通过连续补料实现球状体大规模扩增哺乳动物细胞的营养调控

摘要

与间歇性分批补料相比，采用连续生长调节补料的营养调控可提高搅拌式悬浮生物反应器中哺乳动物细胞球体的生长速率。本研究展示了建立简单调节补料速率培养体系所需的方法。

摘要

在本实验中，采用β-TC6胰岛瘤细胞系形成的球体作为哺乳动物胰岛细胞产品生产的模型，以展示调控营养水平如何提高细胞产量。既往研究表明，与静态培养相比，生物反应器可实现更大的培养体积，但并未观察到细胞产量的提升。关键营养物质（如葡萄糖）在批次补料间隔期间被消耗，可能导致细胞扩增受限。尽管培养基中葡萄糖初始浓度增加，仍观察到葡萄糖水平出现大幅波动。采用连续补料系统可消除葡萄糖浓度的波动，并与批次补料静态培养及SSB培养方法相比，显著提高了细胞生长速率。通过根据计算的营养消耗率调整补料速率，进一步提升了生长速率，可在培养期间连续三周维持生理水平的葡萄糖浓度。该方法也可适用于其他细胞类型。

引言

为了获得大量具有活力和功能的人类细胞用于移植，必须对培养条件进行调控。营养物质的耗竭以及代谢废物的积累是导致细胞衰老和代谢改变的主要因素，会降低细胞产品的质量^1–3。本实验展示了一种利用搅拌式生物反应器结合调节流速的灌注 feeding 系统，在整个培养过程中将葡萄糖浓度维持在生理范围⁴内，以实现哺乳动物细胞在球状体中的培养。在本研究中，生理范围定义为 100 至 200 mg/dl。相同的方法也可用于调控其他营养物质和代谢废物（如乳酸）的水平。

在实验研究中，通常采用小体积（1 - 30 ml）静态培养方式来维持和诱导细胞系的分化。细胞传代时需定期更换完全培养基。大多数“常规”培养基含有高浓度葡萄糖（本研究所用DMEM的葡萄糖浓度为450 mg/dl），以减少换液频率，避免营养限制。然而，这种批次补液方法仍需要频繁操作，会引入细胞环境的变异性，并增加污染风险^5–9。搅拌式悬浮生物反应器（SSB）可实现更好的混合效果并减少操作步骤^3,10–20，但与静态培养类似，仍需人工更换培养基，导致营养物质和代谢废物水平出现可能有害的波动。对SSB培养系统采用灌注式补液可通过持续添加和移除培养基来缓解上述问题，但细胞生长引起的营养物质水平大幅变化仍然存在。通过基于细胞需求估算的营养消耗计算，调整补液速率，可提供稳定细胞环境，从而优化细胞活力与功能^21–24。

已有大量文献描述了用于哺乳动物细胞规模化悬浮培养（SSB）的方法，特别是针对多能细胞的培养与扩增^25–32，其他研究则集中于胰岛（β）细胞^17,33,34，或生物产品的生产^24,35–38许多被研究的细胞类型均可在球状体培养物中生长，在实施连续灌注培养系统之前，应针对所用的特定细胞类型优化相应的培养方案。在本实验中，采用灌注培养方法，在搅拌式生物反应器中对以球状体形式生长的β细胞系进行了扩增。^39–43本文所述方法通过离线葡萄糖测量实现进料速率的简便调节，以达到目标培养条件。采用该方法调节进料速率以维持生理葡萄糖水平，可提高细胞产量。哺乳动物细胞依赖葡萄糖这一关键营养物质进行能量生成，因此该细胞系可作为多种培养哺乳动物细胞的代表性模型。⁴⁴此外，该细胞系体现了β细胞的进一步复杂性，这类细胞对长期高水平的葡萄糖具有敏感性。⁴⁵在本研究中，β-TC6细胞在培养中形成类球体，以模拟朗格汉斯岛的平均大小 体内灌注式生物反应器系统^{17–19,21,46} 通过调节进料速率以匹配葡萄糖消耗，可在不改变细胞活力的情况下维持生理条件并获得更高的细胞产量。

方案

1. 细胞系及培养维持

1. 获取 β-TC6 细胞（或其他所需的贴壁哺乳动物细胞系）。为研究做准备，根据供应商的说明对细胞进行培养、传代和冷冻保存。

2. 组装连续进料系统

注意：以下方法中的连续喂养系统设计基于文献中描述的类似系统^{17–19,21,47–49}。该系统的组装细节已在先前发表的研究中进行了详细描述³。

1. 收集进料系统所需的组件，该系统由五个主要部分组成：培养基储液瓶、蠕动泵、搅拌式生物反应器、废液储液瓶以及定制设计的管路/取样装置。
   1. 使用一个1 L的玻璃瓶作为培养基储液瓶，一个2 L的玻璃瓶作为废液储液瓶，以及一个250 ml容积的玻璃反应器（市售型号）作为搅拌式生物反应器。
   2. 使用数字式蠕动泵或具有8通道泵头的类似泵来控制培养基的更换。
   3. 使用坚硬且可高压灭菌的塑料材料制造储液瓶和改造后的生物反应器盖，并配备不锈钢穿壁管接口，以通过无菌过滤器实现通风，并允许培养基在储液瓶与生物反应器之间转移。或者，也可从不同供应商处购买带有流路接口的专用盖子。
      注：生物反应器盖上可包含额外的穿壁接口，用于安装可选仪器和监测探头（例如，氧气监测器）。
   4. 将一根由多孔玻璃通气管制成的出流管（OT）连接至改造后的SSB盖上，其平均孔径范围为40 µm至60 µm，孔隙密度为40%。或者，可根据培养的具体需求选择其他类型的出流管。
      注：应选择合适的OT孔径，仅允许培养基和细胞碎片通过，而将细胞聚集体保留在培养体系中（详见第6节及文献³中的详细说明）。
2. 使用聚偏二氟乙烯（PVDF）管路接头和耐用型蠕动泵管组装可高压灭菌的灌注管路组件。管段长度应根据各组件之间的距离确定。
   注：在选择管路类型时需特别注意，以确保其在长期实验中的耐用性和可靠性。
3. 将管路组件分为三部分进行组装：进料管路、废液管路和取样管路。
   1. 使用两种不同管径（L/S 14和L/S 13）组装进料管路。主段管路采用L/S 14，连接生物反应器与培养基储液瓶；在管路中间泵段位置，使用合适的PVDF接头插入一段较短的L/S 13管路。
   2. 使用标准PVDF带卡箍管接头，在较短的泵段（L/S 13）两侧分别连接两段L/S 14管路。
      注：或者，整个管路可全部使用较小直径的L/S 13管路，当泵段完整性存疑时，可整体更换整条管路。
4. 使用较大直径（L/S 16）的管路组装用于废液移除的第二段管路，并在中间泵段插入一段较短的L/S 14管路。组装方式与进料管路相同，使用PVDF带卡箍接头连接；或者也可使用一段连续的所需泵用管径管路，并根据需要进行更换。
   注：若进料回路和废液回路使用相同的泵及泵头，则废液移除管路的泵段直径必须大于进料管路的泵段直径。这可确保废液泵送速率快于进料速率，避免培养液体积发生大幅波动，并降低溢出风险。
5. 组装管路组件的最后一个部分：取样收集装置。
   1. 本步骤描述一种定制组装的取样口系统；或者，也可从不同供应商处购买无菌取样口。
   2. 使用三个短段（约6 cm）的L/S 14管路，通过T型PVDF连接器连接，并在其中两段管路上安装小型软管夹，构成该装置。
   3. 在其中一个带夹管段上连接无菌气体过滤器用于排气，另一段则用于连接无菌取样注射器（由于许多无菌过滤器不可高压灭菌，无菌气体过滤器可能需在灭菌后于生物安全柜中添加）。
   4. 将第三端连接至安装在生物反应器盖上的不锈钢取样接头。
   5. 在实验开始前，将取样装置连接至生物反应器后一同进行高压灭菌（参见下文步骤3）。
   6. 使用该装置可在不干扰连续进料过程的前提下，按需从生物反应器中采集无菌样品。

3. 灭菌所有材料

1. 准备所有生物反应器组件以进行高压灭菌。
2. 收集各组件以备灭菌。包括培养基和废液储液瓶（按步骤2.1.1组装）、250 ml旋转瓶（按步骤2.1.1组装）、所需改良瓶盖（按步骤2.1.3组装）、流出管（见步骤2.1.4）、三套管路系统（分别在2.2至2.5节中组装），以及连续灌流所需的流出管（按需准备）。
   1. 将旋转烧瓶与所有组件组装在一起，并确保流出管牢固地连接在旋转烧瓶内部（见第2.1.4节），并将定制组装的取样口（第2.5节）或其他取样口连接至瓶盖顶部。
   2. 用灭菌包裹材料和灭菌指示胶带将整个旋转烧瓶组件完全包裹。确保包裹严密，达到气密状态。注：可使用铝箔或类似材料分别覆盖生物反应器盖上各个接入端口的开口端，以在打开外层包裹以及在培养箱内尚未连接管路组件时，保持接头/端口的无菌状态。
   3. 组装培养基瓶和废液瓶的改装瓶盖，然后分别连接至相应的玻璃瓶上。用铝箔覆盖，并贴上高压灭菌指示胶带。
   4. 将管路组件（第2.2–2.5节）分别用 autoclave 包装纸包裹并用胶带固定，以方便最终组装。可使用铝箔或类似材料分别包裹每套管路组件的末端，以在拆包时保持连接头/末端的无菌状态。
   5. 使用标准干热高压灭菌循环对所有包裹物品进行高压灭菌例如，“重力”模式下121 °C、约15 psi，灭菌30分钟或更长时间。
      注意：除非确认可耐受高压灭菌，否则不要在高压灭菌前安装无菌滤器。

4. 类球体形成

注意：该技术与文献中描述的其他哺乳动物细胞培养方法类似^{17–19,21,50–52}。所有灭菌后的操作均应在超净工作台中进行，并使用无菌手套，以维持细胞培养的无菌条件。

1. 对于所有条件，按照供应商提供的说明，在标准贴壁培养条件下培养并扩增 β-TC6 细胞，直至获得足够数量的细胞，以接种所需数量的生物反应器。
   1. 按照 图1 所示及第2节所述，组装带有出流管的连续灌流生物反应器，并将取样口连接至取样盖。注意：出流管和取样口组件应在类球体形成前安装至生物反应器，用于实现连续灌流；在开始连续灌流前，应将其从培养基中提起。
   2. 通过高压灭菌法对改良后的 SSB 装置进行灭菌（详见第3节）。
   3. 在搅拌烧瓶以及培养基和废液容器的盖子上适当位置安装无菌通气口（0.22 µm 或更小孔径的无菌滤器）。
      注意：此步骤对于防止气阻以及实现培养箱（5% CO₂）环境与生物反应器之间的气体交换至关重要。当使用碳酸氢盐缓冲培养基时，气体交换对于维持正确的 pH 值是必需的。
2. 在室温下，使用 0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 溶液轻柔消化细胞，辅以机械振荡 2–3 分钟，收集细胞，并以约 1.3 × 10⁶ 个细胞/ml 的密度将细胞接种至生物反应器中，总体积为 200 ml 培养基。
   1. 将指定的培养瓶从培养箱中取出，移至生物安全柜中。
      注意：所有细胞培养操作均应在生物安全柜中进行，并采用规范的无菌操作技术。
   2. 通过抽吸法移除培养瓶中的培养基。
   3. 用移液管向培养瓶中加入 5 ml 磷酸盐缓冲液（不含 Ca⁺⁺ 或 Mg⁺⁺），冲洗瓶壁上的细胞，然后抽吸去除 PBS。
   4. 向每个待收集细胞的培养瓶中加入 3 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液（通常每个约 10 个 175 cm² 的 T 型培养瓶）。
   5. 将收集的细胞在生物安全柜中室温孵育 2–3 分钟。
   6. 手动轻轻振荡，使细胞从瓶壁脱落，然后向瓶中加入 6 ml 含血清的培养基，收集细胞，并转移至 50 ml 离心管中。当一个 50 ml 管装满后，继续使用下一个 50 ml 管，直至所有所需细胞均被收集（每收集 5 个 T-175 培养瓶约需一个 50 ml 管）。
   7. 将收集的细胞悬液以约 50 × g 的离心力轻柔离心，使细胞沉淀。
   8. 抽吸去除上清液，保留细胞沉淀完整。
   9. 用移液器将所有沉淀重悬于含血清的培养基中，合并至同一离心管中。
   10. 按照文献所述方法⁵³，使用血细胞计数板结合台盼蓝染色法测定细胞密度。
   11. 根据各实验条件，将所需总数的细胞加入无菌 SSB 中（本实验中设定的起始细胞密度为 1.3 × 10⁶ 个细胞/ml）。
   12. 使用移液器向 SSB 中加入含目标葡萄糖浓度的培养基（本实验中使用生理范围内的中等葡萄糖浓度），以达到目标总体积（本研究中使用 200 ml 培养体积）。
       注意：在本系列连续灌流 SSB 实验中，接种时使用改良的“低葡萄糖”培养基版本（100 mg/dl），使培养体系从目标葡萄糖浓度开始，而非使用“高葡萄糖”培养基后等待细胞消耗葡萄糖至生理范围再开始灌流。本研究中其余用于灌流的培养基均使用标准“高葡萄糖”培养基（500 mg/dl）。
   13. 将含细胞的 SSB 转移至细胞培养箱内的搅拌平台上。
3. 在 37 °C、5% CO₂、100% 相对湿度及 70 rpm 搅拌速率条件下，于生物反应器中无灌流培养细胞 3 天，以促进类球体形成。
   注意：在为期三天的类球体形成期间，不应观察到明显的细胞增殖。
4. 类球体形成后，将类球体按目标培养条件分配至各生物反应器中。

5. 连续补料培养与调整补料速率

1. 将所有组件进行高压灭菌或气体灭菌，并在生物安全柜中使用无菌操作技术进行组装（步骤 2 - 4）。
2. 在球体形成后，将 SSB 从培养箱中取出，并在生物安全柜中组装连续 feeding 系统的各个组件。
   1. 首先将所需培养基加入新鲜培养基储液瓶中，然后将其连接至 feed 管路的一端。同时确保新鲜培养基储液瓶通过无菌滤器正确排气。
   2. 以无菌方式将 feed 管路的一端连接至生物反应器的进液口。应在 feed 管路与生物反应器进液口之间安装一个无菌滤器，以在培养基进入生物反应器前进行过滤。
   3. 将废液管路连接至生物反应器的出流管和废液储液瓶，并确保废液储液瓶通过无菌滤器正确排气。
3. 将组装好的系统移出生物安全柜（此过程可能需要两人共同搬运所有容器和管路），并将所有组件准备用于长期培养。
   1. 将 SSB 放置在培养箱内的搅拌器上，使用与球体形成相同的培养条件（37 °C、5% CO₂、100% 湿度和 70 rpm）。注意：如果管路需要穿过培养箱侧壁的孔洞而非通过门封胶条引出，则可能需要暂时断开生物反应器上的管路段。可通过在灭菌前用铝箔包裹管路接头（步骤 3）实现无菌操作，并在生物反应器放入培养箱后再迅速连接 feed 和 waste 管路至生物反应器端。可先将管路线布置到位，在培养箱内移除铝箔并快速连接至生物反应器。
   2. 将未连接至生物反应器盖的管路末端通过培养箱的通路孔（pass-through）或门封胶条的缺口引出。
   3. 在培养箱外（尽可能在附近的生物安全柜内）迅速将 feed 管路连接至新鲜培养基储液瓶，将 waste 管路连接至废液储液瓶，并确保废液储液瓶通过无菌滤器正确排气。注意：为保证无菌操作，应尽快移除管路和容器接头上的铝箔，并立即连接至相应容器（特别是当该连接需在生物安全柜外完成时）。
   4. 将装有所需 feed 培养基的新鲜培养基储液瓶放入附近的小型冰箱中。检查确认 feed 和 waste 管路能够从培养箱引出并进入冰箱，且不阻碍两者的门关闭。同时必须确保管路不会被冰箱或培养箱的门夹住而阻断液体流动。
      注意：本研究使用的培养基为供应商推荐用于该细胞类型的标准化高葡萄糖（500 mg/dl）培养基。可根据所培养细胞类型的具体需求选择任何高葡萄糖培养基。feed 培养基中的葡萄糖浓度应明显高于（2 倍或以上）培养体系中期望维持的浓度，因为 feeding 系统依赖于提高高葡萄糖培养基的供给速率，以在保持合理供给速率的同时维持培养体系中充足的葡萄糖水平。
   5. 随后，可将废液储液瓶放置在培养箱外的实验台面上便于操作的位置。
   6. 接下来，将 feed 和 waste 管路的“泵段”正确装入泵头中，确保方向正确，使 feed 管路能将新鲜培养基从储液瓶泵入 SSB，而 waste 管路能将培养基从 SSB 泵出至废液储液瓶。
4. 开启泵至所需的 feed 速率。
   1. 使用文献³及下文提供的代表性结果部分中描述的修正 feed 速率计算公式来计算 feed 速率。
   2. 结合最近的细胞计数信息（见步骤 5 所述方法）、生长预测以及培养基葡萄糖浓度测定结果，估算维持培养体系中目标葡萄糖浓度所需的 feed 速率。
      注意：在执行这些操作前，需预先获得细胞生长速率和葡萄糖消耗速率的数据。
   3. 根据计算所得的 feed 速率设定泵速。
5. 在每个取样时间点（按本方法描述为每三天一次）重复计算 feed 速率并调整泵速。

6. 细胞计数、活力及葡萄糖浓度测定

1. 每三天或按需从每个生物反应器中采集样品。
2. 使用上述专用采样口，从持续补料的SSB培养物中采集培养样品。
   1. 将持续补料的SSB保留在生物反应器内，将无菌注射器（本研究中使用5 ml容量注射器）连接至采样口的未过滤连接端。
   2. 将采样管向下移动至培养基中。
   3. 松开通向注射器的管路段夹子，抽出所需总体积的样品。
   4. 将采样管向上移动，使其不再浸没于培养基中，并继续抽吸注射器直至空气被抽出。
   5. 夹紧通向注射器的管路，取下含有样品的注射器并妥善保存。
   6. 预先用空气填充第二个新的无菌注射器，并将其连接至采样口的无菌滤膜侧。
   7. 松开采样口通向注射器-滤膜侧的管路，然后通过无菌滤膜轻轻排出注射器中的空气，以冲洗采样口。此步骤可确保采样口内无残留培养基。
   8. 重新夹紧通向滤膜的管路，断开无菌注射器并弃去。
3. 取含有细胞样品的注射器，将内容物排入一个10 ml离心管中。可从此管中直接取出已知体积的子样品。
4. 进行细胞计数时，取出已知体积的细胞悬液并转移至微量离心管中，以约50 × g的离心力轻柔离心1–2分钟。
5. 将上清液转移至另一管中用于葡萄糖测定，并用相同体积的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25% (w/v) 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA）重悬沉淀，按照文献所述方法使用台盼蓝染色和标准血细胞计数板进行三次重复计数⁵³。
   1. 根据需要，加入含血清的培养基对样品进行稀释。
   2. 计数细胞，并分别记录活细胞（未染色）和死细胞（染色）数量，计算细胞活力（活力百分比 = 活细胞数 / 总细胞数）。
6. 使用血糖仪和一次性试纸条，对培养基中的葡萄糖水平进行三次重复测定。
   1. 按照血糖仪说明书操作，以培养基替代血液进行葡萄糖测定。
   2. 将试纸条浸入待测培养基（来自上述细胞计数样品的收集液）中，并按所需重复次数重复操作（建议进行三次重复）。
   3. 分别检测新鲜培养基和废培养基中的葡萄糖浓度。
      注意：对于某些血糖仪，当测量值低于20 mg/dl（仪器检测阈值）时，仪器输出可能显示为错误。

7. 类球体沉降速率测量

1. 为确保连续加样系统不会移除细胞团簇，可通过观察β-TC6球体在大直径塑料移液管中的沉降情况，测量其沉降速率。
2. 在SSB生物反应器中培养β-TC6细胞，以形成球状体，操作步骤如上所述。
3. 培养3天后，取30 ml类球体悬液样品，置于50 ml离心管中。
4. 使用大口径的25 ml移液管轻轻吹打混匀，使悬浮液分布均匀，然后在移液管中悬浮液达到已知液面高度时停止吹打。例如， 20 ml 刻度线），然后记录所有类球体沉降 5 cm 所需的时间。
5. 重复此步骤足够多次以达到统计学置信度（通常 n > 3).
   注意：在进行测量值比较的生物学研究中，当 p 值小于 0.05 时，认为具有统计学显著性。数据误差以均值的标准误表示，组间比较采用双尾非配对 student-t 检验。

结果

标准 SSB 培养条件下，中等葡萄糖水平及波动限制细胞扩增

在静态培养和SSB培养的整个培养期间，葡萄糖水平会发生波动³。这些波动随着21天培养期内细胞数量的增加而加剧，在静态培养和SSB培养中几乎完全相同。这些观察结果已在我们之前的发表文章中呈现³。两种方法在整个培养期间均可能导致葡萄糖水平高于生理浓度。由于这种长期暴露可能抑制细胞生长⁵⁴，因此开发了一种连续 feeding 系统，以消除葡萄糖波动并改善类球体培养过程中的营养控制。

用于类球体培养的连续 feeding 系统

在整个培养期间，通过一个简单的培养基补充系统，可持续添加新鲜培养基并移除旧培养基。方法2中描述并在图1中展示的系统，使用泵和管路组件持续补充培养基，并通过独立的出流管持续移除培养基，同时防止培养物中的类球体（spheroids）被带...

讨论

生产生物制剂和细胞治疗所需的哺乳动物细胞产品，需要对哺乳动物细胞进行大规模培养与监测^55–58。此外，这些应用要求采用明确且经过验证的培养条件。仅通过研究技术扩大细胞体积无法满足所有这些要求。人工换液会导致营养物质波动以及代谢废物积累，从而降低细胞质量、存活率和产量。生物反应器已广泛用于微生物的商业化培养，以满足生物制药应用的需求，类似策略也已应用于哺乳动物细胞培养。哺乳动物细胞与其环境之间复杂的相互作用， necessitates 对营养水平进行特定调控，以优化细胞扩增潜力。

为解决这些问题，我们开发了一种简便的方法，可在带可调节流速灌注 feeding 机制的搅拌悬浮生物反应器中，将葡萄糖水平维持在特定的目标范围内，接近生理水平。为此，首先在搅拌悬浮生物反应器中生成了胰岛β细胞系的球体。采用灌注 feeding 系统提供连续 feeding 机制，以替代传统的批次 feeding 方式。通过监测细胞生长速率，并据此预测葡萄糖的大致消耗速率。同时，在培养过程中定期测定实际的葡萄糖水平，以根据细胞实际消耗的营养物质及...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
βTC-6 细胞	ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州	CRL-11506	小鼠胰岛素瘤细胞系（贴壁细胞类型）
DPBS No Ca， No Mg	Invitrogen，卡尔斯巴德，CA	14190-144	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144？ICID=search-14190144
Dulbecco's 改良 Eagles 培养基	Invitrogen，加利福尼亚州		请参阅下面的产品编号
DMEM 高葡萄糖 （500 mM）	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德	11965-092	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM 低葡萄糖 （100 mM）	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德	11885-084	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084（注意此培养基已含有丙酮酸）
L-谷氨酰胺	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德25030081		http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081？ICID=search-product
Sodium Pyruvate	Invitrogen， 卡尔斯巴德， CA	11360070	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070？ICID=search-product
热灭活猪血清	Gibco - Life Technologies	10082147	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德	25200056	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056？ICID=search-product
T-150 组织培养处理的培养瓶	Corning， Corning， NY	430825	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825（生命科学） &categoryname=
NuAire 细胞培养箱	明尼苏达州普		美国 Autoflow。可以使用任何水套式 CO2 调节细胞培养箱。
离心机			Sorvall RT 7 （可以使用任何类似的台式离心机）
冰箱			可以使用任何实验室冷藏箱（这些研究使用小型台式冰箱）
1 L 玻璃瓶	Corning， Corning， NY	1395-1L	可以使用任何供应商。http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L（生命科学） &categoryname=
2 L 玻璃瓶	Corning， Corning， NY	1395-2L	任何供应商都可以使用
250 ml 搅拌式生物反应器	Corning， Corning， NY	4500-250	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250（生命科学） &categoryname=
搅拌板	Fisher Scientific	11-496-104A	任何供应商都可以使用任何培养箱安全搅拌板
培养皿 100 mm 直径	Nunc，纽约州罗切斯特 （Fisher Scientific）	1256598	可以使用任何供应商（通过 Fisher Sci 订购）
FALCON 50 ml 锥形管	Falcon， San Jose， CA	1256598	任何供应商都可以使用
Delran 塑料 用于定制零件	McMaster Carr	各种	任何选择的材料，但选择 Deran 是因为它在高压灭菌器中安全、无反应且易于加工。
http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac 不锈钢管 用于定制盖子	McMaster Carr	各种	可以使用任何供应商。http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
用于连续进料的定制改性 Delran 生物反应器盖	定制		不知道有任何供应商生产类似产品
定制改性玻璃瓶盖 用于连续进料	定制		一些供应商（例如 、Fischer Sci、Corning）在下面的链接中生产类似的产品。
Masterflex 数字蠕动泵	Cole Parmer， Vernon Hills， IL	EW-77919-25	任何精密蠕动泵都可以使用。http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25
PVDF 管接头（各种）	Cole Parmer，伊利诺伊州弗农山	见链接	可以使用任何供应商。http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889
受暖 BPT 管 L/S 16	Cole Parmer，伊利诺伊州弗农山	WU-06508-16	可以使用任何供应商。http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16
受热BPT管 L/S 14	Cole Parmer， Vernon Hills， IL	WU-06508-14	可以使用任何供应商。http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14
受热BPT管 L/S 13	Cole Parmer， Vernon Hills， IL	WU-06508-13	可以使用任何供应商。http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13
Millipore Millex GP PES 膜 0.22 µl 无菌注射器过滤器（用于通气和中等过滤）	Fisher Scientific	SLGP033RS	可以使用任何供应商
25 ml 刻度移液器	Fisher Scientific	13-678-11	可以使用任何供应商，并且可以使用各种尺寸
移液器	Fisher Scientific	13-681-15E	任何供应商或类似产品 血
球计数器	Fisher Scientific	02-671-6	可以使用任何供应商或类似产品
台盼蓝	Gibco - Life Technologies	15250-061	可以使用任何供应商或类似产品。https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
置光学显微镜	Leica		可以使用任何供应商或类似产品
一键式超血糖仪	Fisher Scientific	22-029-293	可以使用任何供应商或类似产品（例如，拜耳）
一键式 Ultra-Strips	Fisher Scientific	22-029-292	可以使用任何供应商或类似产品（例如，拜耳）