从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

摘要

我们介绍一种用于培养具有肌成纤维细胞表型的小鼠和人食管间质细胞原代培养物的实验方案。培养的细胞呈梭形形态，表达α-SMA和波形蛋白（vimentin），且不表达上皮细胞、造血细胞和内皮细胞的表面标志物。经鉴定的间质细胞可用于上皮-间质相互作用的功能研究。

摘要

通过酶消化法获取小鼠和人类食管肌成纤维细胞。取新生小鼠（8–12日龄）食管组织，切碎、洗涤后，用胶原酶和分散酶消化25分钟。人类食管切除标本去除固有肌层和外膜后，将剩余黏膜组织切碎，并用胶原酶和分散酶消化长达6小时。培养所得细胞表达α-SMA和波形蛋白，对结蛋白呈弱表达或不表达。培养条件不利于上皮细胞、造血细胞或内皮细胞生长。通过流式细胞术检测潜在污染的造血细胞和内皮细胞表面标志物的表达，进一步确认培养细胞的纯度。该方法操作简便，可稳定获得非造血、非内皮的间质细胞。该技术的局限性源于分子生物学研究中使用原代培养细胞所固有的问题。 即，不同小鼠或人类个体间建立的培养体系所不可避免的变异性。然而，原代培养更能真实反映 体内 与细胞系相比具有更接近生理状态的优势。这些方法还使研究人员能够从不同的临床和实验条件下分离并培养间质细胞，从而实现组间比较。经鉴定的食管间质细胞还可用于功能研究，以探讨食管疾病中的上皮-间质相互作用。

引言

上皮-间质相互作用参与调控多种胃肠道功能，包括黏膜再生、修复、纤维化以及癌变过程^1,2。这些相互作用在小肠和结肠中研究最为深入，可能在食管黏膜疾病中也发挥类似作用³。已发现一类称为肌成纤维细胞的肠道和结肠间质细胞亚群，可介导组织损伤、炎症及修复过程^4,5。在远端胃肠道中，这些纺锤形细胞位于上皮与固有层交界处的基底膜旁，其表型定义为α-SMA和波形蛋白阳性，广谱细胞角蛋白阴性，且弱阳性或结蛋白阴性⁵。

食管间质在细胞或分子水平上尚未得到充分表征。我们在小鼠食管中的研究已证实食管间质中存在α-SMA和波形蛋白（vimentin）阳性细胞，这些细胞偶尔位于复层鳞状上皮下方⁶。上皮-间质相互作用已被认为参与了食管黏膜疾病的发生，例如胃-食管反流介导的损伤⁶和嗜酸性粒细胞性食管炎³。纤维化性狭窄也是食管损伤的已知并发症，间质细胞被认为参与了胃肠道纤维化的发病机制。分离这些细胞将有助于开展必要的研究，以探究异常的信号通路。

本投稿提供了建立α-SMA阳性、波形蛋白（vimentin）阳性肌成纤维细胞原代培养所必需的技术，从而有助于填补关于介导这些相互作用的信号通路的知识空白。作者已成功应用该技术建立小鼠结肠肌成纤维细胞原代培养体系⁷，并进一步优化用于建立小鼠<....

方案

动物实验方案、研究的原理和目的已提交并获得南加州大学机构动物护理和使用委员会的批准。

从匿名的人类食管切除标本建立原代培养物的方案已获得南加州大学机构审查委员会的批准。

1. 获取小鼠或人类食管

1. 获取小鼠食管：
   1. 使用2%异氟烷吸入过量麻醉处死8至12日龄小鼠，随后进行颈椎脱位。
   2. 将动物仰卧固定，并用70%乙醇润湿腹侧表面。用镊子夹住尿道口前方的皮肤并提起，使用标准直手术剪沿腹中线从尿道口剪至下颌。注意仅剪开皮肤。
   3. 从尿道口沿两侧向下至膝部做切口，形成倒置的“Y”形。再沿动物两侧肋骨 cage 做切口。
   4. 小心将两侧皮肤从下方的腹膜和肋骨 cage 上剥离，并向两侧翻开。检查覆盖胸腔的肋骨 cage 及覆盖腹腔的腹膜。
      1. 用镊子提起腹膜，剪开至横膈膜和肋骨 cage，剪刀尖朝上，以防损伤腹腔内容物。轻轻提起肝脏左叶，暴露下方的胃、食管-胃交界处及食管的腹段。
   5. 使用高压灭菌的手术剪沿中线剪开胸骨和肋骨 cage，直至颈环。剪刀尖朝上，以防损伤胸腔内容物。将肋骨 cage 向两侧拉开，充分暴露胸腔内容物。
   6. 轻柔移除心脏和两叶肺组织，用棉签吸除多余血液。胸段食管是一条细长而柔韧的管道，....

结果

采用机械法和酶消化法分离的食管间质细胞最初接种并培养于6孔板中。接种后数小时内，通过倒置显微镜观察可见混合细胞悬液松散地贴附于培养板底部（图1A）。在接下来的24小时内，可见从混合细胞悬液中长出的梭形细胞牢固贴附于培养板底部（图1B）。这些出芽状细胞在5天内可覆盖整个孔板区域，并可成功传代，且至少在15次传代过程中保持形态稳定。在低密度（图1C）以及接近融合状态时（图1D）均可观察到梭形贴壁细胞。

在培养皿中培养的食管间质细胞原代培养物的免疫染色显示，肌成纤维细胞细胞骨架标志物 α-SMA 和波形蛋白表达丰富（图2），结蛋白表达微弱，细胞角蛋白则无表达。

可通过检测造血细胞和内皮细胞表面标志物来进一步评估食管肌成纤维细胞原代培养物的细胞纯度。首先确定小鼠食管间质细胞原代培养物的前向散射和侧向散射信号，随后对活细胞进行设门并分析其细胞表面蛋白（图.......

讨论

使用小鼠或人类组织进行原代培养的建系技术总体相似，仅需根据组织大小调整剪切和消化时间。我们使用小鼠组织的经验表明，采用上述方法能够稳定成功地建立原代培养体系。该实验方案中的关键步骤包括手术器械的灭菌以及严格遵循组织培养的标准无菌操作技术。小鼠的年龄也是一个关键因素。8至12日龄的新生小鼠 consistently 能够成功获得原代培养物。从未能成功建立来自更年轻新生小鼠的间质细胞。目前仍在尝试从较年长的小鼠中建立类似肌成纤维细胞的间质细胞。其他研究者曾报道可从4至8周龄小鼠中成功分离食管成纤维细胞⁸。

与结肠肌成纤维细胞的培养不同，在培养小鼠肌成纤维细胞时，只要在培养基中添加抗生素，污染通常较少见。由于培养物来源于新生小鼠，限制因素在于组织体积较小，难以完整剥离肌层。相比之下，在人食管中，肌层与黏膜肌层易于区分并可顺利分离。无论是来源于小鼠还是人食管的培养物，所采用的酶消化及培养条件均不利于免疫细胞或上皮细胞的生长。尽管在培养基中使用了抗生素，人切除标本仍容易受到细菌污染，可能是因为处理的组织量较大。采用标准的组织培养技术并严格灭菌手术器械，可降低污染风险。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织培养试剂
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
山梨醇	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
转铁蛋白	Roche	10-652-202-001
胰蛋白酶/EDTA	Corning	25-052-Cl
表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E9644
免疫染色试剂
山羊血清	Sigma Aldrich	G9023
抗 α-SMA 小鼠单克隆抗体	abcam	ab7817
抗波形蛋白兔多克隆抗体	abcam	ab45939
Cy2 标记的山羊抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31-eFluor 450 偶联物	eBioscience	48-0319-41
CD90-APC 偶联物	eBioscience	17-0909-41
Annexin V 和 7AAD	BD Pharmigen	559763
CD16/CD32 封闭用小鼠 Fc 阻断剂	BD Pharmigen	2136662
设备
5 ml 离心管	Eppendorf	30108310
倒置显微镜	Motic	AE31
生物安全柜和培养箱	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4 孔板	Thermo Scientific	177437
冷冻离心机	Eppendorf	5810R
Olympus 真空驱动过滤系统	Genesee Scientific	25-227
荧光显微镜	Nikon	Eclipse TE300
6 孔板	Corning	3516
T25 培养瓶	TRP	90026
T75 培养瓶	Corning	43064
解剖剪刀
解剖镊
单头棉签	Kendall	540500
软件
Metamorph 软件 (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCalibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience