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凝胶电泳迁移分析（EMSA）为RNA，蛋白质相互作用的研究：IRE / IRP示例

DOI：

10.3791/52230

⸱

2014年12月3日

 ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

本文内容

摘要

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在这里，我们提出了一个协议分析RNA /蛋白质相互作用。电泳迁移实验（EMSA）是基于RNA的/蛋白复合物和游离RNA在天然凝胶电泳迁移差异上。通过使用放射性标记的RNA探针，RNA /蛋白质复合物可以通过放射自显影进行显现。

摘要

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RNA /蛋白质相互作用是转录后调控途径的关键。间的最佳表征的胞质RNA结合蛋白是铁调节蛋白 ，IRP1和IRP2。它们结合到铁几个靶mRNA的非翻译区（UTR）内响应元件（IRES），从而控制的mRNA翻译或稳定性。 IRE / IRP的相互作用已被广泛研究了EMSA。在这里，我们描述了EMSA协议用于分析IRP1和IRP2的IRE结合活性，这可以推广到其他评估RNA结合蛋白的活性。含有一种RNA结合蛋白，或纯化此蛋白质的制备的粗蛋白裂解物，孵育用过量的32 P标记的RNA探针，从而允许形成复合物。肝素加入到排除非特异性蛋白探查结合。随后，将混合物通过在聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳分析。免费探头迁移速度快，而所述RNA /蛋白质复合物表现出延迟的流动性;因此，该过程也被称为“凝胶阻滞”或“条带迁移”测定法。电泳结束后，将凝胶干燥和RNA /蛋白质复合物，以及游离的探针，通过放射自显影检测。该协议的总体目标是检测和量化的IRE / IRP和其它RNA /蛋白质相互作用。此外，EMSA也可用于确定特异性所研究的RNA /蛋白质相互作用，结合亲和力和化学计量。

引言

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在EMSA最初被开发，研究DNA结合蛋白与靶DNA序列1,2的关联。其原理是类似的RNA /蛋白质相互作用3，这是本文的重点。简言之，RNA被带负电荷并朝向阳极期间非变性电泳聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶将迁移。凝胶内的迁移取决于核糖核酸，其正比于它的电荷的大小。相比于自由RNA特异性的蛋白质的RNA的结合改变其流动性，且复杂的迁移变慢。这主要是由于增加的分子量，而且要在电荷和可能的构象的改变。利用RNA标记为探针，可以方便地监控了“凝胶阻滞”或“条带迁移”的。的32 P标记的RNA探针的使用是很常见的，并提供高灵敏度。被检测的RNA /蛋白质复合物和游离RNA的迁移通过放射自显影。缺点是：32 P（14.29天），探针的质量由于辐逐渐恶化的半衰期短，一个放射性许可证和基础设施为放射性工作，以及潜在的生物安全的担忧的要求。因此，已经开发了替代非同位素方法用于标记的RNA探针，例如用荧光团或生物素，其能够检测由荧光或化学发光成像4,5。这些方法的局限性是成本较高并且经常敏感性降低相比同位素标记和非同位素标记物的潜在干扰的RNA /蛋白质相互作用。非变性聚丙烯酰胺凝胶适用于大多数应用EMSA和常用。有时，琼脂糖凝胶可能造成的大型复合物的分析，另一种选择。

EMSA的主要优点在于，它结合了简单，灵敏度和鲁棒性4 </ SUP>。该测定可以在几个小时内完成....

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方案

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小鼠实验程序批准了麦吉尔大学（协议4966）的动物护理委员会。

1.准备从培养细胞蛋白提取物

  1. 用10毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗两次培养的细胞。
  2. 刮贴壁细胞与任一橡皮或塑料细胞刮棒在1ml冰冷的PBS，转印悬浮到1.5ml微量离心管中。
  3. 旋在微量离心5分钟，于700×g离心，于4℃。吸PBS。
  4. 加入100微升冰冷的细胞质裂解缓冲液（ 见表1）每10 7个细胞，并吸取向上和向下。
  5. 在冰上孵育20分钟。
  6. 旋，在4℃下以全速10分钟在微量。
  7. 丢弃沉淀。上清转移到新的1.5 ml离心管，并保持在冰上。
  8. DET使用Bradford法23 - （10微克/微升通常1）貂皮蛋白浓度。
  9. 等分试样并储存细胞提取物在-80℃下直到使用。

2.准备从小鼠肝脏和脾脏蛋白提取物

  1. 安乐死鼠标使用CO 2吸入。
  2. 奠定安乐死的动物在一块干净的纱布在解剖板。打开用剪刀腹部。
  3. 解剖肝脏和脾脏用剪刀和镊子，并冲洗在大约50毫升的冰冷的PBS各组织。
  4. 立即切割组织切成小块，用手术刀（例如：约1 - 2

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结果

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放射标记的IRE探针制备，如在第3和第4的协议的说明。所述探针的序列为5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGÇUUCAAÇAGUGC UUGGA CGGAUCCU-3';粗体的核苷酸代表一个未配对的C残基和环，这是至关重要的IRE特征。探针的比放射性为4.5×10 9的cpm / RNA微克。

评估铁扰动对IRE结合活性的影响，鼠的RAW264.7巨噬细胞不进行治疗，或者与血红素（铁源）或去铁胺（铁螯合剂）处理。制备和EMSA与IRE探头（8000 CPM /微克蛋白）分析裂解液。代表性数据显示于图1，用放射自显影对左右面板较短和较长的曝光，分别。鼠IRE / IRP1和IRE / IRP2复合物表现出不同的流动性和两个不同频段在泳道1可见，相应于未经处理的细胞。铁螯合深刻诱导既IRP1和IRP2（泳道2）的IRE-结合活性，而补铁减少他们（泳道3）。预处理用2％2-ME的完全激活IRP1（底部面板），即使是在铁处理的细胞的提取物。这表明，铁扰动不要IR.......

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讨论

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在此，我们描述了已开发研究IRP1和IRP2的IRE结合活动的协议，并且我们显示代表性数据。通过使用不同的探针，该协议也可以被用于其它RNA结合蛋白的研究调整。一个关键步骤是探针的大小。用法长探针，这是共同的时，确切的结合位点是未知的，可能会导致的RNA /蛋白质复合物不不同迁移比游离的RNA。在这种情况下，最好是通过用RNA酶T1（ 步骤6.6）处理以去除未结合的RNA。探针的质量也很重要。最好的结果是用新鲜配制放射性标记的RNA获得。凝胶纯化10不是必要的，但可以提高EMSA的外观，如果用于探针制备在体外转录反应产生过早终止的产品（如果没有RNA酶T1消化步骤是包括在内）。运行天然凝胶电泳太快米AY导致过热，这可能导致的RNA /蛋白质复合物解离，从而导致模糊的频带。

定量的结果可以通过分析滞后条带磷光的强度而获得。量化值是唯一有效的，当RNA探针过量存在，并且不限制为RNA结合。将RNA /蛋白质相互作用的亲和力，通过链接到自由能ΔGÒ的解离常数K D时 ，可.......

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披露

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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这项工作得到了加拿大卫生研究院 （MOP-86514） 的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亮肽素SIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad 蛋白质测定BIORAD500-0006
T7 RNA 聚合酶热科学EPO111
RNase 抑制剂Invitrogen15518-012
UTP [α-32P]珀金-埃尔默
闪烁液贝克曼库尔特141349
肝素SIGMAH0777
Rnase T1热科学EN0541
设备
组织破裂器Qiagen9001271
闪烁计数器贝克曼库尔特LS6500
Protean II 习 细胞BIORAD165-1834
20 孔 电泳梳BIORAD165-18681.5 mm 厚
1.5 mm 垫片BIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070
NEG507H名称

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A.

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标签

RNA Bradford

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