神经细胞类型表面与细胞内抗原分析的流式细胞术方案

摘要

我们提供了一种用于神经细胞类型表面抗原和/或细胞内抗原流式细胞术分析的实验方案的详细描述。文中阐述了实验设计的关键要点、逐步的操作方法以及流式细胞术的基本原理，旨在帮助神经生物学家充分利用这一强大技术。

摘要

流式细胞术已广泛应用于免疫学、血液学和肿瘤学中细胞群体的定义。本文详细描述了用于神经细胞类型中分化簇（CD）表面抗原及细胞内抗原流式细胞分析的实验方案。我们对方法步骤的逐步说明包括：神经细胞的收集 体外 培养物，可选的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记步骤，随后使用偶联CD抗体进行表面抗原染色（例如， CD24、CD54）以及通过一抗/二抗或荧光标记的Fab片段（Zenon标记法）进行后续的胞内抗原检测。视频展示了其中最关键的实验步骤。此外，本文简要介绍了实验设计的基本原则、关键对照的设置以及流式细胞术分析的基础知识（包括目标细胞群的识别与碎片排除、设门策略、光谱重叠的补偿），旨在帮助神经生物学领域中对流式细胞术缺乏前期知识或专门训练的研究人员评估该技术的适用性，并更充分地利用这一强大方法。

引言

流式细胞术已在免疫学、血液学和肿瘤学中得到广泛应用，通过细胞固有的散射特性、细胞表面抗原表达以及其他荧光参数来定义细胞群体^1-3。我们对血液谱系发育及疾病的认识在很大程度上得益于该方法自首次应用以来的持续优化^4,5。近年来，随着对流式细胞术定量能力及整体分析潜力的认识不断提高，其在干细胞研究中的应用日益广泛，有望在更短时间内推动产生同样深远的进展⁶。然而，将流式细胞术专门用于分析和分离神经细胞群体长期以来被认为具有挑战性。与天然处于悬浮状态的造血细胞不同，神经细胞通常来源于极为复杂的组织，其中可能包含胶质细胞及多种其他周围细胞，以及由具有突起的神经元构成的复杂网络。因此，神经生物学尚未在日常研究实践中充分发挥流式细胞术的多功能性。然而，只要能够制备出可行的单细胞悬液（已有针对此目的设计并优化的实验方案⁷），流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）即可被视为神经生物学分析工具库中的重要组成部分^8-11。

方案

1. 神经细胞收获

1. 显微镜评估：
   1. 在开始实验之前，使用明场或相差显微镜检查培养物的状态。
      注意：原则上，从解剖中获得的原代神经组织同样适用于流式细胞术分析^14,28请注意，本方案的重点是来源于 体外 神经细胞系统
2. 收集细胞⁷:
   1. 轻轻用含镁离子的缓冲液洗涤贴壁细胞培养皿/瓶²⁺/ Ca²⁺ 室温下无游离磷酸盐缓冲液（PBS）（例如，T75培养瓶加5 ml，6孔板每孔加3 ml，或10 cm培养皿加10 ml。
      注意：本实验方案中使用的 PBS 均不含 Mg²⁺/ 钙²⁺ 自由的
      1. 以视频示例为例，使用一个汇合度为80%的T75培养瓶培养的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。若培养皿中存在较多碎片，请增加额外的洗涤步骤。
      2. 考虑使用含血清白蛋白的 PBS 进行洗涤⁴⁸，Percoll，或Ficoll⁴⁹ 离心梯度和/或市售微珠^50,51去除髓鞘及其他脂质或污染物至关重要，尤其是在使用成年个体的原代组织来源时。
   2. 加入预热的（37 °C用适量的胰蛋白酶替代液覆盖组织培养容....

结果

本文所展示的实验方案具有多种应用方式（图2）。在最简版本（步骤1、3和6）中，该方案可作为细胞表面抗原简单染色的操作指南。  在更复杂的流程中，可结合多种胞内抗原进行共标记实验（可选步骤2和/或步骤4至5）。此外，CFSE标记步骤展示了该方法在细胞亚群标记与追踪研究中的实用性，适用于细胞间相互作用研究或流式细胞术条形码实验（步骤2）。通过（步骤2和/或3）获得的活细胞群体可用于细胞分选（FACS）及后续分析，包括分选后细胞培养。另一方面，联合进行胞内与表面抗原染色（步骤3至5）本身即可提供有效的分析读出结果。例如，识别特定神经细胞亚群上某些CD抗原的共表达情况（我们已在Turaç et al.³⁸中应用此方法，用于鉴定神.......

讨论

本文所述方案已广泛应用于源自人类干细胞的神经细胞培养，同样也可适用于其他神经细胞来源，包括原代组织或神经细胞系。除了胚胎来源外，还可从成年脑的神经发生区域分离获得神经干细胞或前体细胞²⁷。此外，流式细胞术和荧光激活细胞分选技术（FACS）可用于定量、分析和分离多种细胞群体，包括成熟神经元⁵⁴、星形胶质细胞³³、小胶质细胞⁵⁵、少突胶质细胞⁵⁶以及出生后脑组织中的内皮细胞⁵⁷。

无论来源如何，每种细胞类型的固定和透化最佳条件均需通过实验确定，因为其中任一步骤过度进行均可能导致散射特性发生显著改变，从而影响流式细胞术的检测结果。该方案的效率还取决于透化后表面分子的稳定性。需要注意的是，不同的表面表位在操作过程中可能受到不同程度的影响。此外，例如使用胰蛋白酶替代物或Liberase-1进行酶法消化，可能会影响一系列细胞表面表位，但相较于使用Accutase或木瓜蛋白酶，其影响程度较轻⁷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 (1:1)（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12）	Life Technologies	11330057
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS	Life Technologies	14190169
胎牛血清，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源（FBS）	Life Technologies	10270-106
MEM 非必需氨基酸（100 倍浓缩液）	Life Technologies	11140035
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250061
多聚甲醛	Carl Roth	335.3
牛血清白蛋白（BSA）第五组分	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001
Tween-20 去垢剂	Calbiochem	655205
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）	eBioscience	65-0850-84
DMSO	AppliChem	A1584
瓶顶滤器 Express Plus 0.22 µm，250 ml	Millipore	SCGPU02RE
细胞培养处理过的培养瓶（T 25）	NUNC	156367
细胞培养处理过的培养瓶（T 75）	NUNC	156499
锥形管（15 ml）	Greiner Bio-One	188271
锥形管（50 ml）	Greiner Bio-One	227261
巴斯德移液管，玻璃材质（150 mm）	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150
移液器吸头（0.1–10 µl）	Corning	4125
移液器吸头（1–200 µl）	Corning	4126
移液器吸头（100–1000 µl）	Corning	4129
血清移液管，5 ml	Corning	4051
血清移液管，10 ml	Corning	4101
血清移液管，25 ml	Corning	4251
微量离心管（0.5 ml）	Sarstedt	72,699
微量离心管（1.5 ml）	Greiner Bio-One	616201
微量离心管（2.0 ml）	Sarstedt	72,695,500
抗人 CD24 APC 单克隆抗体	eBioscience	17-0247-42	工作稀释度 1:50
抗人 CD54 PE 单克隆抗体	eBioscience	12-0549-42	工作稀释度 1:50
神经元 III 类 β-微管蛋白（Tuj1）多克隆抗体	Covance	PRB-435P	工作稀释度 1:2,000
Alexa Fluor 488 驴抗兔抗体	Life Technologies	A21206	工作稀释度 1:2,000
Zenon® 荧光素兔 IgG 标记试剂盒	Life Technologies	Z-25342
改进型 Neubauer 计数板	Marienfeld	0640010
涡旋振荡器	Scientific Industries	G560E
Thermomixer comfort 恒温混匀仪	Eppendorf	5355 000.001
Accuri C6 流式细胞仪	Becton Dickinson (BD)	653118
带制冷功能的微量离心机，PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R
轨道摇床，Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
带制冷功能的离心机，Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50
II 级生物安全柜 Safe 2020	Thermo Scientific	51026640
CO2 培养箱，Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331
真空系统，Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320
显微镜，Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212
移液控制器，accu-jet pro	Brand	26303
微量移液器，Pipetman neo P20N（2–20 µl）	Gilson	F144563
微量移液器，Pipetman neo P200N（20–200 µl）	Gilson	F144565
微量移液器，Pipetman neo P1000N（100–1000 µl）	Gilson	F144566