需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

53.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52230

⸱

2014年12月3日

 ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

本文内容

摘要

本文介绍了一种分析RNA/蛋白质相互作用的实验方案。电泳迁移率变动分析（EMSA）基于RNA/蛋白质复合物与游离RNA在非变性凝胶电泳中迁移速率的差异。通过使用放射性标记的RNA探针，可利用放射自显影技术对RNA/蛋白质复合物进行可视化检测。

摘要

RNA/蛋白质相互作用对于转录后调控通路至关重要。在已知的细胞质RNA结合蛋白中，研究最为清楚的是铁调节蛋白（IRP1和IRP2）。它们可结合到多个靶mRNA非翻译区（UTRs）中的铁反应元件（IREs），从而调控这些mRNA的翻译或稳定性。IRE/IRP相互作用通常通过凝胶迁移阻滞实验（EMSA）进行广泛研究。本文描述了用于分析IRP1和IRP2结合IRE活性的EMSA实验方案，该方法也可推广用于评估其他RNA结合蛋白的活性。将含有RNA结合蛋白的粗制蛋白裂解液或该蛋白的纯化样品，与过量的32 P标记RNA探针共同孵育，以形成复合物。加入肝素以阻止非特异性蛋白与探针的结合。随后，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。游离探针迁移较快，而RNA/蛋白复合物迁移受阻，因此该方法也被称为“凝胶阻滞”或“条带迁移”实验。电泳完成后，将凝胶干燥，通过放射自显影检测RNA/蛋白复合物及游离探针。本实验方案的总体目标是检测并量化IRE/IRP以及其他RNA/蛋白相互作用。此外，EMSA还可用于确定所研究RNA/蛋白相互作用的特异性、结合亲和力以及化学计量比。

引言

EMSA 最初被开发用于研究DNA结合蛋白与靶DNA序列的相互作用1,2。其原理同样适用于RNA/蛋白质相互作用3，这也是本文的重点。简而言之，RNA带负电荷，在非变性聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶电泳中会向阳极迁移。RNA在凝胶中的迁移速率取决于其大小，且与其电荷成正比。蛋白质与RNA特异性结合后会改变其迁移速率，导致复合物的迁移速度比游离RNA更慢。这主要归因于分子质量的增加，也可能与电荷和构象的变化有关。使用标记的RNA作为探针，可方便地监测“凝胶阻滞”或“条带迁移”现象。采用32P标记的RNA探针非常普遍，具有高灵敏度。RNA/蛋白质复合物和游离RNA的迁移可通过放射自显影进行检测。但该方法的缺点包括32P的半衰期较短（14.29天）、探针因辐射分解而逐渐降解、需要放射性操作许可及相关基础设施，以及潜在的生物安全问题。因此，已发展出多种非同位素标记RNA探针的方法，例如使用荧光染料或生物素标记，可通过荧光或化学发光成像进行检测4,5。这些方法的局限性在于成本较高，且通常灵敏度低于同位素标记，此外非同位素标记可能干扰RNA/蛋白质相互作用。非变性聚丙烯酰胺凝胶适用于大多数EMSA应用，是常用选择。在某些情况下，琼脂糖凝胶也可用于分析较大的复合物。

EMSA 的主要优势在于其兼具简便性、高灵敏度和稳健性4。该检测可在数小时内完成，且无需复杂的仪器设备。EMSA 能在低至 0.1 nM 或更低的浓度下检测 RNA/蛋白质相互作用，并可在较宽范围的结合条件下进行（pH 4.0 - 9.5，一价盐浓度 1 - 300 mM，温度 0 - 60 °C）。

RNA/蛋白质复合物的形成也可通过滤膜结合实验进行研究。该方法是一种简单、快速且经济的实验技术，其原理基于RNA/蛋白质复合物会被硝酸纤维素滤膜截留，而游离的RNA探针则能通过滤膜6。与凝胶迁移阻滞实验（EMSA）相比，当RNA探针包含多个结合位点，或粗提物中含有多种可结合于同一探针位点的RNA结合蛋白时，滤膜结合实验的应用受到限制。多种RNA/蛋白质相互作用在滤膜结合实验中难以被检测，但可通过EMSA轻松观察到。在某些情况下，即使两种RNA/蛋白质复合物在凝胶中共同迁移（例如人IRP1/IRE和IRP2/IRE复合物），也可通过在EMSA反应中加入针对其中一种RNA结合蛋白的抗体，使复合物在凝胶中的迁移进一步减缓（“超迁移”现象），从而实现区分和可视化7。

电泳迁移率变动分析（EMSA）已被广泛用于研究铁代谢的转录后调控因子IRP1和IRP28-10。它们通过结合到某些mRNA非翻译区（UTR）中进化上保守的发夹结构——即铁响应元件（IRE）发挥作用11。IRE最初在编码铁蛋白12和转铁蛋白受体1（TfR1）13的mRNA中被发现，这两种蛋白分别参与铁的储存与摄取。随后，IRE也在红细胞特异性氨基乙酰丙酸合酶（ALAS2）14、线粒体顺乌头酸酶15、铁转运蛋白16、二价金属转运蛋白1（DMT1）17、缺氧诱导因子2α（HIF2α）18以及其他mRNA中被发现19-21。典型的H链和L链铁蛋白mRNA在其5’ UTR中含有一个IRE，而TfR1 mRNA则在其3’ UTR中含有多个IRE。IRE与IRP的相互作用通过空间位阻阻止43S核糖体亚基与mRNA结合，从而特异性抑制铁蛋白mRNA的翻译；此外，该相互作用还能稳定TfR1 mRNA，防止其被核酸内切酶降解。IRP1和IRP2具有高度的序列相似性，在缺铁细胞中均表现出强烈的IRE结合活性。在富铁细胞中，IRP1会组装一个立方八面体形的Fe-S簇，使其转化为胞质顺乌头酸酶，同时丧失IRE结合能力；而IRP2则通过蛋白酶体途径被降解。因此，IRE/IRP相互作用依赖于细胞内的铁状态，但也受到其他信号分子的调控，如H2O2、一氧化氮（NO）或缺氧。本文描述了利用粗制细胞和组织提取物通过EMSA检测IRE结合活性的实验方案。我们使用了一个通过体外转录从质粒DNA模板（I-12.CAT）生成的32P标记的H链铁蛋白IRE探针，该模板中的IRE序列最初是通过退火合成寡核苷酸的克隆，以正向插入至T7 RNA聚合酶位点下游而构建的22。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

小鼠实验程序已获得麦吉尔大学动物护理委员会（协议编号 4966）的批准。

1. 培养细胞中蛋白质提取物的制备

  1. 用 10 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养细胞两次。
  2. 用橡胶刮棒或塑料细胞刮刀在 1 ml 冰冷 PBS 中刮下贴壁细胞，将悬液转移至 1.5 ml 微量离心管中。
  3. 在 4 °C 下，以 700 x g 离心 5 min，吸除 PBS。
  4. 每 107 个细胞加入 100 μl 冰冷的细胞质裂解缓冲液（表 1），用移液器吹打混匀。
  5. 冰上孵育 20 min。
  6. 在 4 °C 下，于微量离心机中以最大速度离心 10 min。
  7. 弃去沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，置于冰上保存。
  8. 使用 Bradford 法测定蛋白浓度（通常为 1 - 10 μg/μl）23。
  9. 分装后于 -80 °C 保存细胞提取物，直至使用。

2. 小鼠肝脏和脾脏蛋白质提取物的制备

  1. 通过吸入 CO2 处死小鼠。
  2. 将已处死的动物置于解剖板上的洁净垫上，用剪刀打开腹腔。
  3. 使用剪刀和镊子分离肝脏和脾脏，并用约 50 ml 冰冷的 PBS 冲洗每种组织。
  4. 立即用解剖刀将组织切成小块（例如：约 1 - 2 mm3）。
  5. 立即将组织块放入新的冻存管中，随后在液氮中速冻。将速冻的组织分装样品储存在 -80 °C 直至使用。
  6. 使用组织匀浆器，在 0.25 - 0.5 ml 冰冷的细胞质裂解缓冲液（表 1）中，对一块冷冻组织（约 1 - 2 mm3）进行匀浆，持续 10 秒。
  7. 将匀浆液转移至 1.5 ml 微量离心管中，在冰上冷却 20 分钟。
  8. 在 4 °C 下，以最大速度在微量离心机中离心 10 分钟。
  9. 弃去沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，保持在冰上。
  10. 使用 Bradford 法测定蛋白质浓度（通常为 1 - 10 μg/μl）23。
  11. 分装细胞提取物，并在 -80 °C 下保存直至使用。

3. 放射性标记IRE探针的制备

  1. 线性化含 IRE 的质粒 I-12.CAT22 37 °C 下孵育 1 小时 hr 用限制性内切酶 XbaI (1 U/μg 质粒），该酶在 IRE 序列下游进行切割。线性化的质粒将用作后续反应的模板 体外 转录
  2. 设置一个 体外 20 μl 总体积的转录反应。使用下表所示的储存液 表2 加入：1 μl 线性化质粒模板，4 μl 转录缓冲液；1 μl ATP/CTP/GTP 混合物，10 μl [α-32P]-UTP，2 μl 二硫苏糖醇，1 μl RNase抑制剂和1 μl T7 RNA聚合酶。用移液器吹打混匀。
  3. 在 40 °C 下孵育 1 小时 小时24.

4. 放射性标记IRE探针的纯化

  1. 终止 体外 通过加入1 μl的0.5，进行转录反应 M EDTA，pH 8. 用移液器上下吹打混匀。
  2. 加入10 μl的10 mg/ml tRNA（作为载体以促进沉淀）。用移液器吹打混匀。
  3. 加入82.5 μl的3 M 醋酸铵。涡旋振荡混匀。
  4. 加入 273 μl 乙醇，涡旋混匀。
  5. 室温下静置5分钟 最小
  6. 离心10分钟 室温下用微量离心机以最大速度离心1分钟。弃上清液。
  7. 用100 μl 70%乙醇洗涤沉淀。
  8. 离心10分钟 室温下，使用微量离心机以最大速度离心1分钟。弃上清液。
  9. 空气干燥沉淀物10分钟 最小
  10. 将沉淀重悬于100 μl双蒸、预先高压灭菌的H2O.
  11. 使用液体闪烁计数器测定放射活性，分装放射性标记的 IRE 探针，并于 -80 °C 保存备用。冻存的分装样品可使用长达 3 个月。 周

5. EMSA 实验用天然聚丙烯酰胺凝胶的制备

  1. 组装凝胶（16 x 16 cm）时使用 1.5 毫米间隔器和梳子
  2. 要制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用如下所示的贮存液 表3. 混合 7.5 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液 5 ml 5x TBE 溶液 ml 和 37.5 毫升双蒸水2O.
  3. 加入0.5 10% 新鲜配制的过硫酸铵（APS）溶液 1 ml 和四甲基乙二胺（TEMED）25 μl。
  4. 立即倒入丙烯酰胺溶液至凝胶中，使其聚合。等待约30分钟 最小
  5. 组装电泳装置并放入凝胶，向槽内加入0.5x TBE缓冲液，连接电源。

6. 电泳迁移率变动分析

  1. 用细胞质裂解缓冲液稀释25 μg来自细胞或组织的蛋白提取物（表1) 总体积为10 μl（也可使用较低的蛋白浓度）。保持在冰上。如有需要，加入1 μl 1:4稀释的2-巯基乙醇（2-ME）以激活失活的IRP1（终浓度：2%）25.
  2. 将放射性标记的 IRE 探针用双蒸水稀释20 到 200,000 cpm/μl，95 °C 加热变性 1 分钟 分钟，并在室温下冷却至少5分钟 最小
  3. 通过将1 μl放射性标记的IRE探针加入蛋白提取物中，建立EMSA反应。
  4. 孵育 20 分钟 室温下孵育最小时间。
  5. 加入 1 μl 的 50 加入终浓度为 mg/ml 的肝素以抑制探针与非特异性蛋白的结合9）并继续孵育10分钟 min。将肝素储备液（50 mg/ml）并置于 -80 °C 保存。
  6. 使用长片段放射性标记探针时（>60 个核苷酸），加入 1 μl RNase T1（1 U/μl）并孵育10分钟 室温下孵育数分钟，以减少非特异性蛋白与探针的结合，并有助于电泳过程中RNA/蛋白复合物的更好分离。
  7. 加入3 μl上样缓冲液（80%甘油 + 溴酚蓝），混匀后上样至6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中。
  8. 运行凝胶电泳60分钟 min at 130 V (5 V/cm
  9. 将凝胶转移至一张大滤纸上并干燥。
  10. 曝光于胶片并进行放射自显影显影。曝光时间可从1开始 小时（或更短时间）至过夜。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

按照方案第3和第4节所述，制备了放射性标记的IRE探针。探针序列为5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'；其中加粗的核苷酸代表一个未配对的C残基和环状结构，是IRE的关键特征。该探针的比放射性为4.5 × 109 cpm/μg RNA。

为了评估铁水平变化对IRE结合活性的影响，将小鼠RAW264.7巨噬细胞分别置于未处理状态，或用血红素（铁来源）或去铁胺（铁螯合剂）处理。制备细胞裂解液，并使用IRE探针（8,000 cpm/μg蛋白）进行EMSA分析。代表性数据如图1所示，左侧和右侧图分别显示放射自显影的短时间与长时间曝光结果。小鼠IRE/IRP1和IRE/IRP2复合物具有不同的迁移率，在第1泳道中可见两条不同的条带，对应于未处理细胞。铁螯合显著增强了IRP1和IRP2的IRE结合活性（第2泳道），而铁补充则使其减弱（第3泳道）。用2% 2-ME预处理可完全...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了一种用于研究IRP1和IRP2的IRE结合活性的实验方案，并展示了代表性数据。通过使用不同的探针，该方案也可调整用于其他RNA结合蛋白的研究。其中关键步骤之一是探针的长度。当结合位点未知时，常使用较长的探针对目标进行检测，但这可能导致RNA/蛋白复合物与游离RNA在迁移率上无明显差异。在此情况下，建议使用RNA酶T1处理以去除未结合的RNA。步骤 6.6）。探针的质量也非常重要。使用新近制备的放射性标记RNA可获得最佳结果。凝胶纯化10 不是必需的，但如果能改善EMSA的外观，则可以采用 体外 用于探针制备的转录反应会产生提前终止产物（若未包含RNA酶T1消化步骤）。原生凝胶电泳运行过快可能导致过热，从而引起RNA/蛋白质复合物解离，产生模糊条带。

通过磷屏成像分析滞留条带的强度，可以获得定量结果。只有当RNA探针过量且不成为RNA结合反应的限制因素时，定量结果才有效。RNA/蛋白质相互作用的亲和力可用解离常数Kd表示，该常数与自由能ΔGo相关，可通过逐步...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了加拿大卫生研究院（MOP-86514）资助项目的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亮抑蛋白酶肽SIGMAL2884
PMSFSIGMA78830
BioRad 蛋白定量试剂盒BIORAD500-0006
T7 RNA 聚合酶ThermoscientificEPO111
RNase 抑制剂Invitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-ElmerNEG507H
闪烁液Beckman Coulter141349
肝素SIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
仪器名称
Tissue RuptorQiagen9001271
闪烁计数器Beckman CoulterLS6500
Protean II xi 电泳槽BIORAD165-1834
20 孔梳子BIORAD165-18681.5 mm 厚
1.5 mm 间隔器BIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070

参考文献

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30(2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530(2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

RNA Bradford
研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。