本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。
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本文内容
摘要
摘要
RNA/蛋白质相互作用对于转录后调控通路至关重要。在已知的细胞质RNA结合蛋白中，研究最为清楚的是铁调节蛋白（IRP1和IRP2）。它们可结合到多个靶mRNA非翻译区（UTRs）中的铁反应元件（IREs），从而调控这些mRNA的翻译或稳定性。IRE/IRP相互作用通常通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）进行广泛研究。本文描述了用于分析IRP1和IRP2结合IRE活性的EMSA实验方案，该方法也可推广用于评估其他RNA结合蛋白的活性。将含有RNA结合蛋白的粗制蛋白裂解液或该蛋白的纯化样品，与过量的32 P标记RNA探针共同孵育，以形成复合物。加入肝素以阻止非特异性蛋白与探针的结合。随后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。游离探针迁移较快，而RNA/蛋白复合物迁移受阻，因此该方法也被称为“凝胶阻滞”或“条带迁移”实验。电泳完成后，将凝胶干燥，通过放射自显影检测RNA/蛋白复合物及游离探针。本实验方案的总体目标是检测并量化IRE/IRP以及其他RNA/蛋白相互作用。此外，EMSA还可用于确定所研究RNA/蛋白相互作用的特异性、结合亲和力以及化学计量比。
引言
EMSA 最初被开发用于研究DNA结合蛋白与靶DNA序列的相互作用1,2。其原理同样适用于RNA/蛋白质相互作用3，这也是本文的重点。简而言之，RNA带负电荷，在非变性聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶电泳中会向阳极迁移。RNA在凝胶中的迁移速率取决于其大小，且与其电荷成正比。蛋白质与RNA特异性结合后会改变其迁移速率，导致复合物的迁移速度比游离RNA更慢。这主要归因于分子质量的增加，也可能与电荷和构象的变化有关。使用标记的RNA作为探针，可方便地监测“凝胶阻滞”或“条带迁移”现象。采用32P标记的RNA探针非常普遍，具有高灵敏度。RNA/蛋白质复合物和游离RNA的迁移可通过放射自显影进行检测。但该方法的缺点包括32P的半衰期较短（14.29天）、探针因辐射分解而逐渐降解、需要放射性操作许可及相关基础设施，以及潜在的生物安全问题。因此，已发展出多种非同位素标记RNA探针的方法，例如使用荧光染料或生物素标记，可通过荧光或化学发光成像进行检测4,5。这些方法的局限性在于成本较高，且通常灵敏度低于同位素标记，此外非同位素标记可能干扰RNA/蛋白质相互作用。非变性聚丙烯酰胺凝胶适用于大多数EMSA应用，是常用选择。在某些情况下，琼脂糖凝胶也可用于分析较大的复合物。
EMSA 的主要优势在于其兼具简便性、高灵敏度和稳健性4。该检测可在数小时内完成，且无需复杂的仪器....
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方案
小鼠实验程序已获得麦吉尔大学动物护理委员会（协议编号 4966）的批准。
1. 培养细胞中蛋白质提取物的制备
- 用 10 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养细胞两次。
- 用橡胶刮棒或塑料细胞刮刀在 1 ml 冰冷 PBS 中刮下贴壁细胞，将悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。
- 在 4 °C 下，以 700 x g 离心 5 min，吸除 PBS。
- 每 107 个细胞加入 100 μl 冰冷的细胞质裂解缓冲液（表 1），用移液器吹打混匀。
- 冰上孵育 20 min。
- 在 4 °C 下，于微量离心机中以最大速度离心 10 min。
- 弃去沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，置于冰上保存。
- 使用 Bradford 法测定蛋白浓度（通常为 1 - 10 μg/μl）23。
- 分装后于 -80 °C 保存细胞提取物，直至使用。
2. 小鼠肝脏和脾脏蛋白质提取物的制备
- 通过吸入 CO2 处死小鼠。 ....
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结果
按照方案第3和第4节所述，制备了放射性标记的IRE探针。探针序列为5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'；其中加粗的核苷酸代表一个未配对的C残基和环状结构，是IRE的关键特征。该探针的比放射性为4.5 × 109 cpm/μg RNA。
为了评估铁水平变化对IRE结合活性的影响，将小鼠RAW264.7巨噬细胞分别置于未处理状态，或用血红素（铁来源）或去铁胺（铁螯合剂）处理。制备细胞裂解液，并使用IRE探针（8,000 cpm/μg蛋白）进行EMSA分析。代表性数据如图1所示，左侧和右侧图分别显示放射自显影的短时间与长时间曝光结果。小鼠IRE/IRP1和IRE/IRP2复合物具有不同的迁移率，在第1泳道中可见两条不同的条带，对应于未处理细胞。铁螯合显著增强了IRP1和IRP2的IRE结合活性（第2泳道），而铁补充则使其减弱（第3泳道）。用2% 2-ME预处理可完全.......
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讨论
本文介绍了一种用于研究IRP1和IRP2的IRE结合活性的实验方案，并展示了代表性数据。通过使用不同的探针，该方案也可调整用于其他RNA结合蛋白的研究。其中关键步骤之一是探针的长度。当结合位点未知时，常使用较长的探针对目标进行检测，但这可能导致RNA/蛋白复合物与游离RNA在迁移率上无明显差异。在此情况下，建议使用RNA酶T1处理以去除未结合的RNA。步骤 6.6）。探针的质量也非常重要。使用新近制备的放射性标记RNA可获得最佳结果。凝胶纯化10 不是必需的，但如果能改善EMSA的外观，则可以采用 体外 用于探针制备的转录反应会产生提前终止产物（若未包含RNA酶T1消化步骤）。原生凝胶电泳运行过快可能导致过热，从而引起RNA/蛋白质复合物解离，产生模糊条带。
通过磷屏成像分析滞留条带的强度，可以获得定量结果。只有当RNA探针过量且不成为RNA结合反应的限制因素时，定量结果才有效。RNA/蛋白质相互作用的亲和力可用解离常数Kd表示，该常数与自由能ΔGo相关，可通过逐步.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-86514）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 亮抑蛋白酶肽 | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad 蛋白定量试剂盒 | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA 聚合酶 | Thermoscientific | EPO111 | |
| RNase 抑制剂 | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H | |
| 闪烁液 | Beckman Coulter | 141349 | |
| 肝素 | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| 仪器名称 | |||
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| 闪烁计数器 | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi 电泳槽 | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 孔梳子 | BIORAD | 165-1868 | 1.5 mm 厚 |
| 1.5 mm 间隔器 | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
参考文献
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
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重印与许可
