通过本方案，我们能够对感染了弓形虫（Toxoplasma gondii）的小鼠脑组织切片（厚度达160 µm）进行成像，从而实现对包囊化寄生虫与感染神经元之间空间关系的可视化和分析。
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摘要
摘要
Toxoplasma gondii 是一种专性胞内寄生虫，宿主范围广泛，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物中，Toxoplasma 可在大脑中建立终生持续性感染。尽管这种脑部感染在大多数免疫功能健全的个体中无症状，但在发育中的胎儿或免疫功能低下者（如获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者）中，该寄生虫对脑组织的亲嗜性和持续存在可导致严重的神经系统疾病。因此，显然脑组织与Toxoplasma之间的相互作用对于Toxoplasma所致的症状性疾病的产生至关重要；然而，我们对中枢神经系统（CNS）细胞与该寄生虫之间的细胞或分子相互作用仍知之甚少。在中枢神经系统弓形虫病的小鼠模型中，已知神经元是寄生虫持续存在的细胞类型，这一发现已有30多年历史，但关于通常被感染的是神经元的哪一部分（胞体、树突或轴突），以及不同菌株之间这种细胞关系是否发生变化，目前可用的信息仍然很少。部分原因在于从动物体内成像和可视化完整感染神经元存在困难。此类图像通常需要通过电子显微镜或免疫染色后的共聚焦显微镜对组织进行连续切片并拼接。通过结合多种技术，本文所述方法可利用厚切片（160 µm）识别并成像含有包囊的完整细胞，从而无需免疫染色、电子显微镜、连续切片及拼接，即可实现对单个慢性感染神经元的三维可视化与分析。利用该技术，我们可开始深入理解寄生虫与感染神经元之间的细胞层面关系。
引言
本方法的总体目标是获得被专性细胞内寄生虫Toxoplasma gondii感染的单个神经元的高分辨率三维图像。
Toxoplasma 常被认为是世界上最成功的寄生虫之一，因其具有广泛的中间宿主范围，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物中，通过摄入被污染的食物或水而发生急性感染后，Toxoplasma 能够通过从快速增殖形态（速殖子）转变为缓慢增殖并形成包囊的形态（缓殖子），在中枢神经系统（CNS）中建立持续性感染。在免疫功能正常的个体中，这种潜伏性中枢神经系统感染通常被认为是相对无症状的；但在免疫功能低下者（如艾滋病患者或器官移植受者）中，寄生虫的复发可导致致命的弓形虫脑炎1,2。此外，最近的研究表明，Toxoplasma 的潜伏感染可引起啮齿类动物的行为改变3,4，但其机制尚不清楚。
令人惊讶的是，尽管这些数据强调了中枢神经系统（CNS）的重要性弓形虫 相互作用，但关于这种关系的研究仍十分有限，尤其是在细胞和分子层面。对脑-寄生虫相互作用的简单方面进行研究的能力，在一定程度上受到技术限制的制约。例如，证明神经元是包囊持续存在的细胞的大多数研究均依赖于电子显微镜（EM）完成5,6尽管电子显微镜（EM）具有高分辨率，但其操作耗时、劳动强度大且成本高昂。近年来，免疫荧....
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方案
注意：小鼠在亚利桑那大学的温度和湿度受控环境中饲养，采用12小时反转光照/黑暗循环，可自由获取食物和水 ad libitum。实验均在亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会的指导方针及批准下进行。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦。Cre报告小鼠品系背景为C57BL/611，可商业获得。
1. 小鼠感染
注意：以下所述的小鼠感染Toxoplasma gondii的方法已在先前发表的研究中使用过10–12。
- 培养 弓形虫 在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（cDMEM）的杜尔贝科高糖改良伊格尔培养基（DMEM）中，于5% CO₂培养箱内的T-25培养瓶中培养的人包皮成纤维细胞（HFFs）中的菌株2 孵育至寄生虫形成较大的寄生泡。
- 用注射器释放寄生虫：从培养瓶底部刮取细胞，将所得溶液在培养瓶内通过连接3 ml注射器的25号针头推注2次，然后将全部溶液转移至连接27号针头的5 ml注射器筒内，该针头已倒置放入15 ml锥形管中。将活塞连接至注射器，推动活塞将寄生虫溶液注入锥形管内。 ....
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结果
图7 包含来自两个不同160 µm厚切片的两个含囊肿的GFP+神经元的代表性图像，以及用于图7B的囊肿到胞体距离的代表性测量结果。图7A和B表明，该新方案能够实现对感染神经元整体的可视化。图7C显示，利用此成像技术，现在可以量化囊肿与胞体之间的距离（Imaris 7.7）。图7D是图7B的完整旋转视图。以这种方式可视化z轴堆叠图像，可验证细胞及囊肿被完整捕获。图7E是一个三维旋转视频，展示如何使用Imaris 7.7软件对7D图像进行分析，以测量囊肿到胞体的距离，测量方式可为中点到中点或边缘到边缘。尽管图中所示的测量是通过囊肿与胞体之间的一条直线完成的，但也可生成沿GFP+突起实际路径至胞体的距离测量结果（数据未显示）。
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讨论
鉴于其他胞内病原体（如HIV、狂犬病病毒和沙眼衣原体）感染宿主细胞所引起的细胞变化已被证实与疾病结局相关18,19，我们开发了一种技术，可用于研究中枢神经系统宿主细胞与弓形虫（Toxoplasma）之间发生的密切相互作用。本文所述方法通过实现对慢性感染神经元的高效成像，达成了这一目标。在该方法建立之前，此类成像工作耗时较长、成本高昂，或根本无法实现。
我们现在可以利用该技术来回答有关的基礎科學問題 弓形虫-神经元相互作用，例如寄生虫是否靶向特定的神经元区域？这在不同情况下是否存在差异？ 弓形虫 菌株？囊肿所处的细胞区域与细胞其他部分是否存在差异即 同一神经元的受感染与未受感染树突是否具有相同数量的树突棘？受感染神经元之间共享哪些细胞特征？回答这些问题对于理解其机制至关重要 弓形虫 感染会改变中枢神经系统，包括行为层面的变化。
为了获得最佳的成像效果，确保组织被切成厚度均匀的切片至关重要。如果切片厚度不均，盖玻片将无法.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Koshy实验室全体成员的有益讨论。感谢亚利桑那大学神经科学系的Patty Jansma及其团队在成像方面的建议和帮助。同时感谢Porreca实验室提供Vibratome设备的使用。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH NS065116，A.A.K.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1000系列振动切片系统 | Technical Products International, Inc. | 其他振动切片机亦可兼容 | |
| 甘油 | 费希尔科技公司 | BP229-1 | |
| 吐温-20 | 费希尔科技公司 | BP337-500 | |
| 优质载玻片 | 费希尔科技公司 | 12-544-2 | |
| #1.5 盖玻片 | VWR | 48393 251 | |
| 金刚石划痕笔 | VWR | 52865-005 | |
| 蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | 蔡司 | LSM 510 | |
| Ketaject® 盐酸氯胺酮注射液，USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® 注射用赛拉嗪 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen 小鼠 | 杰克逊实验室 | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| 手术器械 | 拇指镊；侧弯尖头剪刀（双尖）；双尖剪刀；Kelly 止血钳；Mayo 剪刀；微型刮匙。 | ||
| 人包皮成纤维细胞（HFF 细胞） | 这些细胞来源于人包皮的原代细胞。 我们自行制备，也可从外部供应商购买。 | ||
| 杜尔贝科高糖改良伊格尔培养基（DMEM） | HyClone | SH30081.01 | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液 | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 倾斜颈培养瓶 | 费希尔科技公司 | 1012639 | |
| 磷酸盐缓冲液，1×，不含钙和镁 | VWR | 45000-446 | |
| 磷酸盐缓冲液，10×，USP 无菌超纯级 | amresco | K813-500ml | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140-079 | |
| 亮线血细胞计数板 | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| 小鼠脑切片模具 | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| 氯化钠 | 费希尔科技公司 | BP358-1 | |
| 来源于猪肠黏膜的肝素钠盐 | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| 多聚甲醛 | 费希尔科技公司 | O4042-500 | |
| 20 ml 一次性闪烁瓶 | 费希尔科技公司 | FS74500-20 | |
| 乙醇，95%，190 proof | 本单位提供 | 17212945 | 该产品由本单位库存提供。 其他公司产品亦可兼容。 |
| Imaris 软件 | Bitplane | ||
| 透明指甲油 | 其他品牌亦可兼容 | ||
| 10 ml 带鲁尔锁扣注射器 | VWR | BD309604 | 其他注射器亦可兼容 |
| 三通阀 | 任何品牌均可兼容 | ||
| 皮下注射针头 | 任何品牌均可兼容——用于固定小鼠 | ||
| 细胞刮刀 | 任何品牌均可兼容 | ||
| 25 G × 12" 管路，安全采血套装，带鲁尔接头 | Greiner Bio-One | 450099 | 其他品牌亦可兼容 |
参考文献
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Ei....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 9/01/2015. Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
