌污染，可能是因为处理的组织量较大。采用标准的组织培养技术并严格灭菌手术器械，可降低污染风险。<...

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披露

本研究由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 K08CA153036-01A1（AS）、美国胃肠病学会-通用磨坊贝尔健康与营养研究所肠道生理与健康研究学者奖（AS）以及赖特基金会试点项目奖（AS）资助。

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织培养试剂
HBSSSigma AldrichH6648
DispaseGIBCO, Invitrogen17105-041
Collagenase XISigma-AldrichC9407
DMEMGIBCO, Invitrogen11965-092
山梨醇Sigma-AldrichS1876
FBSSigma-AldrichF42442
转铁蛋白Roche10-652-202-001
胰蛋白酶/EDTACorning25-052-Cl
表皮生长因子Sigma-AldrichE9644
免疫染色试剂
山羊血清Sigma AldrichG9023
抗 α-SMA 小鼠单克隆抗体 abcamab7817
抗波形蛋白兔多克隆抗体abcamab45939
Cy2 标记的山羊抗兔二抗Jackson ImmunoResearch111-225-144
DAPISigma-AldrichD8417
CD31-eFluor 450 偶联物eBioscience48-0319-41
CD90-APC 偶联物eBioscience17-0909-41
Annexin V 和 7AADBD Pharmigen559763
CD16/CD32 封闭用小鼠 Fc 阻断剂BD Pharmigen2136662
设备
5 ml 离心管Eppendorf30108310
倒置显微镜MoticAE31
生物安全柜和培养箱Nuairehttp://www.nuaire.com/products/
4 孔板Thermo Scientific177437
冷冻离心机Eppendorf5810R
Olympus 真空驱动过滤系统Genesee Scientific25-227
荧光显微镜NikonEclipse TE300
6 孔板Corning3516
T25 培养瓶TRP90026
T75 培养瓶Corning43064
解剖剪刀
解剖镊
单头棉签Kendall540500
软件
Metamorph 软件 (Molecular Devices)Molecular Devices
FACSCaliburBD Bioscience
FACSVerseBD Bioscience

参考文献

  1. Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
  2. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
  3. Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
  4. Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
  5. Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
  6. Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
  7. Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
  8. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  9. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  10. Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).

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