非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片和中性密度滤光片，以向培养细胞递送不同波长和强度的光。该方案用于评估红光/近红外光治疗对活性物质生成的影响 体外：使用所测试的参数未观察到任何效应。
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摘要
摘要
红光/近红外光疗法（R/NIR-LT），通过激光或发光二极管（LED）递送，可改善多种中枢神经系统损伤的功能性和形态学结局 体内，可能通过减轻氧化应激发挥作用。然而，红光/近红外光疗法对氧化应激的影响因照射波长或强度的不同而有所差异。由于目前缺乏可商业获取的、能够提供多种波长或强度且适用于高通量研究的设备，针对不同治疗参数的比较研究仍然不足 体外 优化研究。本方案描述了一种可在多种波长和强度下递送光的方法，以优化特定损伤模型所需的治疗剂量。我们假设，一种能够便捷调节波长和强度参数的光递送方法，有助于确定用于降低活性氧（ROS）的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的最佳剂量 体外
非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片，以向培养细胞提供不同波长（中心波长分别为440、550、670和810 nm）和能量密度（8.5 × 10-3 至 3.8 × 10-1 J/cm2）的光照。该装置的光输出经过校准，确保在每个波长下释放具有治疗相关性的等量子剂量的光。采用DCFH-DA和对H2O2敏感的荧光染料，在经光照处理的谷氨酸应激细胞中检测活性物质的生成。
我们成功地将一系列在生理学和治疗学上具有相关性的波长和强度的光传递至暴露于谷氨酸（作为中枢神经系统损伤模型）的培养细胞。尽管本研究中使用的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的照射量并未对培养细胞产生的活性氧（ROS）产生影响，但该光传递方法可适用于其他系统，包括分离的线粒体或更具生理相关性的器官型脑片培养模型，并可用于评估对氧化代谢多种结局指标的影响。
引言
活性氧（ROS）在多种信号转导通路以及细胞代谢的正常反应中发挥重要作用，包括神经保护过程1。然而，当内源性抗氧化机制无法有效控制ROS的生成时，细胞可能遭受氧化应激的损害2,3。在中枢神经系统（CNS）损伤后，ROS水平升高及伴随的氧化应激被认为在继发性损伤进展中起着重要作用4,5。尽管已有大量策略被评估用于减轻氧化应激，但目前尚无完全有效且具有临床应用价值的抗氧化疗法可用于神经创伤后抑制ROS生成及相关氧化应激6。因此，减轻氧化应激仍是治疗干预的重要目标7。
已有报道称，红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）在多种损伤和疾病中具有改善作用，包括缩小心肌梗死面积、减轻糖尿病期间的肾和肝并发症、视网膜变性、中枢神经系统（CNS）损伤和脑卒中8，其机制可能与减轻氧化应激有关。特别针对中枢神经系统损伤，670 nm 光的临床前疗效研究已在视网膜变性9-11、脊髓损伤12和神经元死亡13模型中显示出良好效果。目前已有针对干性年龄相关性黄斑变性的临床试验，且针对脑卒中的临床试验正在进行中14，但这些试验的结果似乎并不乐观，可能是因为未能采用有效的治疗参数15。因此，尽管红光/近红外光疗法易于实施、无创且相对便宜，但尚未被广泛采纳为神经创伤常规临床实践的一部分。阻碍其临床转化的因素包括作用机制尚不明确，以及缺乏标准化的有效治疗方案16,17。当前关于光疗的文献显示，不同研究在照射光源（LED 或激光）、波长（例如，630、670、780、810、830、880、904 nm）、总剂量（单位面积照射的焦耳数）、持续时间（照射时间）、治疗时机（损伤前或损伤后）、治疗频率以及照射模式（脉冲或连续）等方面存在大量差异8。研究间治疗参数的不一致性导致结果难以比较，并加剧了人们对疗效的质疑16。
因此，显然需要对红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）进行优化，而细胞培养系统能够提供高通量筛选机制，用于比较多个变量。然而，目前市面上可提供的照明系统中，很少有能够对波长和强度进行充分灵活调控以开展此类优化实验的。市面上常见的LED设备通常无法提供多种波长或强度，导致研究者不得不使用来自不同制造商的多个LED装置，这些装置不仅在光强上可能存在差异，其发射光的波长光谱也可能不同。我们通过采用宽带氙灯光源，并结合窄带干涉滤光片进行过滤，从而产生一系列不同波长和能量密度的光，实现了对R/NIR-LT参数的精确、严密控制，解决了这一问题。
需要注意的是，治疗剂量的定义取决于与光受体（发色团）相互作用的光子数量，对于红光/近红外光治疗（R/NIR-LT），该光受体被认为是细胞色素 c 细胞色素氧化酶（COX） 18光子能量随波长而变化；这意味着在不同波长下相同能量剂量所包含的光子数量不同。因此，已对设备发出的光进行校准，使其在所选的各个测试波长下发射相同数量的光子。我们开发了一种系统，可用于向细胞递送不同波长和强度的红光/近红外光治疗（R/NIR-LT） 体外 并展示了测量在谷氨酸应激条件下递送的红光/近红外光疗（R/NIR-LT）对细胞活性氧（ROS）生成影响的能力。
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方案
1. 光学校准：测量光输出
- 准备光传递装置时，将宽带光源（例如，氙灯或钨灯）连接至适当的电源。在光源前方放置一个准直透镜，以产生准直光束。使光束通过液体热滤器，以去除光束中的大部分热量。根据具体应用，将准直光束聚焦到液体光导的入射孔径上，从而实现更灵活的光传递（例如，将光导入培养箱内）。
- 在液体光导的另一端，放置第二个准直透镜，随后安装干涉滤光片和中性密度滤光片的滤片架。检查该装置是否能产生所需波段和强度的均匀照明光斑。
注意：光导末端与样品平面之间的距离可能需要根据所需照明面积进行调整，但需注意，随着光导末端与样品距离的增加，光强度将下降。在本研究中，该距离为14 cm，所产生的光束横截面可均匀照亮96孔板上3×3个孔的区域。 - 确保来自光源及相关光学组件的杂散光无法到达样品。
- 开启液体热滤器的水冷机，并确保滤器夹套中有水流循环。开启光源电源，等待至少5分钟，使宽带光源达到稳定状态。注意：必须使用水冷机，以防止设备过热。
- 选择窄带干涉滤光片（通常以其中心波长、峰值透射率和半高全宽（FWHM）带宽来描述），以产生所需的照明波段。注意：本研究中使用的窄带干涉滤光片分别为442 nm、550 nm、671 nm和810 nm。
- 在处理过程中样品所处的平面上，测量光源产生的光。使用经校准的辐照度探头（余弦收集器）连接合适的光谱辐射计，并按照制造商说明使用专用软件进行测量。
- 使用中性密度滤光片调节光强度，直至达到所需输出。注意：在本研究中，通过每个干涉滤光片的光强度被调节至在四个处理波段下具有相等的光量子输出。由于光源输出可能发生变化，需定期检查校准状态。
注意：完成装置设置后，细胞即可进行光照处理。图1展示了本研究中所用光传递装置的示意图。
图1. 光照装置示意图。图中所示包括光源、带外壳的氙灯、准直透镜、水滤光器、入射光阑、液体光导、第二准直透镜、滤光片架、治疗支架和哑光黑卡。请注意，窄带波长和强度滤光片未显示。
2. 细胞准备
- 所述的近红外光疗法递送方法可应用于任何细胞类型 体外 模型系统；因此，以下细胞培养的描述为通用性描述，采用成熟的技术培养嗜铬细胞瘤（PC12）、Müller（rMC1）及原代混合视网膜细胞。
- 在进行光照处理和氧化应激检测的细胞接种之前，将永生化细胞培养于各自含有适当补充成分的生长培养基中（例如在T75培养瓶中加入FBS、抗生素等，培养至细胞融合度达到70-80%。
- 使用适用于待测细胞类型的相应方法，从T75培养瓶中分离永生化细胞 例如，胰蛋白酶。必要时，在将细胞接种至96孔检测板之前，用以下物质包被检测板孔： 10µg/ml 聚-L-赖氨酸孵育1小时（例如（适用于PC12细胞）或 10µg/ml 聚-L-赖氨酸孵育1小时，随后过夜孵育 10µg/ml 层粘连蛋白（laminin）例如，用于混合视网膜细胞。
- 离心细胞以适当收集例如，PC12细胞在405 × g下离心3分钟，或rMC1细胞在218 × g下离心10分钟，弃上清，加入8 ml相应的细胞培养基重悬。
- 若使用混合视网膜细胞，应按照既定方案，采用酶消化法（木瓜蛋白酶）从出生后0至5天（P0–5）的新生大鼠幼鼠中制备 19
- 使用血细胞计数板，排除0.4%（w/v）台盼蓝染料后计数活细胞数量。
- 调整细胞密度，使细胞在培养24或48小时后融合度达到约70-80%。（对于PC12细胞，接种密度为4.0 x 105 每毫升活细胞数，对于 rMC1 细胞为 2.5 × 105 每毫升活细胞数，对于混合视网膜细胞为 8 x 105 可存活细胞数/ml）。将细胞加入透明或黑色的96孔板（用于H2O2 或分别采用 DCFH-DA 法），在 100 µl 合适的生长培养基，将培养皿置于平坦表面静置 37°C，5% CO₂2 （或根据特定细胞类型选择合适的条件）培养至少24小时，以促进细胞贴壁。
- 在适当的96孔板中，用生长培养基培养细胞，直至细胞融合度达到70-80%（PC12和rMC1细胞培养24小时，混合视网膜细胞培养48小时）。
3. 向细胞添加谷氨酸应激物
- 在适当的完全生长培养基中配制 0–10 mM 的 L-谷氨酸单钠盐水合物应激剂浓度。
- 移除细胞培养基，用 PBS（PC12 细胞）或 HBSS（rMC1 和混合视网膜细胞）轻柔洗涤细胞 3 次。洗涤后，加入含谷氨酸的培养基，每孔总体积为 100 µl。
4. 光照治疗的首次剂量
- 在加入谷氨酸或选定的应激因子后，立即将细胞置于预设的光照射装置下，以所需的波长和强度进行光照处理。根据所使用的波长，通过已确定的中性密度滤光片组合调节光束的光量子输出量。
注意：在当前实验中，对细胞进行持续3分钟的光照处理，并将96孔板放置于37oC加热垫上以维持温度。处理时间可根据需要进行调整。- 在细胞下方放置一张哑光黑卡，以防止光线反射至96孔板中用于其他处理参数的相邻孔内。
- 若需延长处理时间，可添加25 mM Hepes缓冲液以维持细胞培养基的pH值；或更理想地，将装置及处理板置于CO2浓度控制在5% CO2的培养箱中，或根据特定细胞类型的最佳培养条件进行处理。
- 光照处理结束后，将细胞置于水平表面上，并在37°C和5% CO2（或适用于该细胞类型的最适条件）下继续孵育24小时。
注意：可根据需要，按照上述方法追加R/NIR-LT的给药次数。
5. 光处理的最终剂量及活性氧检测
- 在进行最后一轮光照处理之前，准备好用于活性氧（ROS）检测的试剂。配制50 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）、Triton X100，以及H2O2检测工作液（按1:2:97的比例混合10 mM H2O2检测试剂储备液、10 U/mL辣根过氧化物酶和50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0））。将DCFH-DA配制成适当培养基中的终浓度为100 µM的溶液。
注意：PC12细胞所用的DCFH-DA试剂使用RPMI培养基，rMC1细胞所用的DCFH-DA试剂使用DMEM培养基。需注意，市售检测试剂对特定活性氧的敏感性存在差异，应根据具体应用需求谨慎选择试剂，以获得所需信息。 - 按照步骤4.1–4.1.2所述对细胞进行光照处理。确保细胞接受设定的光通量和波长的光照。
- 光照处理结束后立即移除含谷氨酸的培养基，并用适当的缓冲液清洗两次（PC12细胞使用PBS，rMC1细胞使用HBSS）。随后按以下方法对细胞进行活性氧检测：
- H2O2检测：向每个孔中加入45 µl的50 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）和5 µl Triton X100。在摇床上轻轻振荡30秒，随后在37°C、5% CO2条件下孵育15分钟。每孔加入50 µl H2O2检测工作液，在室温下孵育30分钟。使用酶标仪检测荧光，激发波长为530 nm，发射波长为480 nm。
- DCF检测：向每个孔中加入100 µl浓度为100 µM的DCFH-DA溶液，在37°C、5% CO2条件下孵育30分钟。移除含100 µM DCFH-DA的培养基，并用适当的缓冲液（如上所述）清洗两次。向每孔加入90 µl缓冲液和10 µl Triton X100，在摇床上轻轻振荡30秒，随后在37°C条件下孵育15分钟。使用酶标仪检测DCF来源的荧光，激发波长为480 nm，发射波长为530 nm。
- 将活性氧检测结果相对于孔中残留细胞的蛋白浓度进行标准化表达。使用比色法蛋白定量试剂盒，根据制造商说明书测定蛋白浓度，并参照标准曲线计算出每孔的蛋白含量（mg蛋白）。
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结果
使用中性密度滤光片对波长为670 nm的光输出进行校准，以便用涵盖先前已证明有益的670 nm光剂量的一系列能量密度照射细胞 体内 (0.3 J/cm²)2) 20. 随着光源前方中性密度滤光片数量的增加，光强（W/m2）减小，导致更少的光到达目标区域。表1列出了配备波长滤光片的光源所产生的670 nm光的校准数据，包括所使用的中性密度滤光片（ND滤光片）数量、在指定距离下输出光的强度。光通量，即670 nm光的剂量（J/cm²）2），根据以下公式计算：[剂量（J/cm2) = （光强（W/m2) / 10,000) × 时间（s），其中处理时间为 180 s。
| 中性密度滤光片数量 | 距光源输出距离（cm） | 强度（W/m^2） | 剂量（J/cm^2） |
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讨论
我们已成功改进了一套精确且经过校准的光递送系统，为研究红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的优化机制提供了有效手段 体外. 该系统能够准确有效地调控红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的波长和强度参数。我们证实，尽管在所测试的细胞类型中，特定波长和剂量的光照处理未能降低活性氧（ROS）水平，但并未引起细胞死亡。当前系统在670 nm波长下达到的最大强度为20.11 W/m²。2) 超过了先前报道的大鼠脑组织中辐射穿透能力的测量值，其中 1.17 W/m2 到达视神经腹侧表面及0.3 W/m2 到达颅骨腹侧表面。当持续给药30分钟时，视神经细胞所接受的剂量 体内 因此为 0.054 – 0.31 J/cm2. 本研究中使用的670 nm光照剂量（最高达0.38 J/cm²）2因此涵盖了我们先前研究中细胞所接收到的那些信号 体内 研究.
目前被广泛接受的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）有效性理论是...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由神经创伤研究计划（西澳大利亚）资助。该项目通过道路创伤信托账户获得资金支持，但并不反映道路安全委员会的观点或建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞内活性氧检测试剂盒（绿色荧光） | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed 试剂 | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 瓦氙弧灯 | Newport Corporation | 6258 | 光源强度极高，切勿直视灯管。开启时确保灯具有足够的冷却条件 |
| USB4000-FL 荧光光谱仪 | Ocean Optics | ||
| 用于发射光收集的 CC-3-UV 余弦校正器 | Ocean Optics | ||
| 直径 200μm 石英光纤 | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite 光谱分析平台 | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire 多功能酶标仪 | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | 具有急性毒性，操作时需佩戴手套 |
| L-谷氨酸单钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | 142-47-2（无水） | |
| 嗜铬细胞瘤大鼠肾上腺髓质细胞（PC12 细胞） | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| 罗斯威尔公园纪念研究所培养基（RPMI1640） | Gibco | 11875-119 | |
| 胎牛血清，经认证，热灭活，美国来源 | Gibco | 10082-147 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 马血清，新西兰来源 | Gibco | 16050-122 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| GlutaMAX 补充剂 | Gibco | 35050-061 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 100 mM 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140-122 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 100X MEM 非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140-050 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 大鼠视网膜 Müller 细胞（rMC1 细胞） | 加州大学圣地亚哥分校 | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11965-118 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 75 cm2 培养瓶 | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | 分装后于 -20 °C 保存 |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 14025-134 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010-049 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 小鼠天然层粘连蛋白 | Gibco | 23017-015 | 分装后于 -20 °C 保存 |
| 1X 神经基础培养基 | Gibco | 21103-049 | 使用前在水浴中预热至 37 °C |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U 木瓜蛋白酶 | Worthington | ||
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 孔板，透明底，黑色 | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar 未处理透明聚苯乙烯 96 孔板；孔型：圆形；无菌 | Costar | 07-200-103 | |
| 往复式摇床 | 标准实验室设备 | ||
| 离心机 | 标准实验室设备 | ||
| 中性密度滤光纸（0.3） | THORLABS | ||
| 442 nm 带通滤光片 | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm 带通滤光片 | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm 带通滤光片 | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm 带通滤光片 | THORLABS | FB810-10e | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.1） | THORLABS | NE01B | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.2） | THORLABS | NE02B | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.3） | THORLABS | NE03B | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.5） | THORLABS | NE05B | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.6） | THORLABS | NE06B | |
| 未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（1.0） | THORLABS | NE10B |
参考文献
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257(2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828(2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002(2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
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