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活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选

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DOI：

10.3791/52255

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2015年3月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie, Institut de biologie intégrative et des systémes & PROTEO, Université Laval

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

蛋白质之间会相互作用，而这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。可通过基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA）的酵母适合度检测，在高通量条件下在活体（in vivo）中鉴定蛋白质的相互作用伙伴。

摘要

蛋白质是细胞过程的结构单元、效应分子和信号转导介质。蛋白质的功能、调控和定位通常依赖于其与其他蛋白质的相互作用。本文介绍一种酵母蛋白片段互补实验（PCA）的实验方案，这是一种在活细胞中检测蛋白质之间直接或邻近相互作用的强有力方法。当两个目标蛋白分别与二氢叶酸还原酶（DHFR）蛋白片段融合后，若发生相互作用，则可导致酵母菌株在甲氨蝶呤（MTX）药物存在条件下生长。由于重组DHFR酶的量不同而产生的差异性适应度，可在高密度菌落阵列上进行定量，从而区分相互作用与非相互作用的诱饵-猎物蛋白对。本文所述的高通量实验流程采用机器人平台完成，可并行化地实现携带互补DHFR片段融合蛋白的诱饵菌株与猎物菌株的杂交，以及在MTX培养基上的存活检测。该方案可系统性地检测数千种涉及特定诱饵蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），相较于其他PPI检测方法具有多项优势，包括可在内源启动子驱动下表达目标蛋白，无需改变蛋白定位，也无需构建复杂的报告系统载体。

引言

蛋白质相互作用网络（PIN）提供了蛋白质在细胞内功能组织方式的低分辨率图谱1。两个蛋白质之间的每一个物理连接，即蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），可能代表一种在时间上稳定的关联，例如存在于蛋白质复合物中的相互作用，这类作用有助于细胞的结构组织；这些连接也可能代表调控两个相互作用蛋白的活性、稳定性、定位及其相互作用的瞬时关联。因此，鉴定特定蛋白质的物理相互作用伙伴，可为其功能与调控提供丰富的信息2,3。基于这些原因，研究人员已在多种模式生物中开展了大规模的PIN绘制工作，包括Escherichia coli4-6、Arabidopsis thaliana7、Saccharomyces cerevisiae8-12、Drosophila melanogaster13、Caenorhabditis elegans14和Homo sapiens15。这些研究揭示了蛋白质在细胞内的组织方式，从而为此前功能未知的蛋白质提供了关键信息。

多年来已开发出多种策略用于研究蛋白质相互作用网络（PINs）。这些技术可根据其提供的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）信息类型， broadly 分为三大类（综述见16-18基于酵母双杂交及其衍生技术19这些技术可提供蛋白质对之间直接相互作用的信息，从而构建二元相互作用网络。第二类方法基于诱饵蛋白的亲和纯化及其相互作用蛋白的鉴定 相关合作伙伴，例如亲和纯化联合质谱分析20这些方法能够识别直接或间接关联的蛋白质群组，通常以稳定的方式存在，对于鉴定蛋白质复合物极为有效。第三种方法基于蛋白质片段互补实验（PCAs）。11,21该方法在前两种方法之间提供了中等水平的分辨率，能够检测蛋白质之间的直接及邻近关联。每种技术都有其各自的优势与局限性，近期已有相关综述。18.

迄今为止，研究最深入的真核生物PIN蛋白是芽殖酵母中的PIN蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），部分原因是其蛋白质组相比其他真核模式生物相对简单，且用于检测蛋白质相互作用的高通量检测方法最先在此模式生物中建立并能更高效地实施9-12酵母系统中一种特别强大的方法是二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA），该方法已在不同条件下用于研究标准及扰动状态下酵母的蛋白质相互作用网络（PIN）。11,22-26该方法依赖于一种存活率检测，可在相互作用蛋白的内源性表达水平和天然亚细胞定位条件下，检测特定诱饵蛋白的直接及近直接蛋白质-蛋白质相互作用。11,21 以定量的方式27使用本检测方法获得的信号（即 菌落密度阵列上的菌落大小反映了在接近野生型细胞的细胞环境中，诱饵蛋白与猎物蛋白之间形成的蛋白复合物的量。该检测方法基于参与叶酸代谢的报告酶——二氢叶酸还原酶（DHFR）的活性重建：当两个目标蛋白发生相互作用时，分别与这两个蛋白融合的DHFR互补片段相互靠近，从而可逆地恢复酶的活性。11 并在含甲氨蝶呤（MTX； 图1）。该化合物可抑制内源性DHFR酶，但不抑制检测中所用的突变型DHFR酶28两组PCA菌株，其中一组包含约4,300株 MATa 含有 DHFR F[1,2] 片段融合 ORF 的菌株，以及一种包含约 4,800 个 MATα 带有与 DHFR [3] 片段融合的 ORF 的菌株可购买获得，可用于在任何实验室中以小规模或大规模实施 DHFR-PCA。本文中，我们描述了一种通用但详细的方案，用于利用该检测方法筛选一种诱饵蛋白与约 4,800 种猎物蛋白之间的蛋白质相互作用（PPI）。

方案

1. 诱饵菌株的构建与验证

  1. 如果目标诱饵菌株可在 MATa DHFR F[1,2] 文库中获得，则按照步骤 1.1.1 所述从文库中获取；否则，按照步骤 1.1.2 所述构建菌株。
    注意：本方案中使用 DHFR F[1,2] 菌株作为诱饵，DHFR F[3] 文库作为猎物，因为 DHFR F[3] 文库包含的菌株数量多于 DHFR F[1,2] 文库。然而，若诱饵菌株仅存在于 DHFR F[3] 文库中，或需要更高覆盖度的相互作用组数据，也可反向进行筛选，或在两个方向上均进行筛选。
    1. 将含有诱饵菌株的甘油保存板置于冰上解冻一小时。用 95% 乙醇对覆盖在板上的铝箔进行灭菌。用无菌枪头刺穿铝箔，反复吹打以重悬细胞，并取 2–3 μl 甘油保存液涂布于选择性酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（含 100 μg/ml 诺尔斯硫霉素，Nat）上，以分离单菌落。在 30 °C 下培养两天。
    2. 诱饵 PCA 菌株（MATa DHFR F[1,2]）的构建。
      1. 使用高保真聚合酶和标准 PCR 方法，以质粒 pAG25-linker-DHFR F[1,2]-ADHterm 为模板，通过带有末端延伸序列的引物扩增 DHFR F[1,2] 突变盒。延伸序列应分别与开放阅读框（ORF）3’端最后 40 bp（不含终止密码子）同源（正向引物），以及与基因 3’非翻译区（UTR）前 40 bp 同源（反向引物）（图 1A）。
      2. 采用标准 LiOAc/PEG 酵母转化方法29，将 PCR 产物转化入感受态酵母细胞（通常为 BY4741 菌株）中（图 1A）。
      3. 将转化产物涂布于选择性 YPD + Nat 培养基上，以筛选阳性转化子。
      4. 对分离得到的菌落进行诊断性菌落 PCR，以确认 DHFR F[1,2] 融合正确。使用以下引物：1）结合于基因编码序列中 DHFR 融合位点上游约 100 bp 处（正向寡核苷酸）；2）结合于突变盒中的 ADH 终止子区域（反向寡核苷酸）（图 1B）。
      5. 对 PCR 产物进行 Sanger 测序，以确认基因融合的准确性。
      6. 将验证后的诱饵菌株以 25% 甘油溶液形式保存于 -80 °C。
        注意：本步骤可作为暂停点。

2. 针头工具灭菌与打印操作步骤

注意：以下所述的灭菌程序是针对由 BM3-BC（S&P Robotics）机器人平台操控的针式工具进行优化的，但也可适配于其他平台。本节描述了针式工具的灭菌和点样操作流程，这些步骤用于在本方案后续部分中将细胞从一种培养基转移至另一种培养基。用于执行这些操作的内部脚本可根据要求获取。需要注意的是，所有步骤均可使用手动针式工具完成，无需依赖机器人平台30。

  1. 在机器人平台上安装合适的针具工具。
  2. 按以下步骤准备清洗和润湿站：
    1. 在水浴站中加入 500 ml 无菌水。
    2. 在刷洗站中加入 320 ml 无菌水。
    3. 当从琼脂平板（86 × 128 mm omnitray，含 35 ml 凝固培养基）复制到琼脂平板时，在超声波清洗站中加入 380 ml 70% 乙醇；若从含液体培养物的微孔板复制到琼脂平板，则加入 400 ml。
    4. 在润湿站（由一个无菌的空 omnitray 组成）中加入 35 ml 无菌水。
  3. 每天使用机器人平台前，需将针具工具在超声波清洗站中浸泡灭菌五次，每次 1 分钟。同时，开启紫外线灯照射 5 分钟，以对机器人外壳进行灭菌。
    注意：若机器人置于无菌罩内，则无需此步骤。
  4. 每次针具复制操作之间，按以下步骤对针具进行灭菌：
    1. 将针具在水浴站中浸泡五次，每次 10 秒，以去除细胞团块。
    2. 将针具在刷洗站中来回浸泡两次。
      注意：旋转刷可去除残留细胞。
    3. 将针具在超声波清洗站中浸泡两次，每次 20 秒。
      注意：针上残留的细胞将通过超声处理去除或被乙醇杀灭。
    4. 确保针具在各连续清洗步骤中的浸入深度逐步增加，以保证充分灭菌。
  5. 将针具在空气干燥站中干燥 25 秒。
  6. 在从源平板取样前，将针具浸入润湿站中润湿，该润湿站为一个含有 35 ml 无菌水的 omnitray。
  7. 将针具在源平板的菌落中浸入两次。
  8. 通过两次接触新倒制的靶平板琼脂表面进行点样（此后将此操作称为“打印”阵列）。

3. 使用自动化机器人平台将DHFR F[3]文库浓缩至1,536孔阵列

  1. 将DHFR F[3]文库（60块96孔板）和额外一块含有L-DHFR F[3]对照菌株的96孔板在冰上解冻图1C），其中包含仅表达的 DHFR F[3] 片段及上游连接序列作为阴性对照。
    注意：原则上，该片段不应与任何DHFR-融合蛋白片段发生相互作用（详见讨论部分）。
  2. 离心板（短时离心）后再移除铝箔，以避免孔间交叉污染的风险。
  3. 将收集物浓缩至16个384株阵列上（图2A）。为此，针对每个384阵列，使用96针工具在选择性YPD + 250 μg/ml潮霉素B（HygB）Omnitray平板的四个象限上分别打印四个甘油平板（此处，一个384阵列可划分为四个等间距的象限，每个象限由2×2矩阵布局的96个位置组成）。在其余60块板之间插入四块含有L-DHFR F[3]阴性对照的96孔板，以最终获得64块板，恰好填满四个1,536阵列。每次复制循环之间，按步骤2所述对针工具进行灭菌。
    注意：插入 L-DHFR F[3] 平板，确保在最终的四个 1,536 阵列中每个阵列各有一个该平板。
  4. 在30 °C条件下孵育平板两天。注意：此时，DHFR文库可于4 ˚C在琼脂平板上以384孔格式保存，最长可达一个月。
  5. 将收集物浓缩为四组，每组包含1,536个菌株（图2A）。为此，使用384针工具，将每个1,536阵列分成四个相等间隔的象限，每个象限包含384个菌株，以2×2矩阵布局排列，点样于与步骤3.2所用培养基相同的平板的四个象限上（此处，一个1,536阵列可被划分为四个均等间隔的象限，每个象限由384个位置组成，呈2×2矩阵排列）。
  6. 在30 °C下孵育平板两天。  注意：在此阶段，DHFR文库可于琼脂平板上以1,536孔格式在4 ˚C保存长达一个月。
  7. 使用1,536针工具在相同培养基上复制四组阵列，以标准化菌落大小。
  8. 在30 ˚C下孵育平板两天。

4. 高通量DHFR-PCA实验流程

  1. 取步骤 1.1.1 或 1.1.2 获得的诱饵菌株（DHFR F[1,2] 融合体），接种于 50 ml 管中的 20 ml 液体 YPD + Nat 培养基中（图 2B）。
  2. 在 30 °C、250 rpm 振荡条件下培养两天，使菌液达到饱和状态。
  3. 培养两天后，取 5 ml 菌液涂布于 YPD + Nat omnitray 上。让细胞在表面吸附 5–10 分钟，吸去多余液体（图 2B）。重复该操作两次，共制备三个重复样本。
  4. 在 30 °C 培养两天。
  5. 使用 1,536 点针工具，将步骤 4.3 和 4.4 中的诱饵菌株打印至 12 块 YPD 平板上（足以满足四块 DHFR F[3] 文库平板 × 三个重复的交配需求），每块菌苔使用不超过四次。
  6. 使用 1,536 点针工具，将相应的 DHFR F[3] 文库阵列打印至诱饵细胞上方（图 2C）。
  7. 在 30 °C 培养两天，使菌株完成交配。
  8. 使用点印法将菌落转移至含有 YPD + HygB + Nat 的 omnitray 上，以筛选双倍体细胞（图 2C）。
  9. 在 30 °C 培养两天。
  10. 按照步骤 4.8 和 4.9 所述方法重复进行双倍体筛选（图 2B）。
  11. 在使用前一天，按以下步骤制备含 MTX 的培养基平板（MTX 培养基）21（注意：MTX 为有毒化合物，操作时需格外小心。处理时应始终佩戴手套、护目镜和实验服）（图 2C）：
    1. 用去离子水配制 10x –lys/met/ade 氨基酸缺失液。使用 0.2 µm 无菌注射式滤器或在大量制备时使用 0.2 µm 瓶顶式过滤漏斗，将缺失液过滤除菌后置于无菌瓶中（表 1）。
    2. 用二甲基亚砜（DMSO）配制 10 mg/ml 的 MTX 储存液。配制后立即使用，剩余部分于 –20 °C 冻存。MTX 对光敏感，需避光保存。MTX 融化后不得再次冻存。
    3. 按以下方法配制培养基（培养基成分及用量与 Tarassov et al.11 中所用相同）：
      1. 每升培养基，在两个烧瓶中分别混合：1）6.69 g 无氨基酸及硫酸铵的酵母氮源基础培养基和 330 ml 去离子水；2）25 g noble 琼脂和 500 ml 去离子水。
      2. 121 °C 高压灭菌 20 分钟。
      3. 在 55 °C 水浴中平衡温度至少 1 小时。
      4. 将两烧瓶内容物混合，加入 50 ml 无菌 40% 葡萄糖、100 ml 无菌 10x 缺失液和 20 ml 10 mg/ml MTX 溶液。
      5. 每块 omnitray 中倒入 35 ml 培养基（见下文备注）。静置至少一个半小时使其凝固，并避光保存。
        备注：此处每块 omnitray 倒入 35 ml 培养基至关重要，以确保平板厚度一致，这对后续所有步骤均具有重要意义。
  12. 使用机器人平台或配备均匀照明的普通数码相机，对第二轮双倍体筛选的平板进行成像。利用这些图像在后续分析中识别阵列中的空位。确保相机参数始终保持一致，并开启机器人光源。
  13. 使用 1,536 点针工具，将双倍体细胞点印至 MTX 培养基上。
  14. 在塑料袋中 30 °C 培养四天，防止干燥。
  15. 按照步骤 4.11 所述方法，制备第二批含 MTX 培养基的 omnitray。
  16. 培养四天后，使用机器人平台或普通数码相机对平板进行成像。确保相机参数始终保持一致，并开启机器人光源。
  17. 将细胞转印至第二批 MTX 培养基上，进行第二轮 MTX 筛选。
    备注：此步骤可降低 PCA 菌株的背景生长，提高定量分辨率。
  18. 在塑料袋中 30 °C 培养四天，防止干燥。
  19. 按照步骤 4.16 所述方法对平板进行成像。

5. 图像分析

  1. 使用自定义的 ImageJ31 脚本或已发表的软件（如 Colonizer、Ht colony grid analyzer、Cell profiler、Colony Imager、ScreenMill、YeastXtract 和 gitter（汇总于32））分析菌落阵列图像。图像分析应输出一个或多个电子表格，其中包含每个阵列各个位置的菌落大小，将这些菌落大小用于后续所有分析。
    注意：本研究中我们采用了 Leducq et al.33 中描述的自定义 ImageJ 脚本（详见讨论部分）。

6. 数据分析

注意：图像分析的结果可以在 Excel 等表格软件中进行处理，或使用 R34 等脚本语言进行处理。以下步骤描述了使用自定义 ImageJ31 脚本的操作流程。

  1. 使用自定义脚本，将图像分析的输出文件进行合并，并为每一行添加对应的培养板和菌株信息，如补充表1所示。
  2. 对菌落大小值（整合密度或菌落面积；此处使用补充表1中的“IntDenBackSub”列）进行Log2 转换。
    注：数值分布将如图3A所示。
  3. 通过减去每块培养板的中位数值对该数据进行归一化处理。
    注：此步骤可校正由于培养基量不均或自动图像采集过程中的差异所导致的培养板偏差，并降低重复样本间的变异程度（图3B）。
  4. 验证各重复样本之间的相关性（图3C），以评估实验的可重复性。
  5. 为区分存在相互作用与无相互作用的诱饵-猎物配对，设定一个高置信度阈值，该阈值对应于L-DHFR F[3]对照组分布的第95th百分位数。
    注：在本实验中，该阈值为3.39（图3D）。或者，也可采用基于与已知物理互作蛋白（例如BioGRID35中报道的互作蛋白）重叠情况设定的阈值。详见讨论部分。
  6. 对于任意诱饵蛋白，过滤在DHFR-PCA筛选中被识别为参与假阳性相互作用的猎物蛋白（详见讨论部分），这些蛋白列于补充表2中（在“filtered”列中标记为“1”）。
  7. 计算每个相互作用三个重复样本的Log2归一化菌落大小的平均值（补充表2中的“Average score”列）。

7. 使用小规模实验验证物理相互作用因子

注意：任何得分高于或接近所用阈值、且具有研究意义的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），均可通过DHFR-PCA实验在小规模实验设计中进行验证，方法是在固体或液体MTX培养基上进行生长实验。以下步骤展示了手动构建双倍体PCA菌株并在MTX培养基上进行点种实验的操作流程。实验人员应对所有必要的对照组（包括诱饵-DHFR F[1,2] × L-DHFR F[3]、拉链连接子-DHFR双倍体菌株以及连接子-DHFR双倍体菌株）执行这些步骤。

  1. 将1.1.2.6步骤中构建的诱饵菌株甘油菌、L-DHFR F[3]对照菌株、Zipper-linker-DHFR和linker-DHFR二倍体菌株分别点种于YPD+Nat、YPD+HygB以及两份YPD+Nat+HygB培养基平板上，每点2-3 μl。
  2. 获取DHFR F[3]文库中目标猎物菌株，按照步骤1.1.1的操作进行，但将菌株划线接种于YPD+HygB培养基而非YPD+Nat培养基。
  3. 参照1.1.2.4步骤进行诊断性PCR，以确认猎物基因座处的DHFR F[3]融合，并对PCR产物进行测序验证。
  4. 用单倍体菌株（诱饵×猎物、诱饵×L-DHFR F[3]对照）分别接种1 ml液体YPD培养基，于30 °C培养至少两天，以促进二倍体形成。
  5. 取7.4步骤中的培养物4-5 μl，划线接种于固体YPD+HygB+Nat培养基以筛选二倍体，于30 °C培养两天。
  6. 挑取一个独立单菌落，于液体培养基（1 ml）中过夜培养，用于后续生长实验。
  7. 在使用前一天制备MTX平板和DMSO平板（成分与MTX培养基相同，但不含MTX）。详见步骤4.11。
  8. 通过点种不同培养物的系列稀释液至对照平板（DMSO）和筛选平板（MTX）进行生长实验。
    1. 将预培养物调整至O.D. = 1。
    2. 在无菌96孔板中进行五倍梯度稀释（最高稀释倍数达625倍）。
    3. 每种稀释液取4 μl点种于PCA培养基平板（DMSO和MTX）。
    4. 将平板置于塑料袋中，于30 °C培养以防止干燥。
    5. 使用自动化成像平台或普通数码相机，在培养第1至第7天期间定期拍摄平板图像。

结果

补充表2展示了使用酵母蛋白Nup82与DHFR F[1,2]片段融合作为诱饵所获得的代表性实验结果示例。可通过L-DHFR F[3]对照设定的阈值，作为经验性阈值来确定高置信度的互作结果（图3D和3E）。或者，也可利用得分排序进行基因本体（Gene Ontology）富集分析或其他功能分析36，并基于金标准数据37进行评估。诱饵蛋白已知的物理互作蛋白可从BioGRID等数据库35中获取，并叠加至实验数据上进行比对（图3E和3F）。在此示例中，八个高置信度互作蛋白中有五个此前已被报道为Nup82的互作蛋白，其中两个（Nup116和Nup159）属于Nup82亚复合物（图3F和3G）。该复合物的另一成员Nsp1在本实验中未检测到任何相互作用。另外两个捕获蛋白Ade17和Tef2（未在图3F中显示）的得分高于设定的严格阈值，但它们在我们已进行的PCA筛选中几乎与任何诱饵蛋白均发生互作（未发表结果），因此很可能是假阳性结果。另一方面，Pex30可能是Nup82的一个新物理互作蛋白，我们已通过低通量DHFR-PCA实验验证了该相互作用（图3G）。Pex30是一种过氧化物酶体膜蛋白，已有少量研究报道核孔复合体（NPC）与该细胞器之间存在直接相互作用。一项酵母双杂交筛选发现另外两个NPC蛋白Nup53和Asm4（Nup59）是Pex30的物理互作蛋白38，并且已有文献报道Pex30与Nup170之间存在遗传相互作用39。另外检测到的两个互作蛋白Nup120和Nup85（图3F和3G）并不属于Nup82亚复合物，这说明DHFR-PCA方法能够检测大复合物内部及亚复合物之间的相互作用11。

使用DHFR融合蛋白在单倍体和二倍体酵母菌株中进行酵母双杂交检测蛋白质相互作用的流程示意图。
图1：用于高通量DHFR-PCA的酵母菌株构建（图改编自Leducq et al. 201233）。(A) 构建单倍体MATa和MATα菌株，分别将Gene1（G1）和Gene2（G2）与DHFR F[1,2]-NatMX和DHFR F[3]-HPH盒式元件融合。盒式元件通过上游引物G1-5’和G2-5’以及下游引物G1-3’和G2-3’从质粒pAG25-DHFR F[1,2]和pAG32-DHFR F[3]中扩增获得，随后通过同源重组插入目标基因3’末端的基因组位置。所表达的蛋白P1和P2分别通过柔性连接子与DHFR F[1,2]片段（MATa）和DHFR F[3]片段（MATα）融合。(B) 通过测序验证(A)中的构建结果，测序区域为Gene1和Gene2的开放阅读框（ORF）与DHFR盒式元件之间的连接区域。构建完成的具有相反交配型的PCA菌株随后进行交配以形成二倍体。若P1与P2之间发生相互作用，使两个互补的DHFR片段相互靠近，则可恢复DHFR酶活性，从而使二倍体菌株在MTX培养基上生长。(C) DHFR-PCA筛选实验中对照二倍体PCA菌株的构建。阴性对照（L-DHFR）通过分别将质粒p41-linker-DHFR F[1,2]和p41-linker-DHFR F[3]11转化至单倍体MATa和MATα菌株中获得。两种菌株交配后形成阴性对照二倍体菌株，其中DHFR片段无法互补（上图）。阳性对照的构建方法与阴性对照类似，但所用转化质粒（p41-zipper-linker-DHFR F[1,2]（p41-ZL-DHFR F[1,2]）和p41-zipper-linker-DHFR F[3]（p41-ZL-DHFR F[3]））包含两个GCN4平行亮氨酸拉链片段，分别与互补的DHFR片段融合，从而导致强烈且持续的相互作用，恢复DHFR酶活性（下图）。请点击此处查看该图的放大版本。

酵母菌落生长实验示意图；YPD 琼脂平板、二倍体筛选、有丝分裂重组。
图 2：高通量 DHFR-PCA 实验流程（图改编自 Leducq et al.33）。 (A) MATα DHFR F[3] 菌株文库通过两轮连续浓缩，以 1536 孔格式进行整合。首先，使用 96 头接种针工具，将甘油保存菌种板上的菌株每四个一组合并至选择性 YPD + HygB 培养基上，形成 384 孔格式。随后，使用 384 头接种针工具，将 384 孔阵列每四个一组进一步合并至选择性 YPD + HygB 培养基上，形成 1536 孔格式。(B) 通过在选择性 YPD + Nat 培养基中培养诱饵菌株的饱和培养物，并将该培养物涂布于 YPD + Nat omnitray 平板上，制备 MATa PCA 诱饵菌株的菌苔。(C) 将上述菌苔用于在 YPD 培养基上使诱饵菌株与 DHFR F[3] 文库进行交配。随后，细胞依次在 YPD + HygB + Nat 培养基上连续转移两次，以筛选二倍体；再在 MTX 培养基上转移两次，以进行 PCA 分析。只有当诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用，导致 DHFR 片段互补时，才能在 MTX 培养基上观察到生长。请点击此处查看该图的放大版本。

Protein interaction density plots, correlation heatmap, network diagram, and spot assay results.
图3：通过标准化、确定显著性阈值和识别正向相互作用的步骤进行数据分析。 （A） 每块平板上菌落大小的密度分布（对数）2). （B） 通过每张图像的中位数进行归一化，可校正与不同培养板之间效应相关的偏差。 (C) 热图显示了各孔板之间的斯皮尔曼相关系数，证实了该实验方法的可重复性。 (D) 测试的PPIs与L-DHFR F[3]对照的得分分布。可将严格阈值设定为95th L-DHFR F[3] 分布的百分位数，以识别高置信度的蛋白质相互作用（由垂直虚线表示）。 (E) 每种猎物平均得分的排序分布。BioGRID 中先前报道的 Nup82p 的物理相互作用伙伴35 由圆圈标示，本研究中报告的结果以红点标示。（D）中定义的阈值以虚线表示。 (F) 显示本研究鉴定出的高置信度蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的网络。蓝色边表示先前报道的物理相互作用蛋白（BioGRID）35）和黄色边缘显示了与Pex30的一种先前未见报道的相互作用。 (G) Nup82-DHFR F[1,2] 与猎物-DHFR F[3] 配对的PCA二倍体菌株的点稀释实验，这些配对在本研究中被鉴定为Nup82p的物理相互作用子。生长实验在DMSO培养基（MTX溶剂，左图）和MTX培养基（右图）中进行。阴性对照包括Nup82-DHFR F[1,2] – Linker-DHFR F[3] 和 Linker-DHFR F[1,2] – Linker-DHFR F[3]，阳性对照为两个亮氨酸拉链结构域之间的强相互作用（zipper-DHFR F[1,2] – zipper-DHFR F[3]）。在MTX培养基中，生长优于阴性对照的菌株应解释为存在物理相互作用。 请点击此处以查看此图的放大版本。

氨基酸数量 (g)
Adenine sulfate*0.2
L-Tryptophane0.4
L-Tyrosine0.3
L-Phenylalanine0.5
L-Glutamic acid (monosodium salt)1.0
L-Asparagine1.0
L-Valine1.5
L-Threonine2.0
L-Serine3.75
Uracile0.2
L-Histidine HCl0.2
L-Arginine HCl0.2
L-Methionine*0.2
L-Lysine*0.2
L-Leucine0.6
* 进行标准 PCA（如本方案中）时应去除，但可根据其他目的添加。

表1：MTX培养基中10X -lys/met/ade缺失成分的组成。 数量为1升10倍浓缩缺失液的配比。星号标示的化合物在标准MTX培养基中应省略，但可根据其他实验目的添加。

补充表1： 12块检测板的合并数据。 表1包含使用自定义ImageJ脚本对ImageJ分析结果进行拼接后的数据，每一行对应1,536阵列上的一个单独位置。此外，每一行均已注释了图像文件、DHFR文库板、重复编号、ORF及蛋白质名称的相关信息。

补充表 2：每种菌株的平均标准化生长值。 表 2 包含文库中每种菌株的平均 Log2 标准化生长值及其标准差。经过筛选的捕获蛋白、阳性结果以及已知的物理相互作用蛋白分别在不同的列中标识。

讨论

我们描述了一种基于DHFR-PCA检测的方法，可用于高通量系统性地鉴定任意目标蛋白的物理相互作用蛋白。该方法可通过筛选更多目标蛋白，并在任意所需的重复水平上进行适应性调整。我们通过鉴定核孔复合体中一种目标蛋白Nup82的物理相互作用伙伴，验证了该方法的可靠性。我们的分析成功发现了五个先前已有报道的相互作用蛋白以及一个此前未见报道的相互作用蛋白（图3F & 3G），凸显了该方法在研究酵母蛋白质相互作用组方面的有效性。

本方案包含若干关键步骤，实验人员应予以特别关注。我们建议：1）确保诱饵蛋白DHFR F[1,2]融合构建正确（图1B）；可通过测序验证构建，并使用抗-DHFR F[1,2]或抗-DHFR F[3]抗体检测蛋白的正常表达；2）在开始筛选前，建议验证目标诱饵蛋白在蛋白质片段互补分析（PCA）筛选中是否具有非特异性相互作用。可通过将诱饵与相应的L-DHFR对照进行对照筛选，或手动将诱饵与相应的L-DHFR对照菌株杂交，并在含MTX的培养基中进行生长实验来完成验证；3）平板应在使用前一天制备，以确保琼脂表面湿度适宜，利于点样过程中细胞的附着；4）源板用于向目标板转移细胞时，不应使用超过四次。如需增加目标板的拷贝数，可通过连续扩增步骤实现（例如 4个拷贝 -> 16个拷贝 -> 64个拷贝）。或者，可在不同复制轮次之间从菌苔的不同位置或菌落中挑取细胞；5）若双倍体筛选后出现多个位置缺失，应确认源板在杂交步骤（步骤4.5至4.7）中未被过度使用；6）确保MTX培养基中含有所有必需成分且浓度正确。若在MTX培养基上完全无生长，可能是由于目标蛋白在PCA中无相互作用可被检测，也可能是MTX培养基配制不当。为确认培养基能够支持显示DHFR片段互补的菌株生长，可在文库的空位点加入一个组成型相互作用作为阳性对照，例如将DHFR片段与亮氨酸拉链结构域融合33（图1C）。同时进行使用连接肽-DHFR片段或拉链-连接肽-DHFR片段的平行实验，有助于区分允许所有细胞生长的条件（MTX浓度偏低，或诱饵蛋白易产生假阳性相互作用，如下所述）与抑制所有菌株生长的条件（MTX浓度过高或培养基中缺少必需成分）；7）由于PCA是通过从一种培养基到另一种培养基的连续复制轮次完成的，若例如在复制轮次之间未对点样针工具进行充分灭菌，和/或灭菌程序中的最后一个水浴（即 湿站）被前一轮复制的菌落污染，则可能导致不同平板间菌株的交叉污染。芯片阵列上的多个位置为空白，因此可作为对照位置，这些位置不应出现生长，可用于检测交叉污染。

可使用多种已发表的软件（参见方案第5节）或任何自定义脚本进行图像分析。本研究中，自定义脚本执行以下步骤：1）通过将每个平板的像素值减去空白平板的像素值，以校正照明偏差。2）脚本使用10的像素值阈值，将每张经背景校正的图像转换为二值图像。3）对于通过在边缘菌落上叠加矩形确定的每个平板的1,536个位置，脚本在圆形选区内运行ImageJ的“Analyze particles...”功能。该圆形选区的半径设置为两个位置之间的间隔减去10个像素。4）脚本选取距离选区中心最近的颗粒，并判断其位置是否在不超过两个菌落间距一半的范围内，若是，则确认为一个菌落。5）脚本测量所选颗粒在背景校正图像上的像素值。6）为进一步校正残余的背景照明偏差，脚本将圆形选区内不属于颗粒部分的所有像素的平均值从菌落的像素值中减去。这些校正后像素值的总和被记录在补充表1的“IntDenBackSub”列中，作为菌落大小的度量指标。

分析过程中的一个关键步骤是显著性阈值的选择。在此，我们基于负性L-DHFR F[3]对照的分布设定了阈值，但根据筛选目的的不同，该阈值可能过于严格。事实上，L-DHFR F[3]对照是过表达的（使用强TEF启动子），因此其互补片段可能发生自发互补，这并不能代表大多数蛋白质的表达情况。这一点可通过L-DHFR F[3]对照的分布高于背景生长平均水平这一事实得以说明（图3D）。因此，某些得分低于该严格阈值、但明显超出背景生长分布范围的相互作用可被视为潜在的阳性结果，可能代表例如瞬时或弱相互作用。如果两种蛋白质的表达水平不足以像L-DHFR对照那样导致DHFR片段的自发互补，则这些相互作用可进一步研究并交叉验证。另一种方法是，可根据与BioGRID35等数据库中已报道的物理互作蛋白的重叠比例来设定显著性阈值，以最大化真阳性相对于假阳性的比例。然而，与使用L-DHFR分布的方法不同，若已知的物理互作蛋白数量不足，则这种替代方法可能并不总是可行。此外，显著性阈值的选择会影响最终数据集中假阳性和假阴性的比例。确实，与其他任何PPI检测实验一样，假阳性可能源于蛋白质与DHFR融合蛋白之间的非特异性相互作用，例如当该蛋白质丰度过高时（如前所述）。这一点可通过某些“猎物”蛋白在PCA筛选中系统性地与所有“诱饵”蛋白发生相互作用的事实加以说明，因此需要从分析中剔除这些蛋白11（例如 Tef2 和 Ade17 以及 补充表2）。为避免这一问题，可在每次筛选的特定条件下，针对两个文库开展对照PCA实验，使用相应的L-DHFR对照（F[1,2]或F[3]），以识别出能引起DHFR片段自发互补的“诱饵”和“猎物”。此外，若已知某个“诱饵”蛋白的功能，进行基因本体（Gene Ontology）富集分析可提高数据的可信度。另一方面，DHFR-PCA可能因多种原因产生假阴性结果：1）并非所有蛋白质都可与DHFR片段融合，因为融合可能使蛋白质不稳定或改变其定位，例如当C末端融合DHFR干扰了定位信号时；2）在某些细胞区室中，DHFR的重建可能无法生成叶酸，例如当叶酸合成所需的关键前体物质不可获得时；3）只有当两个蛋白质的C末端间距在8 nm以内时，DHFR互补才可能发生11。因此，即使是一个已知的相互作用，若其C末端在空间上距离过远，也可能无法被检测到。这一点在本研究中表现为：数据库中报道的Nup82大量物理相互作用（其中大多数为间接相互作用）在我们的实验中均未被检测到。类似地，对于跨膜方向为trans的膜蛋白之间的相互作用，其C末端位于膜的两侧，无法实现DHFR片段的互补，因而也无法被检测到11。上述第1和第3项局限性可通过将DHFR片段融合至蛋白质N末端的方式相对容易地克服。这样做不仅可以避免干扰靠近C末端的定位信号，还可能检测到那些N末端和C末端均位于膜同侧（cis）的膜蛋白之间的相互作用。

在蛋白质相互作用网络（PIN）的研究中仍存在若干挑战（详见文献2,3）。迄今为止所构建的PIN图谱大多基于每种物种在单一实验条件下的数据，因此仅提供了蛋白质网络组织方式的一个静态快照。因此，有必要探索其他实验条件，以观察PIN如何响应环境变化、特定刺激、发育过程或基因突变而发生重组。这些挑战将通过开发可在活细胞中实时检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的新技术，以及改进现有技术以使其能够被更广泛的实验室群体所使用而逐步克服。作为一种能够定量检测DHFR互补复合物数量变化的技术27，DHFR-PCA可被用于应对上述挑战，并已被应用于研究DNA损伤剂22、化学试剂25、基因缺失23,26，以及在其他酵母物种及其杂交种中对PPI的影响33。对这些新维度的探索将变得愈发重要，以揭示PIN的动态特性。

披露

本文的部分开放获取出版费用由 S&P Robotics 支付。

致谢

本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）基金 191597、299432 和 324265、加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金以及人类前沿科学计划基金对 CRL 的资助。CRL 是加拿大卫生研究院的新研究员。Guillaume Diss 获得了 PROTEO 博士后奖学金的支持。Samuel Rochette 获得了 NSERC 和 FRQNT 博士后奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物矩阵机器人，台式配置S&P Robotics Inc.BM5-BC
96孔格式针式工具S&P Robotics Inc.PH-96-10标准96孔格式针式工具，含96根高精度浮动针
384孔格式针式工具S&P Robotics Inc.PH-384-10标准384孔格式针式工具，含384根高精度浮动针
1536孔格式针式工具S&P Robotics Inc.PH-1536-05定制1536孔格式针式工具，含0.5 mm高精度浮动针
自动化成像模块 S&P Robotics Inc.IMG-02
甲氨蝶呤 Bioshop Canada Inc.MTX440 警告：有毒化合物
潮霉素B Bioshop Canada Inc.HYG003
诺尔斯曲星二硫酸盐Werner BioAgents5010000
酵母互作组文库 Thermo ScientificYSC5849
带盖无菌Omni板 Thermo Scientific242811
抗DHFR F[1,2]抗体 Sigma-AldrichD1067
抗DHFR F[3]抗体  Sigma-AldrichD0942

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活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选
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