Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

摘要

我们介绍了一种在小鼠皮下模型中建立Candida albicans生物膜的实验方法。通过测定菌落形成单位数量以及非侵入性生物发光成像对真菌生物膜进行定量，其中产生的光量与活细胞数量相对应。

摘要

白色念珠菌 生物膜在生物或非生物表面的形成对住院患者构成特定威胁。迄今为止， C. albicans 生物膜主要被研究 体外 但迫切需要更深入地理解这一动态过程 体内 条件。我们开发了一种 体内 皮下大鼠模型研究 C. albicans 生物膜形成。在我们的模型中，多个（最多9个） 假丝酵母将感染的装置植入动物背部，这使我们相较于中心静脉导管模型系统具有显著优势，因为它允许我们在单个动物体内研究多个独立的生物膜。近期，我们对该模型进行了改进以用于研究 C. albicans BALB/c小鼠中生物膜的形成。在此模型中，成熟的 C. albicans 生物膜在48小时内形成，并展现出典型的三维生物膜结构。真菌生物膜的定量分析 traditionally 采用 死后 且需要牺牲宿主。由于进行动力学研究需要使用大量动物，我们采用了非侵入性生物发光成像（BLI）进行纵向追踪 在 体内 成熟 C. albicans 在我们的皮下模型中形成的生物膜。 C. albicans 细胞被改造以表达 Gaussia 始祖 luciferase 基因gLuc) 附着于细胞壁。生物发光信号由荧光素酶催化所添加的底物腔肠素产生，生成可被检测的光信号。该BLI信号与从移植导管中获得的细胞计数结果相似。用于定量的非侵入性成像 体内 生物膜形成可为抗真菌药物的筛选与验证提供直接应用平台 体内 条件，以及基于宿主-病原体相互作用的研究，从而有助于更好地理解导管相关性感染的发病机制。

引言

Candida albicans 是一种共生生物，可在健康个体的不同部位发现，例如皮肤表面，或作为胃肠道及阴道菌群的一部分。然而，在住院患者尤其是免疫功能低下者中，它可能引发多种感染¹。在这些个体中，免疫系统功能减弱使得Candida细胞得以进入血液并侵入深层组织，导致危及生命的感染。此外，诸如中心静脉导管、尿道导管、人工心脏瓣膜和关节等非生物材料的存在，可能为Candida的附着提供适宜的生态位点²。对这些材料的黏附是进一步形成生物膜的前提，生物膜是由酵母相和菌丝相细胞嵌入主要成分为多糖的胞外聚合物基质中所构成的结构²。C. albicans导管相关性感染与高死亡率相关。生物膜的一个普遍特征是其对已知抗真菌药物（如唑类）的敏感性显著降低^3,4。目前仅有较新的抗真菌药物类别，如棘白菌素类以及两性霉素B脂质体剂型，被证实对导管相关性感染有效^5–7。由于生物膜对抗真菌药物具有高度耐受性，治疗手段极为有限，常需移除导管并更换新导管作为唯一解决方案。

我们目前对大多数问题的理解 C. albicans 生物膜的形成起始于 体外 在聚苯乙烯或用于制造上述设备的塑料等非生物基质上的研究， 即， 硅胶，聚氨酯 ²这些模型相当先进，力求模....

方案

注意：所有动物实验均经鲁汶大学（KU Leuven）伦理委员会批准（项目编号 090/2013）。动物饲养和管理须遵循鲁汶大学动物护理指南。

1. C. albicans 生长

1. 在动物实验开始前 24 小时，通过加入 10 g 颗粒状酵母提取物、20 g 细菌学蛋白胨和 15 g 颗粒状琼脂制备 YPD 平板。用 Milli-Q 水定容至 900 ml 并进行高压灭菌。
2. 加入 50 ml 无菌的 40% 葡萄糖溶液，充分混匀后倒入培养皿中。让琼脂平板冷却并凝固。
   注意：本研究中使用两种菌株，分别为野生型 C. albicans SC5314 –gLuc 阴性菌株 （以下简称 WT）和 C. albicans SKCA23 菌株，后者是通过将 Clp10::Act1p-gLUC59 质粒²²转化至野生型 C. albicans SC5314 而获得的。该菌株（命名为 SKCA23-ACTgLuc）中，gLuc 在 ACT1（肌动蛋白）启动子的调控下与内源性 PGA59 基因融合（该启动子在酵母态及菌丝态真菌生长阶段均具有活性）。该菌株可向比利时鲁汶大学（KU Leuven）Patrick Van Dijc....

结果

本研究展示了在小鼠体内白色念珠菌（C. albicans）生物膜发育过程中导管植入与取出的手术操作。此外，我们不仅通过传统的菌落形成单位（CFU）计数，还通过生物发光成像（BLI）对成熟生物膜进行了定量分析。

如图1A所示，将非磷光性聚氨酯导管材料切割成1 cm长的装置，并随后涂覆血清。此步骤非常关键，因为与未涂覆血清的植入物相比，血清涂层可使Candida细胞更快地附着于基质上¹⁵。需要特别指出的是，在开展任何C. albicans实验之前，我们首先记录了装置的背景发光情况¹⁸。该步骤在进行任何生物发光成像（BLI）之前至关重要，因为装置本身的高磷光会干扰对gLuc-表达细胞所产生的特异性生物发光信号强度及信号动力学的评估。接下来，将C. albicans细胞与涂覆血清的导管片段共同孵育。随后在动物背部皮下切口后植入导管片段（图2A）。在此体内实验设置中，在小鼠背.......

讨论

在致力于微生物生物膜研究的实验中，使用动物模型（尤其是啮齿类动物模型）非常重要，因为宿主免疫系统是生物膜形成的关键因素，而体外模型无法模拟这一因素。in vitro 模型无法对此进行模拟。在本研究中，我们描述了一种相对简便的皮下白色念珠菌（C. albicans）生物膜小鼠模型，该模型易于在科研实验室中采用，且无需高难度的技术操作。该模型最初是为研究表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）在大鼠体内的生物膜形成而开发的²⁴。

在所展示的模型中，用血清包被的聚氨酯导管被挑战以 假丝酵母 细胞 离体 在黏附期间（90 分钟，37 °C）。这是第一步 体外 由于在生物膜感染过程的最初阶段缺乏免疫系统，该步骤可能被视为限制性因素。在黏附之后、导管植入之前，通过清洗去除未与器械相关的细胞。若在黏附期后省略清洗步骤，可能导致与器械相关细胞数量失控。因此，我们建议在导管植入前进行清洗，从而确保其生物膜发育始于已黏附的细胞。经过初始黏附阶段后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
颗粒状酵母提取物	Merck	MERC1.03753.0500
细菌用蛋白胨	Oxoid	LP037B
颗粒状琼脂	Difco	214530
D-(+)-葡萄糖	Fluka	49159-5KG
磷酸盐缓冲液	实验室配制		配制1L 10倍PBS：80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na2HPO4，2.4 g KH2PO4
含L-谷氨酰胺、不含碳酸钠的RPMI1640培养基	Sigma	R6504-1L	按照白色念珠菌药物敏感性检测方案进行配制
3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）	Sigma	M1254	MOPS用于调节RPMI培养基的pH值（pH 7.0）
胎牛血清（FBS）	Sigma	F7524
聚氨酯三腔静脉导管片段（直径2.4 mm，Certofix Trio S730）	BBraun	CV-15703	将聚氨酯部分切割成1 cm长的片段
地塞米松	Fagron SAS, 法国	611139	免疫抑制剂（储存液浓度为10 mg/mL）
氨苄西林	Duchefa Biochemie, 荷兰	A0104	抗菌预防用药
凯泰1000（Ketamine 1000）	Pfizer	804 119	麻醉剂
多米托（Domitor）	Pfizer	134737-1	麻醉剂
安替醒（Antisedan）	Pfizer	134783-2	逆转麻醉作用
利多卡因凝胶（2%）——即Linisol	AstraZeneca	352 1206	皮肤局部麻醉剂
土霉素/多粘菌素B眼膏			防止眼睛干燥和感染
腔肠素	Prolume (Nanolight)	NF-CTZ-FB	光敏试剂（必须避光保存）
1%碘异丙醇	3M™ DuraPrep™		皮肤消毒剂
70%酒精中含0.5%氯己定	Cedium		皮肤消毒剂
设备
细胞计数板
胰岛素注射器（0.3 mL）	Terumo Myjector 29G	324826	用于注射腔肠素
电动剃毛器			适用于小型动物
无菌手术器械			剪刀、镊子两把、手术刀
加热垫	Leica	14042321474
皮肤缝合线	Johnson&Johnson	K890H	外科缝合线及缝合针
水浴超声仪	Branson 2210
生物发光成像仪（IVIS Spectrum）	Perkin Elmer, Alameda	IVISSPE
Living Image软件	Perkin Elmer, Alameda		（版本4.2）