评估不同波长和强度的红光/近红外光疗法对氧化应激影响的方法 体外

摘要

非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片和中性密度滤光片，以向培养细胞递送不同波长和强度的光。该方案用于评估红光/近红外光治疗对活性物质生成的影响 体外：使用所测试的参数未观察到任何效应。

摘要

红光/近红外光疗法（R/NIR-LT），通过激光或发光二极管（LED）递送，可改善多种中枢神经系统损伤的功能性和形态学结局 体内，可能通过减轻氧化应激发挥作用。然而，红光/近红外光疗法对氧化应激的影响因照射波长或强度的不同而有所差异。由于目前缺乏可商业获取的、能够提供多种波长或强度且适用于高通量研究的设备，针对不同治疗参数的比较研究仍然不足 体外 优化研究。本方案描述了一种可在多种波长和强度下递送光的方法，以优化特定损伤模型所需的治疗剂量。我们假设，一种能够便捷调节波长和强度参数的光递送方法，有助于确定用于降低活性氧（ROS）的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的最佳剂量 体外

非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片，以向培养细胞提供不同波长（中心波长分别为440、550、670和810 nm）和能量密度（8.5 × 10^-3 至 3.8 × 10^-1 J/cm²）的光照。该装置的光输出经过校准，确保在每个波长下释放具有治疗相关性的等量子剂量的光。采用DCFH-DA和对H₂O₂敏感的荧光染料，在经光照处理的谷氨酸应激细胞中检测活性物质的生成。 

我们成功地将一系列在生理学和治疗学上具有相关性的波长和强度的光传递至暴露于谷氨酸（作为中枢神经系统损伤模型）的培养细胞。尽管本研究中使用的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的照射量并未对培养细胞产生的活性氧（ROS）产生影响，但该光传递方法可适用于其他系统，包括分离的线粒体或更具生理相关性的器官型脑片培养模型，并可用于评估对氧化代谢多种结局指标的影响。

引言

活性氧（ROS）在多种信号转导通路以及细胞代谢的正常反应中发挥重要作用，包括神经保护过程¹。然而，当内源性抗氧化机制无法有效控制ROS的生成时，细胞可能遭受氧化应激的损害^2,3。在中枢神经系统（CNS）损伤后，ROS水平升高及伴随的氧化应激被认为在继发性损伤进展中起着重要作用^4,5。尽管已有大量策略被评估用于减轻氧化应激，但目前尚无完全有效且具有临床应用价值的抗氧化疗法可用于神经创伤后抑制ROS生成及相关氧化应激⁶。因此，减轻氧化应激仍是治疗干预的重要目标⁷。

已有报道称，红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）在多种损伤和疾病中具有改善作用，包括缩小心肌梗死面积、减轻糖尿病期间的肾和肝并发症、视网膜变性、中枢神经系统（CNS）损伤和脑卒中⁸，其机制可能与减轻氧化应激有关。特别针对中枢神经系统损伤，670 nm 光的临床前疗效研究已在视网膜变性^9-11、脊髓损伤¹²和神经元死亡¹³模型中显示出良好效果。目前已有针对干性年龄相关性黄斑变性的临床试验，且针对脑卒中的临床试验正在进行中¹⁴，但这些试验的结果似乎并不乐观，可能是因为未能采用有效的治疗参数¹⁵。因此，尽管红光/近红外光疗法易于实施、无创且相对便宜，但尚未被广泛采纳为神经创伤常规临床实践的一部分。阻碍其临床转化的因素包括作用机制尚不明确，以及缺乏标准化的有效治疗方案^16,17。当前关于光疗的文献显示，不同研究在照射光源（LED 或激光）、波长（例如，630、670、780、810、830、880、904 nm）、总剂量（单位面积照射的焦耳数）、持续时间（照射时间）、治疗时机（损伤前或损伤后）、治疗频率以及照射模式（脉冲或连续）等方面存在大量差异⁸。研究间治疗参数的不一致性导致结果难以比较，并加剧了人们对疗效的质疑¹⁶。

因此，显然需要对红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）进行优化，而细胞培养系统能够提供高通量筛选机制，用于比较多个变量。然而，目前市面上可提供的照明系统中，很少有能够对波长和强度进行充分灵活调控以开展此类优化实验的。市面上常见的LED设备通常无法提供多种波长或强度，导致研究者不得不使用来自不同制造商的多个LED装置，这些装置不仅在光强上可能存在差异，其发射光的波长光谱也可能不同。我们通过采用宽带氙灯光源，并结合窄带干涉滤光片进行过滤，从而产生一系列不同波长和能量密度的光，实现了对R/NIR-LT参数的精确、严密控制，解决了这一问题。

需要注意的是，治疗剂量的定义取决于与光受体（发色团）相互作用的光子数量，对于红光/近红外光治疗（R/NIR-LT），该光受体被认为是细胞色素 c 细胞色素氧化酶（COX） ¹⁸光子能量随波长而变化；这意味着在不同波长下相同能量剂量所包含的光子数量不同。因此，已对设备发出的光进行校准，使其在所选的各个测试波长下发射相同数量的光子。我们开发了一种系统，可用于向细胞递送不同波长和强度的红光/近红外光治疗（R/NIR-LT） 体外 并展示了测量在谷氨酸应激条件下递送的红光/近红外光疗（R/NIR-LT）对细胞活性氧（ROS）生成影响的能力。

方案

1. 光学校准：测量光输出

1. 准备光传递装置时，将宽带光源（例如，氙灯或钨灯）连接至适当的电源。在光源前方放置一个准直透镜，以产生准直光束。使光束通过液体热滤光器，以去除光束中的大部分热量。根据具体应用，将准直光束聚焦到液体光导的入射孔径上，从而实现更灵活的光传递（例如，将光导入培养箱内）。
2. 在液体光导的另一端，放置第二个准直透镜，随后安装干涉滤光片和中性密度滤光片的支架。检查该装置是否能产生所需波段和强度的均匀照明光斑。
   注意：光导末端与样品平面之间的距离可能需要根据所需照明区域进行调整，但需注意，随着光导末端与样品距离的增加，光强将下降。在本研究中，该距离为14 cm，可均匀照亮96孔板上3×3孔区域的横截面。
3. 确保来自光源及相关光学元件的杂散光无法到达样品。
4. 开启液体热滤光器的水冷装置，并确保滤光器夹套中有水流循环。打开光源电源，等待至少5分钟，使宽带光源达到稳定状态。注意：必须使用水冷装置，以防止设备过热。
5. 选择窄带干涉滤光片（通常以其中心波长、峰值透过率和半高全宽（FWHM）带宽来描述），以产生所需的照明波段。注意：本研究中使用的窄带干涉滤光片分别为442 nm、550 nm、671 nm和810 nm。
6. 在样品处理时所处的平面上，测量光源产生的光照。使用经校准的辐照度探头（余弦收集器）连接至合适的光谱辐射计，并按照制造商说明使用专用软件进行测量。
7. 使用中性密度滤光片调节光强，直至达到所需的输出强度。注意：在本研究中，通过每个干涉滤光片的光强被调节至在四个处理波段下具有相等的光量子输出。定期检查校准状态非常重要，因为光源输出可能发生改变。
   注意：在完成装置设置后，细胞即可进行光照处理。图1展示了本研究中所用光传递装置的示意图。

图1. 光递送装置示意图。 图示包括光源、带外壳的氙灯、准直透镜、水滤光器、入射光阑、液体光导、第二准直透镜、滤光片支架、治疗框架和哑光黑卡。请注意，窄带波长和强度滤光片未显示。

2. 细胞制备

1. 所述的近红外光疗（R/NIR-LT）递送方法可应用于任何细胞类型或 体外 模型系统；因此，以下关于细胞培养的描述为通用性描述，采用成熟 established 技术培养嗜铬细胞瘤（PC12）、Müller（rMC1）及原代混合视网膜细胞。
2. 在进行光照处理和氧化应激检测的细胞接种之前，将永生化细胞培养于含有适当补充成分的相应生长培养基中（例如在T75培养瓶中加入FBS、抗生素等，培养至细胞融合度达70-80%。
3. 使用适用于待测细胞类型的相应方法，从T75培养瓶中分离永生化细胞 例如，胰蛋白酶。如有必要，在将细胞接种至96孔检测板之前，用10 µg/mL多聚-L-赖氨酸在检测板孔中包被1小时（例如，对于PC12细胞）或10 µg/ml多聚-L-赖氨酸处理1小时，随后以10 µg/ml层粘连蛋白过夜孵育（例如，适用于混合视网膜细胞。
4. 离心细胞以适当收集例如，PC12细胞在405 × g下离心3分钟，或rMC1细胞在218 × g下离心10分钟，弃上清，加入8 ml相应的细胞培养基重悬。
5. 若使用混合视网膜细胞，应按照既定方案，通过酶消化法（木瓜蛋白酶）从出生后0至5天的新生大鼠幼崽中制备 ¹⁹
6. 使用血细胞计数板，计数排除0.4%（w/v）台盼蓝染料的活细胞数量。
7. 调整细胞密度，使细胞在培养24或48小时后融合度达到约70-80%。（对于PC12细胞，接种密度为4.0 × 10⁵ cells/mL）⁵ 每毫升活细胞数，对于 rMC1 细胞为 2.5 × 10⁵ 活细胞数/ml，对于混合视网膜细胞为 8 x 10⁵ 可存活细胞/毫升）。将细胞加入透明或黑色96孔板（用于H₂O₂ 或DCFH-DA检测），加入100 µl适当培养基，将培养板置于37°C、5% CO₂的水平表面上孵育₂ （或根据特定细胞类型选择合适的条件）培养至少24小时，以促进细胞贴壁。
8. 在适当的96孔板中，使用生长培养基培养细胞，直至细胞融合度达到70–80%（PC12和rMC1细胞培养24小时，混合视网膜细胞培养48小时）。

3. 向细胞添加谷氨酸应激物

1. 在适当的完全培养基中配制浓度为 0–10 mM 的 L-谷氨酸单钠盐水合物应激剂溶液。
2. 移除细胞培养基，用 PBS（PC12 细胞）或 HBSS（rMC1 细胞和混合视网膜细胞）轻柔洗涤细胞 3 次。洗涤后，加入含谷氨酸的培养基，每孔总体积为 100 µl。

4. 光照治疗的首次剂量

1. 在加入谷氨酸或选定的应激因子后，立即将细胞置于已准备好的光递送装置下，以所需的波长和强度进行光照处理。根据所使用的波长，通过调整中性密度滤光片的组合来调节光束的量子输出。
   注意：在当前实验中，对细胞进行持续3分钟的光照处理，并将96孔板放置在37^oC加热垫上以维持温度。处理时间可根据需要调整。
   1. 在细胞下方放置一张哑光黑卡，以防止光线反射到96孔板中用于其他处理参数的相邻孔中。
2. 若需延长处理时间，可添加25 mM HEPES缓冲液以维持细胞培养基的pH值；或更理想地，将装置和处理板置于CO₂浓度控制在5% CO₂的培养箱中，或置于适合特定细胞类型的最适条件下。
3. 完成光照处理后，将细胞置于水平表面上，在37°C和5% CO₂（或适合该细胞类型的其他最适条件）下继续孵育24小时。
   注意：可根据需要，按照上述方法追加R/NIR-LT的处理剂量。

5. 光处理的最终剂量及活性氧检测

1. 在进行最后一轮光照处理之前，准备好用于活性氧（ROS）检测的试剂。配制50 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）、Triton X100，以及H₂O₂检测工作液（按1:2:97的比例混合10 mM H₂O₂检测试剂储备液、10 U/mL辣根过氧化物酶和50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0））。将DCFH-DA配制成适当培养基中的终浓度为100 µM的溶液。
   注意：PC12细胞所用的DCFH-DA试剂使用RPMI培养基，rMC1细胞所用的DCFH-DA试剂使用DMEM培养基。需注意，市售检测试剂对特定活性氧的敏感性存在差异，应谨慎选择试剂，以满足具体应用的信息需求。
2. 按照步骤4.1–4.1.2所述对细胞进行光照处理。确保细胞接受所需光通量和波长的光照。
3. 光照处理结束后立即移除含谷氨酸的培养基，并用适当的缓冲液清洗两次（PC12细胞使用PBS，rMC1细胞使用HBSS）。随后按以下方法对细胞进行ROS检测：
   1. H₂O₂检测：向每个孔中加入45 µl 50 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）和5 µl Triton X100。在摇床上轻轻振荡30秒，随后在37°C、5% CO₂条件下孵育15分钟。每孔加入50 µl H₂O₂检测工作液，在室温下孵育30分钟。使用酶标仪检测荧光，激发波长为530 nm，发射波长为480 nm。
   2. DCF检测：向每个孔中加入100 µl 100 µM DCFH-DA溶液，在37°C、5% CO₂条件下孵育30分钟。移除含100 µM DCFH-DA的培养基，并用适当的缓冲液（如上所述）清洗两次。向每孔加入90 µl缓冲液和10 µl Triton X100，在摇床上轻轻振荡30秒，随后在37°C条件下孵育15分钟。使用酶标仪检测DCF来源的荧光，激发波长为480 nm，发射波长为530 nm。
   3. 根据孔中残留细胞的蛋白浓度对ROS检测结果进行标准化表达。使用比色法蛋白定量试剂盒，按照制造商说明书操作，并参照标准曲线计算蛋白含量（单位：mg蛋白）。

结果

使用中性密度滤光片对波长为670 nm的光输出进行校准，以便用涵盖先前已证明具有有益效果的670 nm光剂量的一系列能量密度照射细胞 体内 (0.3 J/cm²)²) ²⁰随着光源前中性密度滤光片数量的增加，光强（W/m²）降低，导致更少的光到达目标区域。表1列出了配备波长滤光片的光源所产生的670 nm光的校准数据，包括所使用的中性密度滤光片（ND滤光片）数量、在指定距离下测得的光输出强度。670 nm光的辐照量（即光剂量，J/cm²）²），根据以下公式计算：[剂量（J/cm²) = （光强（W/m²) / 10,000) × 时间（s）]，其中处理时间为180 s。

...

中性密度滤光片数量

距光源输出距离（cm）

强度（W/m^2）

剂量（J/cm^2）

讨论

我们已成功改进了一套精确且经过校准的光递送系统，为研究红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的优化机制提供了有效手段 体外. 该系统能够准确有效地调控红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）的波长和强度参数。我们证实，尽管在所测试的细胞类型中，特定波长和剂量的光照处理未能降低活性氧（ROS）水平，但并未引起细胞死亡。当前系统在670 nm波长下达到的最大强度为20.11 W/m²。²) 超过了先前报道的大鼠脑组织中辐射穿透能力的测量值，其中 1.17 W/m² 到达视神经腹侧表面及0.3 W/m² 到达颅骨腹侧表面。当持续给药30分钟时，视神经细胞所接受的剂量 体内 因此为 0.054 – 0.31 J/cm². 本研究中使用的670 nm光照剂量（最高达0.38 J/cm²）²因此涵盖了我们先前研究中细胞所接收到的那些信号 体内 研究.

目前被广泛接受的红光/近红外光疗法（R/NIR-LT）有效性理论是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞内活性氧检测试剂盒（绿色荧光）	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed 试剂	Molecular Probes	A36006
300 瓦氙弧灯	Newport Corporation	6258	光源强度极高，切勿直视灯管。开启时确保灯具有足够的冷却条件
USB4000-FL 荧光光谱仪	Ocean Optics
用于发射光收集的 CC-3-UV 余弦校正器	Ocean Optics
直径 200μm 石英光纤	Ocean Optics
SpectraSuite 光谱分析平台	Ocean Optics
2300 EnSpire 多功能酶标仪	Perkin Elmer
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	具有急性毒性，操作时需佩戴手套
L-谷氨酸单钠盐水合物	Sigma-Aldrich	142-47-2（无水）
嗜铬细胞瘤大鼠肾上腺髓质细胞（PC12 细胞）	American Type Culture Collection	CRL-2522
罗斯威尔公园纪念研究所培养基（RPMI1640）	Gibco	11875-119
胎牛血清，经认证，热灭活，美国来源	Gibco	10082-147	使用前在水浴中预热至 37 °C
马血清，新西兰来源	Gibco	16050-122	使用前在水浴中预热至 37 °C
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-061	使用前在水浴中预热至 37 °C
100 mM 丙酮酸钠	Gibco	11360-070	使用前在水浴中预热至 37 °C
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140-122	使用前在水浴中预热至 37 °C
100X MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140-050	使用前在水浴中预热至 37 °C
大鼠视网膜 Müller 细胞（rMC1 细胞）	加州大学圣地亚哥分校
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11965-118	使用前在水浴中预热至 37 °C
75 cm2 培养瓶	BD Biosciences	B4-BE-353136
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	25988-63-0	分装后于 -20 °C 保存
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14025-134	使用前在水浴中预热至 37 °C
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-049	使用前在水浴中预热至 37 °C
小鼠天然层粘连蛋白	Gibco	23017-015	分装后于 -20 °C 保存
1X 神经基础培养基	Gibco	21103-049	使用前在水浴中预热至 37 °C
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250-061
165U 木瓜蛋白酶	Worthington
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 孔板，透明底，黑色	Corning	CLS3603-48EA
Costar 未处理透明聚苯乙烯 96 孔板；孔型：圆形；无菌	Costar	07-200-103
往复式摇床	标准实验室设备
离心机	标准实验室设备
中性密度滤光纸（0.3）	THORLABS
442 nm 带通滤光片	THORLABS	FL441.6-10
550 nm 带通滤光片	THORLABS	FB550-10
670 nm 带通滤光片	THORLABS	FB670-10
810 nm 带通滤光片	THORLABS	FB810-10e
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.1）	THORLABS	NE01B
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.2）	THORLABS	NE02B
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.3）	THORLABS	NE03B
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.5）	THORLABS	NE05B
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（0.6）	THORLABS	NE06B
未安装 Ø25 mm 吸收型中性密度滤光片（1.0）	THORLABS	NE10B