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基于社区环境采集样本的全血成分快速分离与提取

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DOI：

10.3791/52227

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2015年11月30日

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1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

我们概述了一种用于处理全血以获取多种组分以供进一步分析的方法。我们优化了一个简化的操作流程，可在非临床环境下快速、高通量地同时处理多个全血样本。

摘要

在非临床环境中采集和处理全血样本，为评估社区居住人群中患有和不患有既往疾病个体提供了独特的机会。快速处理这些样本对于避免关键细胞成分的降解至关重要。本文提供了从大都市地区志愿者家中单次采血后，同时分离外周血单个核细胞（PBMC）、DNA、RNA 和血清的方法，且在采血后 2 小时内即开始处理。我们已使用这些技术处理了超过 1,600 份血液样本，获得了稳定且高质量的材料，并成功应用于 DNA 甲基化、基因分型、基因表达和流式细胞术分析。其中部分方法为标准操作；然而，当以所述方式组合使用时，能够高效处理通常不会在临床环境中接受评估的人群（基于人群或社区的研究参与者）的样本。因此，该方案有望获得更能代表总体人群的样本（以及后续数据）。

引言

多项研究已描述了患有与未患有精神（或其他）疾病个体之间在基因表达、DNA甲基化及血液细胞亚群方面的差异1-4。然而，这些研究大多来自临床环境，其中疾病相关差异可能因前来就医的患者病情通常更为严重而被放大。随着“组学”技术的发展，过去十年中，人们越来越关注从社区和/或流行病学环境中采集生物样本5-7，以提供基于人群的疾病患病率估计，并更全面地揭示这些精神和/或躯体疾病的环境决定因素。

在此方面，一个关键挑战是需要快速处理采集的样本。单个核细胞作为常用于评估个体健康状况的关键免疫系统组分，其降解在采血后立即开始，采集后2小时即出现显著的回收率下降8-10。为应对这一挑战，我们提出了一种优化的实验方案，可同时从居住于大型都市地区受试者家中采集的人类全血样本中分离出多种血液组分。该方案基于对现有技术的整合与改进，包括保存所有“额外”组分，以便未来若出现新技术时可进一步分离或分析。尽管可采用其他替代方法或试剂盒替代本文所述的个别方法，但本文所列方法已被证实为一种可靠且高效的高通量样本处理手段。在采血后2小时内即可获得高质量的新鲜血液组分（PBMCs、DNA、血清和RNA），所有可用于检测的样本均可在2天内准备就绪（图1）。

本方案旨在高效处理采集自底特律市社区成年居民的样本，用于底特律社区健康研究（Detroit Neighborhood Health Study, DNHS；资助号：DA022720、RC1MH088283、DA022720-05-S1）中的检测。DNHS 是一项基于人群的研究，旨在探讨创伤后应激障碍（PTSD）及其他精神疾病的社会与生物学决定因素。底特律市 PTSD 的患病率超过全国平均水平的两倍11,12识别该人群中 PTSD 的生物学决定因素，可能有助于开发适当的药物和/或认知行为干预措施，以帮助该城市人群及其他高风险人群中患有此障碍的个体。例如， 退伍军人）。我们实验室此前位于密歇根州底特律的韦恩州立大学，因具备处理多种来源新鲜组织样本的专业能力、样本采集后2小时内必须开始处理的要求，以及靠近样本采集点的地理优势，被选中承担样本处理工作。借此独特机会，我们的目标是优化处理流程，以从每份样本中最大限度地获取DNA、RNA、血清和外周血单个核细胞（PBMCs）（共计5轮样本采集，N=1,639份样本）。此处所述操作步骤可在非临床环境中同步实施，从而制备出起始材料（参见 表1 用于多种下游应用，包括微阵列、表观遗传学、实时RT-PCR和流式细胞术分析（以获得平均得率）。

采血与样本处理流程图；从静脉采血到DNA/RNA提取；时间线步骤。
图1. 整体工作流程。 此处所示的整体流程包括从确定同意参与的受试者到实际采血等血液样本获取的各个环节。在采血后2小时内即可从新鲜全血中分离出高质量的多种组分（外周血单个核细胞；PBMCs、DNA、血清和RNA），所有可用于检测的样本均可在2天内准备就绪。此外，若样本无需立即检测，通过本方法制备的各组分适合长期保存。此处概述的整个时间线可在一天内完成（总计约5小时）。然而，对于仅有一名具备丰富技术经验的技术人员而言，这样的一天工作将极为繁重。因此，我们建议在第1天至少由两名技术人员分工操作，并在第2天完成RNA的处理。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

底特律社区健康研究已通过密歇根大学机构审查委员会的审查和批准。所有参与者在参加研究前均签署了知情同意书。

1. 概述

  1. 从招募到终点数据的分析，所有阶段均需进行规范记录。第1天的实验步骤应同时开展，并根据时间安排交替进行各阶段操作，尽可能实现步骤重叠，以优化操作效率。各阶段的顺序已按效率最大化设计。图1展示了整个流程的概览。
    注：全文使用“参与者”一词指代来自知情同意个体的去标识化血液样本。下文括号中的时间为实际操作时间。追踪表和样本记录表的示例分别见于补充表S1和S2。血液样本由采血人员在研究协调员确认的知情同意个体家中采集，随后由快递员运送至实验室（更多预处理细节参见补充信息(SI) 1）。

2. 第1天准备工作

  1. 配制 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。
  2. 将金属浴预热至 56 ºC。
  3. 准备蛋白酶（参见 SI 2），根据当天的样本采集数量（每位受试者 2 管），将 20 µl 分装至相应数量的微量离心管中。
  4. 确保 DNA 提取试剂盒中的 AW1 和 AW2 洗涤缓冲液已准备好待用；如标签所示，必要时加入 100% 乙醇。
  5. 将冷藏离心机预冷至 4 °C。
  6. 将 1× PBS 瓶的瓶盖替换为提供的橡胶隔膜盖，并用转移针穿刺橡胶隔膜，同时保留转移针上方的螺帽以防止蒸发。对 RNA 稳定液瓶重复相同操作。
  7. 在完成缓冲液、离心机和金属浴的准备后，在样本追踪表（参见 表 SI）上记录真空采血管送达的时间。

3. 第1天：全血样本处理以提取DNA、PBMC及白细胞RNA（2小时）

  1. 概述
    1. 为尽量减少采血与开始处理之间的时间延迟，应预留充足的时间。采血后2小时内开始处理含有Ficoll的真空采血管，以避免红细胞污染增加和单个核细胞回收率下降。
    2. 假设采集了2管含有Ficoll密度梯度凝胶的真空采血管，2管含K2 乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管，以及每位成年参与者1管血清真空采血管。真空采血管送达实验室后，由技术人员在追踪单上签字，确认接收样本。立即开始处理，起始时间应按每管真空采血管分别记录于样本日志中。
  2. 血清分离阶段1（1分钟）
    1. 在标本记录单上记录开始时间（参见 表 SI 2）。使用带气溶胶盖的摆动桶转子离心机（生物安全二级，BSL2 认证），在 4 ºC 条件下以 1,300 × g 离心 20 分钟（关闭刹车和加速功能），处理 7.0 ml 血清（红色）真空采血管（每人 1 支）。
  3. DNA提取第一阶段（15分钟）
    注：有关此分离步骤的更多细节，请参见制造商提供的方案13.
    1. 记录开始时间。在生物安全二级（BSL2）细胞培养操作台中，将含有 Ficoll 凝胶的真空采血管轻轻颠倒混匀 5 次，然后从其中一根管的上层取 200 µl 全血，分别加入两份各含 20 µl 蛋白酶的微离心管中（每位受试者共 400 µl）。将含有蛋白酶与血液的微离心管留在操作台内，继续进行 3.4.1 步骤中含 Ficoll 的真空采血管的离心操作。
      注意：使用采集容量最大的真空采血管，同时需考虑离心机平衡的需要（即在执行步骤3.4.1离心真空采血管时，可能需要从每支真空采血管中移除200 µl液体。此外，为确保蓝色真空采血管在处理过程中实现充分分离，管中剩余血液液面应不低于Ficoll层上方2.5英寸。
  4. PBMC 分离第一阶段（1 分钟）
    1. 记录开始时间（必须在采血后2小时内开始，以避免红细胞污染增加和单个核细胞回收率下降）。将含有Ficoll的真空采血管上下颠倒8–10次。使用带气溶胶防护盖（符合BSL2标准）的摆动桶转子，以1,600 × g、22 °C离心30分钟（离心时关闭刹车和加速功能），对真空采血管（每名受试者2管）进行离心。
  5. DNA 提取第二阶段（20 分钟）
    1. 返回生物安全柜，向每个蛋白酶 + 血液微量离心管（步骤 3.3.1）中加入 200 µl AL 缓冲液。盖紧管盖，从生物安全柜中取出，涡旋振荡 15 秒，然后瞬时离心。
    2. 在56 ºC的加热块中孵育10分钟。
    3. 从热块中取出离心管。瞬时离心。放回生物安全二级（BSL2）操作台。加入200 µl 100%乙醇。盖上管盖，从操作台中取出，涡旋振荡15秒，然后瞬时离心。后续步骤可在操作台外完成。
    4. 将裂解液（步骤 3.5.3 后 30 分钟内）加入已标记的离心柱（置于 2 ml 收集管中）。盖紧盖子，防止气溶胶造成交叉污染。6,000 x g 离心 1 分钟。
    5. 弃去含有滤液的收集管，将离心柱放入新的2 ml收集管中。
    6. 向吸附柱中加入500 µl AW1缓冲液，注意不要润湿管口边缘，盖紧管盖，6,000 x g离心1 min。
    7. 弃去含有滤液的收集管，将离心柱放入新的2 ml收集管中。
    8. 向吸附柱中加入500 µl Buffer AW2，注意不要润湿管口边缘，盖紧管盖，20,000 × g离心3分钟。
    9. 弃去含有滤液的收集管，将离心柱放入一个新的1.5 ml收集管（试剂盒中未提供）中，20,000 × g 离心1分钟。
    10. 弃去含有滤液的收集管，将离心柱放入新的1.5 ml收集管（试剂盒中未提供）中。
    11. 向每根柱中加入 200 µl Buffer AE 或水，在室温下孵育 5 分钟。以 6,000 x g 离心 1 分钟。
    12. 重复步骤 3.5.11，洗脱至同一收集管中。
    13. 将每位参与者的2个柱子洗脱下来的DNA合并，总得量约为800 µl。
    14. 在时间允许的情况下，使用分光光度计对样品进行定量。
    15. 根据需要将DNA分装至2 ml冻存管中，并在样本记录表上注明每管的浓度。将冻存管转移至冻存盒中，置于-80 °C条件下长期保存。记录冰箱启动时间。
  6. 白细胞RNA提取第一阶段（30分钟）
    注意：在生物安全二级认证的细胞培养罩中进行操作。有关该分离方法的更多细节，请参见制造商说明书15.
    1. 刺穿K的橡胶隔膜2 EDTA 真空采血管配转移针。保留管套和螺旋盖，用于步骤 3.6.11。遵循 BSL2 标准操作规范，注意避免接触血液传播的病原体。
    2. 将白色滑动接头连接到转移 spike 的顶部。
    3. 用相应的参与者编号标记滤膜，然后将滤膜的进样端（扩口端）连接至白色滑动接头。
    4. 将一个带保护鞘的25⅝ G针头连接到过滤器的出口（锥形端）。建议在给药前预先准备好过滤装置，以显著加快操作流程。推荐操作步骤为：先将白色滑动接头连接至转移穿刺针，然后安装过滤器，再连接带保护鞘的针头，最后将整个装置置于培养管架中备用。
    5. 组装K之后2 EDTA 管系统，安全地卸下针头（使用金属刮刀末端）。将针头刺入一支空的 10 ml 真空采血管（血清接收管）中，并倒置 K2 EDTA 真空采血管/滤器/接收管组件。遵循 BSL2 标准操作规范，注意避免接触血液传播的病原体。
    6. 等待血液过滤，直至滤膜的楔形区域中的血液完全滤过。过滤过程约需2分钟，过滤期间可将滤器置于试管架中。
    7. 从组件中取出滤器。将针头留在含有滤液的管中，将整个组件丢弃至锐器容器中。
    8. 将5 ml注射器连接到1x PBS瓶的转移针上，倒置瓶身，抽取3 ml。
    9. 将装有 PBS 的注射器连接至滤器入口，冲洗滤器（每秒 3–5 滴）。收集滤过液至生物废弃物容器中。从滤器上取下注射器时，不要回抽活塞。
    10. 经过滤和 PBS 洗涤后，使用新的 5 ml 注射器并按照步骤 3.6.8 中所述方法吸取 3 ml RNA 稳定剂。按照步骤 3.6.9 的方法冲洗滤膜，RNA 稳定剂应保留在滤膜上。将注射器从滤膜上拆下时，不要回抽活塞。
    11. 用转移穿刺针上保留的鞘和螺帽密封滤器的入口和出口，使滤器充分浸润于RNA稳定剂中。此时可将滤器储存，置于-80 ºC保存，直至有时间（约2小时）完成步骤5.3至5.4.7。
      注：样本采集后于 -80 ºC 保存长达一年的滤膜，在处理时未出现 RNA 质量下降的情况。
  7. PBMC 分离第二阶段（30 分钟）
    1. 从离心机中取出含有 Ficoll 的真空采血管（步骤 3.4.1），并在 BSL2 生物安全柜中继续操作。真空采血管应显示如下的分层现象： 图2。如果未找到，请参见 表2.
    2. 将真空采血管放回生物安全二级柜后，取下管塞，吸取顶部1.5 ml黄色血浆层图2使用移液管将血浆转移至5 ml 冻存管中，注意避免接近单个核细胞层（透明/白色层）。合并2个真空采血管的血浆（来自1名受试者）。记录所收集的血浆体积。储存方法见步骤3.7.6。
      注意：在采血前至少禁食12小时的参与者，其外周血单个核细胞的分离效果最佳，得率最高。
    3. 转移剩余的血浆和白色单个核细胞层（凝胶层以上的所有成分）—— 图2使用移液管将每个参与者两支含Ficoll的真空采血管中的单个核细胞层合并收集至一个15 ml锥形管中。
    4. 加入1x PBS，使锥形管中的总体积达到15 ml。盖紧管盖，倒置混匀5次。离心（关闭刹车和加速度）15分钟，300 x g，22 °C。
    5. 返回生物安全柜中的含Ficoll的真空采血管，用一支5¾”巴斯德吸管轻轻搅动以松动Ficoll凝胶层外周，尽可能去除凝胶层，收集红细胞（RBCs）。使用移液管收集红细胞（约4.5 ml）并转移至一支5 ml冻存管中。记录所收集的体积。
    6. 将两个5 ml冻存管（步骤3.7.2中的血浆和步骤3.7.5中的红细胞）转移至程序降温盒中，置于-80 °C冰箱至少24小时，之后可转移至冻存盒中，再返回-80 °C长期保存。
    7. 当步骤 3.7.4 的离心完成后，将锥形管放回生物安全柜，用移液器吸去除约 500 µl PBS 外的上清液，注意不要扰动沉淀。此步骤中若在沉淀上方保留约 200 µl PBS，可获得更高的 PBMC 产量。
    8. 加入新鲜的1×PBS至终体积为10 ml，轻轻重悬沉淀。盖紧管盖，倒置5次。离心（关闭刹车和加速），300 × g，22 °C，10分钟。
  8. 血清分离阶段2（10分钟）
    注意：在生物安全二级（BSL2）通风柜中操作。
    1. 离心后（步骤 3.2.1），根据需要将血清真空采血管中上层血清分装至 2 ml 冻存管中。典型产量为 2.5 ml（表1）。记录体积。例如，使用4个冻存管，分别分装：冻存管1中加入200 µl，冻存管2中加入1,000 µl，剩余体积均分至冻存管3和冻存管4。
    2. 将冻存管转移至冻存盒中，并置于 -80 ºC 用于长期保存。记录冰箱启动时间。
  9. PBMC 分离阶段 3（15 分钟）
    1. 返回生物安全柜，在离心后（步骤 3.7.8），尽可能吸除上清液/PBS，注意不要扰动沉淀。通过移液将沉淀重悬于 2.5 ml PBMC 冻存液 1 中（参见 SI 2).
    2. 加入2.5 ml PBMC冻存液2（参见 SI 2将步骤 3.9.1 中的细胞/培养基溶液涡旋混匀。
    3. 将10 µl细胞悬液移入0.65 ml微量离心管中（必要时可进一步稀释）。向该0.65 ml微量离心管中加入10 µl 0.4%台盼蓝染液，反复吹打数次以混匀。更多细节请参见试剂生产商说明书16.
    4. 将10 µl混合液移入细胞计数板载玻片中，并在混合后3分钟内将载玻片放入细胞计数仪。放大并聚焦细胞，按下“Count Cells”以获取PBMC细胞数量。
    5. 若活细胞数超过每毫升300万个细胞（mc/ml），则根据需要分装至冻存管中，并继续进行步骤3.9.9。将PBMC分装至最多5个冻存管中，每管浓度至少为3 mc/ml。
    6. 如果活细胞数低于 3 mc/ml，通过将每毫升活细胞数乘以 5 ml 计算细胞总数。再将该数值除以 4、3、2 或 1 ml，以确保至少有一管细胞浓度达到 3 mc/ml。
    7. 将含有细胞/冻存液的锥形管在300 × g下离心5分钟（关闭刹车和加速功能）。离心结束后，吸除相应体积的冻存液（上清），保留上述计算出的体积（4、3、2或1 ml）。
    8. 将沉淀物重悬于剩余的上清液中，并将至少3 mc/ml分装至适量的冻存管（1-4支）中，每管1 ml。最终冻存液组成为10%二甲基亚砜（DMSO）/20%胎牛血清（FBS）/70% RPMI 1640培养基。
    9. 记录每支冻存管中的细胞数量。将冻存管放入程序降温盒中，置于-80 °C环境中至少24小时，随后可转移至冻存盒，并存入液氮罐（气相）中长期保存。记录冻存起始时间。

4. 第二天实验设置

  1. 在热块中，将无核酸酶的0.1 mM EDTA溶液（每滤膜220 µl）分装至无核酸酶管中，加热至80 °C。
  2. 配制洗涤液1和洗涤液2（参见SI 2）。

5. 第2天：长期样本保存与白细胞过滤处理（3小时）

  1. 概述。
    1. 在白细胞施加到滤膜后的6个月内进行此操作。
      注意：总体而言，第2天的处理过程大约需要3小时。尽管标记为“第2天”，关键要求是滤膜处理部分必须安排在实验室不进行第1天处理操作的某一天进行。
  2. 长期样品保存（15 分钟）
    1. 每天在将新的真空采血管送至实验室进行第1天处理之前执行此操作。将第1天存放在程序降温盒中过夜的冻存管转移至相应标记的冻存盒中，并放回-80 °C或液氮（气相）中长期保存。根据样本类型对冻存管进行分类整理（例如， DNA、PBMC、RBCs 等等。以加快终点检测中样本位置的追踪。
  3. 白细胞RNA滤膜处理（45分钟）
    注意：有关本操作步骤的更多信息，请参阅制造商的说明书17.
    1. 将滤器恢复至室温（解冻约5分钟）。
    2. 移除滤器的保护套管和螺帽。将5 ml注射器的推杆拉回，连接到滤器的入口端（扩口端），推动推杆以排出RNA稳定剂 从滤器端口排入生物废液容器中。
    3. 用一个新的5 ml注射器吸取4 ml用于RNA分离的苯酚和异硫氰酸胍溶液，将其连接到滤器入口，推动活塞使溶液通过滤器，将裂解液收集到已标记的15 ml锥形管中（每位参与者2管）。
    4. 将注射器从滤器上取下，拉回活塞，再将注射器重新连接至滤器，推动活塞，将滞留在滤膜中的剩余样品排入同一支15 ml离心管中。弃去滤器和注射器。
    5. 向锥形管中加入800 µl BCP，盖紧管盖，剧烈振荡30秒。
    6. 室温孵育5分钟。以2,000 × g离心10分钟。
    7. 将水相（上层）转移至新标记的15 ml锥形管中（约2.5 ml）。
    8. 加入与水相体积0.5倍的无核酸酶水，充分混匀。然后加入水相体积1.25倍的100%乙醇，再次混匀。
      注意：对于 2.5 ml 水相体积，加入 1.25 ml 无核酸酶水，混匀，然后加入 4.7 ml 100% 乙醇（2.5 ml × 0.5 = 1.25 ml 无核酸酶水，然后 2.5 ml + 1.25 ml = 3.75 ml 新的水相体积，再乘以 1.25 得 3.75 ml × 1.25 = 4.7 ml 100% 乙醇）。此步骤可实现包含小 RNA 组分在内的总 RNA 分离。如需去除小 RNA 的分离方法，请参阅说明书。17.
    9. 从5 ml注射器中取出活塞，并将离心柱插入其中替代活塞。将离心柱/注射器组件连接至真空泵多联管。为使与真空泵多联管的连接更牢固，可将离心柱/注射器组件置于底部已切去的1.5 ml 微离心管内。
    10. 将步骤5.3.8中的样品在开启真空的条件下缓慢加入离心柱中，并在样品被吸入柱内的过程中小心地继续添加更多样品。
      注意：若无真空条件，请参见以下网址提供的离心方法：http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf。
    11. 将离心柱转移至一个1.5 ml 微离心管中，加入750 µl 洗涤液1。将离心柱/管组件在12,000 x g离心5–10秒。
    12. 弃去管中的滤液，将离心柱放回原来的微量离心管中。
    13. 加入750 µl Wash 2，于12,000 x g离心旋转柱/管5–10秒。弃滤液，操作同5.3.12步骤。将旋转柱放回原微量离心管中。
    14. 用另外750 µl洗液2重复步骤5.3.13的洗涤和离心操作。弃去滤液。将离心柱放回原先的微量离心管中。以最大转速离心离心柱/管1分钟，以干燥滤膜。
    15. 将离心柱转移至一个新的、已标记的1.5 µl 微离心管中。
    16. 向离心柱过滤器中心加入 200 µl 无核酸酶的 0.1 mM EDTA（预热至 80 °C）（每位参与者使用 2 个）。室温孵育 1 分钟。
    17. 以12,000 × g离心1分钟以洗脱RNA。保留滤液。弃去离心柱。
    18. 将每份200 µl滤液均分为两份，每份100 µl，分装至新的1.5 ml微量离心管中，标记并置于冰上。此时，每位参与者从2个滤膜开始处理，可获得四份100 µl的RNA样品。
  4. DNase 处理（1 小时）
    注：有关此处理的更多细节，请参见制造商的实验方案18.
    1. 通过将每份样品加1（用于补偿移液误差）所需的10 µl DNase I缓冲液与2 µl rDNase I混合，制备主混合液。
      注意：对于四个样品，每个100 µl样品使用50 µl DNase I缓冲液加10 µl rDNase I。
    2. 将第5.4.1步中的12 µl主混合液分装至第5.3.18步所得的各RNA等分试样中，轻轻混匀。在加热块中37 °C孵育30分钟。
    3. 涡旋混匀DNase失活试剂，向每份样品中加入11.2 µl，充分混匀。室温孵育2分钟，在孵育过程中涡旋混匀2–3次。
    4. 在 10,000 × g 条件下离心 1.5 分钟。
    5. 将上清液（RNA）转移至新的1.5 ml离心管中。来自同一受试者的样本可在此步骤合并。
    6. 使用分光光度计检测每个样品以获取浓度。建议使用Bioanalyzer对RNA进行质量分析（参见步骤5.5）。
    7. 将RNA按需分装至冻存管中。若不立即进行Bioanalyzer分析，需将1.5 µl样本分装至微量离心管中以备后续分析。记录各样本的浓度及放入冷冻机的时间。将样本储存于-80 °C条件下。
  5. Bioanalyzer 分析（1 小时）
    1. 遵循制造商的说明书19运行结束后，数据将自动保存，但需另存为更简短、更易识别的文件名。预期结果（图3）：标准品应呈现6个峰，样品应呈现3个峰（分别在25秒处出现1个早期标记峰，以及在44秒和50秒处出现2个核糖体峰）。

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结果

整个实验流程必须能够产出高质量的材料，以用于多种下游应用，包括通过微阵列和RT-PCR分析进行基因表达检测、表观遗传修饰的检测以及细胞亚群差异分析。表1列出了各实验步骤所得材料的平均产量和质量。图3展示了白细胞RNA分离及滤膜处理方法所得产物质量的一个示例。图3左上方为毛细管电泳所得凝胶图像，每条泳道应出现两条清晰的条带，且拖尾现象最小，若出现明显拖尾则提示存在降解。凝胶下方的色谱图可进一步显示降解的程度和类型，这些信息可通过峰的位置和大小进行判断。RNA完整性数（RIN）是另一种质量评估指标，其数值范围为1（低质量，严重降解）至10（高质量，纯度高，RNA完整）。

这种高通量方法偶尔可能出现误差，但在处理的各个阶段均设有多个质控检查点以确保质量控制。图2展示了含有Ficoll的真空采血管经离心后应有的分层情况。真空采血管未能显示该分层现象的原因可能有多种，包括离心速度错误、采集血量过少，或受试者未按要求空腹（见表2

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讨论

我们已描述了一种简化的实验流程，该流程已成功应用于底特律社区健康研究（Detroit Neighborhood Health Study）中超过1600份全血样本的处理。尽管其中许多技术在现有文献中已有报道，但我们提供的逐步整合方案，包括各步骤之间精确的时间控制，体现了一种经过优化且高效的流程，能够成功制备多种可用于下游分析的生物样本，包括DNA甲基化、mRNA表达及免疫学分析等。这些样本已在多种实验中得到验证，相关结果已发表于同行评审期刊或在全国性学术会议上报告11,20,21,23,24,29。因此，本方案对于其他计划在类似底特律社区健康研究（DNHS）的人群研究中收集生物样本的研究人员具有参考价值。

以高通量方式处理样本时，确保所有阶段记录的准确性至关重要。我们建议在项目初期即建立一个数据库，用于存储所有冻存管的全部信息。该数据库应包含每个冻存管内样本的各项参数，如体积、浓度、质量、条形码以及储存位置（储存盒编号及管子在盒内的具体位置）。我们建议预先标记带有条形码的冻存管和储存盒。此外，我们发现准备一份“主”文档非常方便，其中按每位参与者分别列出各冻存管...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

我们衷心感谢Henriette Mair-Meijers在细节处理上的宝贵投入以及在血液样本处理工作中所花费的大量时间。我们感谢Natalie Jameson Kiesling在平面设计方面的专业支持。同时，我们感谢文中提及的制造商（Qiagen（美国加利福尼亚州瓦伦西亚）、BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）、Life Technologies（美国纽约州格兰岛））批准我们发表其产品的使用情况。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金项目（资助号：DA022720、RC1MH088283 和 DA022720-05-S1）的慷慨资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QIAamp DNA 血液微量提取试剂盒Qiagen51104第1天：DNA提取
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP5493-1L第1天：PBMC分离
5 ¾” 巴斯德吸管Fisher13-678-6A第1天：PBMC分离
胎牛血清（FBS），热灭活Life Technologies10082147第1天：PBMC分离
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD8418-500ml第1天：PBMC分离
RPMI 1640 培养基，液体Invitrogen11875119第1天：PBMC分离
0.4% 台盼蓝染液 InvitrogenT10282第1天：PBMC分离
Countess 细胞计数板InvitrogenC10283第1天：PBMC分离
Countess 自动细胞计数器或显微镜和血细胞计数板等细胞计数设备InvitrogenC10281第1天：PBMC分离
白细胞富集分离 & 稳定化试剂盒 Ambion1933第1天：白细胞RNA提取
25 G × 5/8 英寸针头Becton Dickinson305122第1天：白细胞RNA提取
注射器（5 毫升Becton Dickinson309646第1天和第2天：白细胞RNA提取
变性裂解液 Ambion8540G第2天：白细胞RNA提取
5 M NaClLife Technologies24740011第2天：白细胞RNA提取
TRI ReagentAmbion9738第2天：白细胞RNA提取
溴氯丙烷（BCP）SigmaB-9673第2天：白细胞RNA提取
离心柱 Ambion10051G第2天：白细胞RNA提取
0.1 mM EDTAAmbion9912第2天：白细胞RNA提取
无DNA试剂盒AmbionAM1960第2天：DNase 处理
RNA 6000 Ladder 安捷伦5067-1529第2天：Bioanalyzer分析
RNA 6000 Nano Series II 试剂盒 安捷伦5067-1511第2天：Bioanalyzer分析
RNaseZAPAmbionAM8782第2天：Bioanalyzer分析
乙醇 >99%SigmaE7023-500ml
异丙醇 >99% SigmaI9516-500ml
无核酸酶超纯水 Invitrogen9938
去核酸酶枪头（nuclease-free）Eppendorf22491253
移液器（血清学）Eppendorf2223020-4
移液器（用于1以下体积） 毫升Eppendorf3120000-054
移液管（血清学）Fisher13-678-27E
程序降温冻存容器Nalgene5100-0001
冻存管盒（用于放置 2 毫升和5 毫升冻存管和1.5 毫升微量离心管Fisher03-395-464
试管架赛默飞世尔科技14-804-134
15 毫升聚丙烯管Fisher14-959-49D
1.5 毫升和0.65微离心管Fisher07-200-534 和 07-200-185
2 毫升和5 毫升冻存管Fisher10-500-26 和 10-269-88F 
8 ml CPT 真空采血管BD Biosciences3627612 支试管
6 毫升 K2 EDTA 真空采血管BD生物科学3678632 支试管
8.5 ml SST 真空采血管BD 生物科学3679881 支离心管
涡旋振荡器Fisher2215365
用于微量离心管的干浴恒温孵育器及加热模块Fisher11-715-1250
用于细胞培养操作台内的过滤/真空系统Fisher01-257-87
用于微量离心管的固定角转子，带气密盖Eppendorf22637002
带摆动桶式转子和气密性盖子的冷冻离心机，适用于16 x 125 mm 真空采血管和 15 毫升聚丙烯管Eppendorf226281572，其中一个无需冷藏
Nanodrop 2000（推荐用于小体积样品的精确测量）或其他分光光度计设备Fisher13-400-411
安捷伦生物分析仪安捷伦科技G2940CA
液氮罐赛默飞世尔科技11-676-56
锐器盒Fisher22-037-970
生物废弃物容器赛默飞世尔科技1223P52
生物安全等级2  经认证的细胞培养罩赛默飞世尔科技13-261-315

参考文献

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DNA RNA

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