方法文章

对于波长和红/近红外光治疗对氧化应激强度的范围影响的评估方法在体外

DOI：

10.3791/52221

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2015年3月21日

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1Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Animal Biology, The University of Western Australia, 2School of Animal Biology and The Oceans Institute, The University of Western Australia, 3Experimental and Regenerative Neurosciences, School of Anatomy, Physiology and Human Biology, The University of Western Australia

本文内容

摘要

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非相干氙光通过窄带干涉和中性密度滤光片，将不同波长和强度的光传递到培养细胞。该方案用于评估红/近红外光疗法对体外反应性物质产生的影响：使用测试参数未观察到任何影响。

摘要

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红/近红外光疗法（R / NIR-LT），通过激光或发光二极管（LED）的递送，可能通过减少氧化应激改善功能和形态学效果的范围内的中枢神经系统损伤的体内 ，的。然而，在氧化应激的R / NIR-LT的作用已被证明取决于波长或辐射的强度而变化。在比较治疗参数的研究缺乏，由于缺乏能够提供多个波长或强度，适用于通过量高的体外优化研究商用设备。这个协议描述了用于递送光的技术在一定范围的波长和强度，以优化所需的一个给定的损伤模型治疗剂量。我们假设，提供光的方法，其中波长和强度参数可以很容易地被改变，可以促进确定的R / NIR-LT的最佳剂量的减少活性氧（ROS）的体外。

非相干氙光通过窄带干涉滤光片过滤，以提供不同的波长（440，550，670的中心波长和810纳米）和能量密度（8.5×10 -3至3.8×10 -1焦耳/ cm 2）的光的向培养的细胞中。从该装置的光输出被校准以发射治疗相关，等于量子剂量的光的每个波长。检测反应性物质在谷氨酸强调与光处理的细胞，用DCFH-DA和H 2 O 2的敏感的荧光染料。

我们成功地在一个范围内的生理学和治疗相关的波长和强度的光传递，以暴露于谷氨酸作为CNS损伤模型的培养细胞。而R / NIR-LT在当前研究中使用没有施加由培养的细胞产生的活性氧的效果的能量密度，轻的递送方法也适用于其他SYSTEMS包括分离线粒体或多种生理上相关的器官切片培养模型，并且可以用来评估的范围内的氧化代谢的结果的措施的效果。

引言

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活性氧（ROS）的所需要的各种信号转导途径和细胞代谢的正常反应，包括那些神经保护1。然而，当内源性抗氧化机制无法控制ROS的产生，细胞可能会屈从于氧化应激2,3。损伤后的中枢神经系统，在ROS和氧化应激的存在相关联的增加被认为在损伤4,5的进展显着的作用。尽管用于衰减已评估氧 ​​化应激策略的广泛的数目，目前有用于以下神经外伤6衰减ROS产生和相关的氧化应激在临床使用中没有完全有效，临床相关抗氧化剂的策略。因此氧化应激的衰减仍是治疗介入7的一个重要目标。

后续的改进荷兰国际集团的R / NIR-LT已经报道了在广泛的伤害和疾病，包括减少心肌梗死面积，糖尿病期间肾和肝的并发症，视网膜变性，中枢神经系统损伤和中风8，或许通过减少氧化应激。特别是关于CNS损伤，670nm处光的功效的临床前研究已经显示在视网膜变性9-11，脊髓损伤12，神经元死亡13的模型良好的效果。临床试验已经进行了干性年龄相关性黄斑变性和目前正在进行对于中风14，但是这些试验的结果不出现希望的，或许是由于未能采用有效的治疗参数15。因此，R / NIR-LT并没有被广泛采用作为在神经外伤正常临床实践的一部分，尽管是一种简单的施用，非侵入性的和相对便宜的治疗方法。障碍的临床翻....

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方案

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1.光学校正：测量光输出

  1. 为了制备所述光递送装置，连接宽带光源（ 例如 ，氙或钨灯），以适当的电源。定位在光源的前面的准直透镜，以产生的光的准直光束。通过液体热过滤通过的光以从光束去除大部分的热量。根据不同的应用，聚焦准直光束上的入口孔的液体光导的，这提供了更灵活的递送的光的（ 例如 ，到一个培养箱）。
  2. 在液体光导的另一端，定位一个第二准直透镜，然后对干扰和中性密度滤光片的支架。检查这种安排产生光所需要的波段和强度的均匀照明的地方。
    注意：在光导和试样面的端部之间的距离可能需要根据改变必须被照亮，但面积记住作为从光导增大端部的距离，光的强度将减小。在本研究中，这个距离​​是14厘米并产生一个光束截面均匀地照射一个3x3阱区域上的96孔平板。
  3. 保证从灯和相关的光学组件，杂散光无法到达的试样。
  4. 放水冷却器用于液体热过滤，并确保存在通过过滤器夹套交换的水。开启灯电源并等待至少5分钟，对宽带光源来稳定。注意：使用水冷却器的需要，以防止过度加热的装置。
  5. 选择的窄带干扰滤波器（通常由它们的中心波长，峰值透射率和半峰全宽（FWHM）带宽描述），以产生照明的期望的波段。注意：在目前的研究中使用的窄带干扰滤波器分别为442纳米，550纳米，671纳米和810纳米。
  6. 测量由灯在平面，其中试样是在治疗过程中被定位产生的光。使用连接到一个合适的分光校准的辐射探测器（余弦集电极）测量光，根据制造商的说明使....

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结果

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使用中性密度滤光片，以照射细胞的范围内的能量密度包含先前证明是有益的体内 （0.3焦耳/厘米2）20 670nm处的光的剂量的光在670nm处的波长传送的输出进行校准。作为在光源增加前中性密度滤光片的数量，强度（W /米2）降低，从而允许更少的光传递到目标区域。表1给出了670nm处的光的从装有一个波长滤光器，光源产生的校正数据，并包括用于ND过滤器的数量和光的作为结果而产生的强度，在从光输出中所描述的距离。注量，或670nm处的光（焦耳/厘米2）的剂量，由下式计算：[剂量（焦耳/厘米2）=（光强度（W /米2）/ 10,000）×时间（s）]，其中治疗时间为180秒。

的ND滤镜数量从光输出距离（cm） 强度（W /平方公尺） 剂量（J /平方公分）
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讨论

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我们已经成功地适应了精确和校准的光传输系统，以提供一种机制，用于对R / NIR-LT 在体外优化的研究。的R波长和强度的参数/ NIR-LT能够被准确有效地操纵使用这个系统。我们建立了光治疗的细胞并没有导致细胞死亡，尽管ROS没有减少在输送的波长和剂量，在测试的细胞类型。当前系统在670nm处（20.11W /米2）实现的最大强度在过量照射的外显率的先前公布的措施到大鼠脑，其中1.17瓦/米2达到视神经和0.3W的腹面/ m 2的到达脑部的情况下的腹面。当递送30分钟后，通过体内视神经细胞接受的剂量，因此0.054 - 0.31焦耳/厘米2。在目前的研究中递送670nm处的光的剂量（达0.38J / cm 2）的，因此包括那些在我们以前的体内研究接收细胞。

最广泛接受的R / NIR-LT功效的理论是，一个photoacceptor基于系统18的，因此有必要确保具有不同波长的经处.......

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披露

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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这项工作得到了神经创伤研究计划（西澳大利亚）的支持。该项目由 Road Trauma Trust Account 资助，但不反映道路安全委员会的观点或建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
OxiSelect 细胞内 ROS 检测试剂盒（绿色荧光）Cell BiolabsSTA-342
Amplex UltraRed 试剂分子探针A36006
300 瓦氙弧灯Newport Corporation6258非常强的光源，不要直视灯。确保在灯打开时有足够的冷却
USB4000-FL 荧光光谱仪海洋光学
CC-3-UV 余弦校正器，用于发射收集海洋光学
200μm 直径 石英 光纤海洋光学
SpectraSuite 光谱平台海洋光学
2300 EnSpire 多功能读板机Perkin Elmer
Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒Thermo Scientific23225
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1急性毒性，处理时戴手套。
L-谷氨酸单钠盐水合Sigma-Aldrich142-47-2（无水）
嗜铬细胞瘤大鼠肾上腺髓质 （PC12） 细胞美国典型培养保藏中心CRL-2522
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI1640） 媒体Gibco11875-119
胎牛血清，经认证，热灭活，美国原产Gibco10082-147暖到 37 度;C 水浴 使用前
血清，新西兰原产Gibco16050-122温至 37 °C;C 在水浴中使用前
GlutaMAX 添加剂Gibco35050-061温热至 37 °C;C 水浴中，使用前
100 mM 丙酮酸钠Gibco11360-070温热至 37 °C;C 使用前在水浴中
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）Gibco15140-122温热至 37 °C;C 水浴中，使用前
100X MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140-050温热至 37 °C;C 使用前在水浴中 Retinal
Muller （rMC1） 细胞大学圣地亚哥分校
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）Gibco11965-118温热至 37 °C 水浴 使用前
75 cm2 培养瓶BD BiosciencesB4-BE-353136
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-Aldrich25988-63-0等分试样并储存在 -20 °C;C
Hank 平衡盐溶液 （HBSS）Gibco14025-134温热至 37 °C;C 水浴中 使用前
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Gibco10010-049温至 37 °C;C 水浴中 使用前
层粘连蛋白小鼠蛋白，天然Gibco23017-015分装并储存在 -20 °C;C
1X Neurobasal 培养基Gibco21103-049温暖至 37 °C;C 水浴 使用前
盼蓝溶液，0.4%Gibco15250-061
165U 木瓜蛋白酶Worthington
L-半胱氨酸Sigma-AldrichW326305
康宁 96 孔板，透明底，黑色康宁CLS3603-48EA
Costar 透明聚苯乙烯 96 孔板 未处理;井形：圆形;无菌的。Costar07-200-103
跷跷板摇杆标准实验室设备
离心机标准实验室设备
中性密度滤纸 （0.3）THORLABS
442 nm 带通滤光片THORLABSFL441.6-10
550 nm 带通滤光片THORLABSFB550-10
670 nm 带通滤光片THORLABSFB670-10
810 nm 带通滤光片THORLABSFB810-10e
未镶嵌 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （0.1）THORLABSNE01B
未封装 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （0.2）THORLABSNE02B
未安装 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （0.3）THORLABSNE03B
未安装 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （0.5）THORLABSNE05B
未镶嵌 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （0.6）THORLABSNE06B
未封装 Ø25 mm 吸收性中性密度滤光片 （1.0）THORLABSNE10B
物 马， 加利福尼亚，台

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
  2. Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signalin....

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DCFH DA H2O2

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