巨噬细胞是参与宿主致病性的关键细胞。巨噬细胞表现出表型和功能上的多样性，可通过蛋白质组学分析进行分析和检测。本文介绍了如何对分化为M1或M2表型的人原代巨噬细胞进行二维电泳。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
二维（2D）电泳实验方案的目标是展示如何分析人源培养巨噬细胞的表型。巨噬细胞在多种病理过程中发挥关键作用，包括炎症性疾病、免疫相关疾病和感染性疾病。本方案中，我们使用人单核细胞来源的原代巨噬细胞，这些细胞可分化为M1型（促炎性）或M2型（抗炎性）表型。 体外 该模型可用于研究M1和M2型巨噬细胞的生物学活性，也适用于蛋白质组学研究。蛋白质组学技术有助于比较M1与M2型巨噬细胞在宿主致病过程中的表型及行为差异。二维凝胶电泳是一种强大的蛋白质组学技术，可同时对大量蛋白质或多肽进行图谱分析。本文描述了采用荧光染料的二维电泳实验方案，即二维差异凝胶电泳（DIGE）。在分离前，M1和M2型巨噬细胞的蛋白质首先用氰基染料标记，随后根据其等电点在第一维进行等电聚焦分离，再根据分子质量在第二维进行分离。分离后的蛋白质或多肽斑点可用于检测蛋白质或多肽表达水平的差异。本文所述的蛋白质组学方法可用于研究巨噬细胞蛋白质在多种疾病状态（如宿主致病性或微生物毒素作用）下的变化。
引言
巨噬细胞是具有异质性和可塑性的细胞，能够获得不同的功能表型。 在体内， 这些细胞可响应多种微环境信号，例如微生物产物和细胞因子， 等等.1. 体外巨噬细胞的促炎表型（M1）可由脂多糖（LPS）诱导，而抗炎表型（M2）则可由白细胞介素-4（IL-4）等细胞因子诱导。此外，在特定信号刺激下，巨噬细胞可在活化的M1表型与M2表型之间相互转化。2.
根据表型的不同，巨噬细胞具有不同的功能。M1型巨噬细胞可产生促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子α（TNF-α）），以杀灭微生物或肿瘤细胞3。相比之下，M2型巨噬细胞通过产生抗炎因子（如TGF-β）来抑制炎症反应，参与伤口愈合和纤维化等过程3,4。
采用先前描述的方法5，通过Ficoll密度梯度离心法从健康供体的人外周血中分离单个核细胞，该技术改编自Boyum6。巨噬细胞在体外培养6天后可分化为M1或M2表型7。
在不同可控刺激（如宿主致病性或微生物毒素）条件下，分析两种亚型巨噬细胞之间的蛋白质表达或蛋白质变化，将有助于阐明促炎性和抗炎性巨噬细胞的功能特性。
蛋白质组学是直接监测在不同刺激条件下人源培养巨噬细胞中特异性上调或下调蛋白质的独特工具。荧光染料已解决了双向凝胶电泳的一些局限性，例如灵敏度低和图像分析困难8。与作用于赖氨酸残基的染料相比，作用于半胱氨酸残基的染料提高了检测灵敏度9。在之前的研究中，我们证明了与传统的银染双向电泳11相比，DIGE饱和标记技术在分析微量样品方面具有显著优势10。该技术有助于快速分析两种巨噬细胞亚型之间，或同一亚型中未经处理与经处理巨噬细胞之间的蛋白质修饰差异。
该蛋白质组学技术的优势在于，通过分析二维凝胶12，可获得蛋白质分子大小及翻译后修饰的信息。需要注意的是，该技术通量较低，限制了可分析样本的数量。近年来已有综述指出，基于质谱的高通量检测方法的开发13可改善这一局限。
本文介绍了如何从培养的巨噬细胞中提取蛋白质，进而进行二维差异凝胶电泳（2D DIGE）分析，包括电泳、等电聚焦和SDS-PAGE等步骤，并提供了有关适当二维分析软件应用价值的信息。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案遵循本机构人类研究伦理委员会的指导原则。健康人类供体的血沉棕黄层样本由法国里尔地区输血中心提供。来自血沉棕黄层的样本已申报为法国国家健康与医学研究院（Inserm）收藏样本（编号°DC2010-1209
1. 材料与培养基制备
- 将10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）用无菌蒸馏水稀释，配制成1倍浓度的PBS。
- 配制RPMI 1640培养基，分别添加庆大霉素（40 μg/ml）和L-谷氨酰胺（2 mM），并选择是否添加10%混合人血清。
2. 单核细胞来源巨噬细胞（MDM）的原代培养
- 用1×PBS稀释25 ml的血沉棕黄层，小心地将其加至Ficoll/leucosep管中，在室温下以1,600 × g离心20分钟。
- 收集界面处的单核细胞至新离心管中。用含0.1%乙二胺四乙酸（EDTA）的10 ml 1×PBS洗涤3次，每次分别以1,000 × g、370 × g和160 × g离心10分钟；随后再用1×PBS单独洗涤一次，以160 × g离心10分钟。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml无血清的RPMI-1640培养基中，并以每皿1 × 106个细胞的密度接种至35 mm培养皿中。
- 在培养箱中静置沉降90分钟后，弃去含有非贴壁细胞的上清液。用1 ml PBS对由单核细胞组成的贴壁细胞洗涤3次，然后向此前无血清的细胞中加入1 ml含10%（v/v）人血清的新鲜培养基。
- 培养6天后，为诱导产生替代性活化的巨噬细胞（M2），加入重组人IL-4（15 ng/ml），继续维持培养6天。然后在第12天用脂多糖（100 ng/ml）处理已分化的巨噬细胞4小时，以获得M1型巨噬细胞。
3. 用于二维电泳的M1和M2巨噬细胞蛋白质提取
- 用 25 mM Tris（pH 7.4）洗涤巨噬细胞三次，并用含有 30 mM Tris（pH 8）、4% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）、2 M 硫脲和 7 M 尿素的缓冲液刮取细胞。
- 在冰上使用适用于 1.5 ml 微量离心管的混合器裂解细胞 5 分钟，并于 -20 °C 保存。
- 使用商用 Bradford 试剂测定蛋白质浓度。将蛋白质分装为每份 100 µl，于 -20 °C 保存直至使用。
4. 等电聚焦电泳
注意：所有标记操作均需在避光条件下进行。
- 将每份样品（M1 和 M2 巨噬细胞）用裂解缓冲液调整至 9 μl，加入终浓度为 2 mM 的三(2-羧乙基)膦（TCEP），在 37 °C 下还原 1 小时，每份样品含蛋白 5 µg。
- 向 M1 提取物和 M2 巯基反应性染料提取物中分别加入浓度为 0.8 nM/μg 蛋白的花青素 3（Cy3）；向 M1 和 M2 提取物中分别加入浓度为 0.8 nM/μg 蛋白的花青素 5（Cy5），在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 加入等体积含有 7 M 尿素、2 M 硫脲、4% CHAPS、130 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 2% pharmalytes 的上样缓冲液以终止反应。
- 将 Cy3 标记的 M1 样品与 Cy5 标记的 M2 样品混合为一组，同时将 Cy3 标记的 M2 样品与 Cy5 标记的 M1 样品混合为另一组。
- 在等电聚焦（IEF）电泳系统中，将标记并混合后的样品 450 μl 溶于含 7 M 尿素、2 M 硫脲和 4% CHAPS 的缓冲液中，用于水化固相 pH 梯度（IPG）胶条（240 mm，pH 3–10 线性梯度），静置 24 小时，不施加电流。
- 先在 300 伏（V）下聚焦 3 小时，然后梯度升至 1,000 V 持续 6 小时，再梯度升至 8,000 V 持续 3 小时，最后在 8,000 V 下维持 3 小时完成聚焦。
5. 第二维
注意：所有电泳操作均需在避光条件下进行。
- 将IPG胶条在含有0.1 mM Tris-HCl（pH 8）、6 M尿素、2%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和30%（v/v）甘油的平衡缓冲液中孵育10分钟。
- 将平衡后的IPG胶条转移至用于第二向（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE））的12.5% PAGE凝胶上，并用低熔点琼脂糖密封。
- 使用Ettan-Daltsix系统在20 °C下进行电泳，先以70 V恒压过夜，随后升至300 V，直至溴酚蓝前沿迁移至凝胶底部。
6. 图像采集与生物信息学分析
- 使用 DIGE 成像仪扫描夹在两块低荧光玻璃板之间制备的凝胶，Cy3 的激发/发射波长为 532/580 nm，Cy5 为 633/670 nm，获得像素尺寸为 100 μm 的图像。
- 使用商业软件进行图像分析，具体方法如前所述12。
- 计算并归一化每幅图像中的蛋白点体积。将每个检测到的蛋白点的归一化体积表示为凝胶中所有蛋白点总体积的占比。
- 通过比较两组（M1 和 M2）之间的归一化蛋白点体积值，分析不同类型巨噬细胞蛋白点体积的差异。若蛋白点体积变化达到 1.5 倍及以上（p <0.05，单因素方差分析），则认为差异具有显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了进行适当的差异蛋白质组学分析，应验证待分析样品的处理过程。
在本示例中，巨噬细胞的细胞培养质量对于形态学和分子学方面的研究是必需的，这一点已在先前发表的研究中证实5。通过相差显微镜观察单核细胞向巨噬细胞的分化过程以及培养物的均一性。图1展示了M1和M2型巨噬细胞原代培养的示例。如图所示，我们通过低倍（图1A, C）和高倍（图1B, D）相差显微镜观察，验证了培养第12天时M1（图1A, B）和M2（图1C, D）亚型巨噬细胞的均一性。显然，在原代培养12天后，M1和M2型巨噬细胞呈现出不同的形态特征。如先前研究所述，我们通过RT-PCR检测到M1型巨噬细胞中存在编码TNF和IL1B的mRNA，而M2型巨噬细胞中存在MRC1和CCL18的mRNA14（未展示）。
仅使用同时满足上...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方案详细介绍了分析不同刺激因素对两种巨噬细胞亚型——M1型（促炎性）和M2型（抗炎性）——影响的方法。M1和M2型巨噬细胞的原代培养物是通过单核细胞分化获得的，方法如先前文献7所报道。
二维 DIGE 凝胶电泳实验需要使用特殊材料和设备，例如用于等电聚焦的 IEF 电泳槽、用于 SDS-PAGE 的低荧光培养板（以便在 Cy3 和 Cy5 的激发/发射波长下对凝胶进行两次扫描）、荧光扫描仪以及二维分析软件。该方法需要一定的操作经验和手工技巧。
要成功进行二维凝胶电泳，有几个关键步骤：1）蛋白质的提取必须在无任何污染物（如白蛋白或角蛋白）的环境中进行，这一点至关重要；2）标记和电泳过程需在避光条件下操作。在裂解缓冲液中进行蛋白质还原时，应避免使用DTT，因为该技术要求在使用氰染料对蛋白质进行标记前，必须采用TCEP来还原蛋白质中的肽链二硫键。
这种灵敏的二维 DIGE 技术可用于评估巨噬细胞在不同环境条件下，根据蛋白质亚型的有无，其蛋白点的差异...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
不存在声明的利益冲突。
致谢
本工作由法国国家健康与医学研究院（Inserm）资助。Marion Bouvet 是法国研究与技术部的博士后研究员。Annie Turkieh 是获得欧盟第七框架计划 HOMAGE 项目（305507）资助的博士后研究员。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-谷氨酰胺-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| 庆大霉素 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| 人血清 | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6孔PRIMARIA培养板 | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| 吉姆萨 | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | 研究用有机试剂 | 3.00E+01 | |
| 过滤 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml 量筒 | 康宁 | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford 试剂 | 伯乐（Bio-Rad） | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-反应性染料 | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG胶条 3-10 24 cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF 细胞 | 伯乐（Bio-Rad） | 165-4000 | |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix 系统 | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager 扫描仪 | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | 非线性动力学 | ||
| 50 ml 离心管 | 任何供应商 | n/a | |
| 15 ml 离心管 | 任何供应商 | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| 尿ée | Merk | 108484-500 | |
| 硫脲ée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | 伯乐（Bio-Rad） | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| 丙烯酰胺 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 二维胶染色前纯化 | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| 暗éthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| 电极灯芯 | Bio-Rad | 165-4071 |
参考文献
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
