微创大鼠视神经注射技术

摘要

直接注射至大鼠视神经在再生研究中具有重要价值。我们展示了一种微创技术，可实现对大鼠视神经的直接注射，且无需打开颅骨。采用该方法可最大限度减少手术并发症，并加快术后恢复。

摘要

大鼠视神经是干细胞再生研究的有用模型。直接注射至大鼠视神经可在无需去骨的微创手术条件下实现向中枢神经系统的递送。本技术描述了一种可视化及直接注射视神经的方法，通过从眶缘进行轻微的筋膜分离，并使用结膜牵引缝线轻柔地将眼球向下和向外牵拉，以暴露视神经。注射后视神经的代表性示例显示，染色微珠已成功注入。

引言

视神经是研究中枢神经系统（CNS）再生的理想部位，适用于视神经炎、青光眼和外伤等眼科疾病的探索。多种干细胞注射已在研究中显示出疗效或潜力，可用于替代丢失的髓鞘、增加轴突数量和/或防止退行性疾病。^1,2

人视神经包含约120万根平行的轴突，这些轴突从视网膜延伸至视交叉，直径约为3.0–3.5 mm³。为了在实验室中模拟人类疾病，大鼠被广泛使用。成年大鼠视神经内约有10万个轴突，直径约为0.5 mm⁴。中枢神经系统再生研究的主要局限之一是缺乏直接的无骨性通路。当需要移除颅骨或椎骨时，动物的并发症和手术风险更高。类似于脊柱微创手术的优势⁵，不打开颅骨而直接对视神经进行注射可减少并发症，并加快恢复速度。

该技术已在先前的研究中被使用。⁶ 在本论文及随附视频中，我们展示了一种将干细胞注射到大鼠视神经中的微创手术操作。

方案

注意：所有动物实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。麻醉机需每年进行检查，并根据需要进行校准。

1. 麻醉与体位

1. 麻醉
   1. 在2-3%异氟烷麻醉下进行所有手术操作。通过脚趾夹捏反应和呼吸频率确认麻醉深度。检查大鼠对脚趾夹捏无退缩反应。
      注意：出现惊跳反应表明麻醉已过晚，可能需要在开始前延长麻醉时间或提高异氟烷浓度。呼吸频率低于每2秒一次呼吸表明麻醉过深，提示异氟烷浓度过高，可能需要降低浓度。
   2. 根据需要固定动物，以防止手术过程中头部移动。在手术眼上滴一滴利多卡因。在麻醉期间每10分钟使用一次人工泪液，以防止角膜干燥。给予 术前皮下注射0.01 mg/kg的丁丙诺啡，随后每6-8小时一次 视需要。 
2. 定位。
   1. 将大鼠放入立体定位仪中，并使用加热垫保持体温。用酒精浸湿头皮毛发，注意避免接触眼睛。使用无菌器械和无菌操作技术，以最大限度降低术后感染风险。

2. 眼动控制

1. 在侧部结膜处放置4-0缝线，并用足够长度的缝线打结，以便进行轻柔牵引。

3. 解剖

1. 初始解剖。
   1. 使用10号手术刀在眶嵴上方的皮肤处做一个约1英寸长的切口，如图1所示。牵开皮肤及下方筋膜，并仔细分离筋膜组织。为防止术区出血过多，解剖筋膜时应避免损伤血管。可使用适当放置的棉签进行压迫止血。
2. 深层解剖。
   注意：轻柔牵拉结膜，将眼球向下和向外牵拉，此时可显露上眶肌。为暴露视神经，需切断该肌肉并去除眶后脂肪。脂肪组织可丢弃，注射后无需复位。自此，视神经鞘膜应可见为一束状结构，包含视神经本体及其周围包裹着硬脑膜的血管（图1）。
   1. 使用手术刀或31号斜面针头在硬脑膜上做一小切口，以减少穿刺时的组织损伤。

4. 移液器注射器

1. 将玻璃微量移液管拉制至直径为 50–100 µm。为确保稳定性，将微量移液管固定在显微操作仪上，并连接至与输注泵相连的汉密尔顿注射器。
2. 在前后各加入 0.5 µl 亚甲蓝溶液，通过逆行方式将重悬于 0.5–1.0 µl 体积中的微珠（或干细胞）吸入微量移液管中。
   注意：将输注速率设定为每分钟 0.5–2 µl 可避免对视神经造成损伤。

5. 注射

1. 将微量移液器的尖端轻轻下放到视神经上，位置在已切开的硬脑膜稍上方。
   注意：玻璃尖端以微小但迅速的动作插入视神经可造成最小损伤。当输注泵启动时，甲基蓝染料应使被注射的视神经区域显色。染料应局限在视神经内，不得渗漏至蛛网膜下腔。
2. 观察第二条甲基蓝染料带的出现，以此判断干细胞注射已完成，并在第二剂量甲基蓝注入时关闭输注泵。每次注入1 µl体积后，保持移液器在视神经内静止2分钟，以防止撤出时因压力过高导致液体喷射。
   注意：另一种方法是将移液器尖端连接至充满空气的注射器，手动操控。无论采用何种方式，均应避免施加过大压力，以最大限度减少对视神经的损伤。我们建议每侧视神经注射体积不超过2 µl。

6. 随访

1. 立即处理。
   1. 注射完成后，移除微移液管以及用于止血的棉签头。使用3-0丝线缝合皮肤，并拆除结膜缝线。
   2. 将大鼠置于加热垫上保持体温，直至其从麻醉中苏醒。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得放回与其他动物共同饲养的环境。
   3. 若动物出现疼痛症状，包括过度嗜睡、共济失调或呼吸困难，应给予适当的镇痛处理，肌肉注射布托啡诺（0.05 mg/kg），每日最多三次。
2. 长期观察。
   1. 在术后24-48小时内，观察大鼠是否出现手术并发症，如伤口肿胀或分泌物，或其他疼痛表现，例如发声、蜷缩姿态、不梳理毛发或拒食。必要时应咨询兽医或根据伦理原则实施安乐死。

结果

实验结束后，处死大鼠并用4%多聚甲醛灌注。小心分离视神经并进行包埋，以供冷冻切片使用。图2展示了大鼠完整视神经在低倍镜下的一个示例，其中注射了伊文思蓝染料以显示注射部位。箭头指示了注射的精确位置。由于染料沿神经的扩散范围有限，表明该解剖操作是在注射后数分钟内完成的。在其他注射实验中，我们观察到染料在数小时内缓慢向视交叉方向扩散。

图1：手术视野。 本图中大鼠体位便于暴露左侧眼球。在眶上嵴上方做切口，并将筋膜组织向后分离至眼球后方。通过结膜缝线施加轻柔牵引，可使颅内段视神经暴露于视野中，而无需打开颅骨。

讨论

将干细胞或其他旨在促进再生的物质直接注射至视神经，相较于其他中枢神经系统注射方法，提供了一种更为便捷的模型。该技术所需时间更短，总体麻醉需求更少，无需钻孔或切除颅骨或骨组织，可降低并发症发生率，并使术后恢复更为迅速。

本方案中最关键的步骤包括：1. 手术区域充分止血，以清晰显露视神经束；2. 精确测量移液管尖端，以便以最小创伤顺利插入视神经；3. 使用结膜缝线牢固固定眼球，以获得视神经的最佳暴露。

先前已描述过一种替代性的侧方入路至视神经，该方法同样可在不进行颅骨解剖的情况下直接向视神经内注射。⁶ 根据我们的经验，侧方入路仅能观察到视网膜后方非常近端的视神经部分。而在我们采用的上方入路中，可观察到更大范围的视神经，从而允许对近端及中段视神经均进行注射。

视神经注射的主要局限性在于大鼠对视觉的依赖程度较低。大鼠依靠触觉、听觉和嗅觉等其他感官即可良好地完成各种功能，不像人类那样必须依赖视觉。因此，针对大鼠视觉的行为学研究仅限于本能性的视动反射，且这些反射...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lewis大鼠	Charles River	4	任何品系的大鼠均可使用。
麻醉机	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 小动物麻醉机 - 立柱安装型
输注泵	Stoelting	53129
解剖显微镜	National Optical	409-411-1105
光纤光源	Fisher Scientific	12-562-21
解剖与立体定位仪器	Stoelting	51400
玻璃微电极拉制仪	Kopf	750
移液管	World Precision Instruments	18150-6
一次性手术刀片	Harvard Apparatus	810-15-021
虹膜剪	Electron Microscopy Sciences	Uniband LA-4XF