利用多细胞和单细胞成球实验评估人卵巢癌细胞中的干细胞特性

摘要

体外成球实验常用于鉴定肿瘤干细胞。本文比较了基于单细胞与多细胞的成球实验方法。基于单细胞的实验方法或添加甲基纤维素的方法虽然更为耗时，但结果更为准确；而在液体培养基中进行的基于多细胞的成球实验则可能受到细胞密度的显著影响。

摘要

多年研究表明，卵巢癌包含多种异质性细胞，其中存在一个被称为“癌症干细胞”（CSCs）的亚群，该亚群负责肿瘤的起始、维持以及在常规化疗后复发。因此，鉴定卵巢癌干细胞具有重要意义。一种常用于评估CSC潜能的方法 体外 是一种球体形成实验，即将细胞接种于无血清培养基中，在非黏附性培养条件下并添加生长因子，数天后对球体形成情况进行评分。本文综述了目前可用于人卵巢癌球体实验的方案，并对常用的多细胞接种实验方法与基于单细胞接种的更精确系统进行了并列分析。结果表明，多细胞接种和单细胞接种的球体形成实验均可用于研究球体形成能力 体外基于单细胞的检测方法虽然更为耗时且成本较高，但更适合对单个细胞的功能进行评估，整体结果也更为准确；而基于多细胞的检测方法则易受铺板细胞密度的影响，且需要预先进行滴定实验。在基于多细胞的检测中添加甲基纤维素可有效减少机械干扰因素。

引言

越来越多的证据表明，卵巢癌由多种不同类型的细胞混合而成，并含有所谓的“癌症干细胞”（CSCs），这些细胞负责疾病的发生、维持以及在传统细胞毒性治疗后的复发^1-3。因此，开发靶向卵巢癌干细胞的分子策略是一个重要的目标，有望改善卵巢癌患者的治疗效果。

要理解肿瘤干细胞（CSCs）的分子特征，前提是能够从非肿瘤干细胞中可靠地分离出CSCs。然而，卵巢肿瘤干细胞的鉴定仍具有挑战性。尽管已有研究报道CD133的表达和醛脱氢酶（ALDH）活性^4,5可作为标记卵巢肿瘤干细胞的指标，但部分数据表明这些标记物具有不稳定性⁶。与此一致的是，在卵巢癌中，与例如乳腺癌⁷不同，ALDH1的表达与较好的临床预后相关⁸，而被认为具有干细胞标记作用的CD44变异体的表达则无预测预后的价值⁹。最近，我们已证实胚胎干细胞蛋白SOX2的表达可赋予卵巢癌细胞干性特征¹⁰，且高水平的SOX2表达与临床上侵袭性强的卵巢癌和乳腺癌相关^11,12。因此，在本报告中，我们采用一种含有红色荧光蛋白（RFP）的慢病毒报告系统，其表达由SOX2调控区控制，以此作为分离潜在卵巢肿瘤干细胞的方法。

根据定义，肿瘤干细胞（CSCs）既能自我更新，又能分化产生所有类型的肿瘤细....

方案

1. 利用含有SOX2调控区报告构建体的慢病毒稳定转导OVCAR-3人卵巢癌细胞系的建立

1. 通过将携带报告基因构建体的 HEK 293T 包装细胞系进行转染，以产生慢病毒颗粒，该报告基因构建体可识别 SOX2 调控区域，具体方法如文献^10,21所述。
   注意：该报告基因构建体还在 tdTomato 荧光蛋白前包含 ProteoTuner Shield 系统的降解结构域。Shield1 可结合该降解结构域，从而阻止蛋白酶体降解荧光蛋白²²。
2. 用慢病毒颗粒转导 OVCAR-3 细胞，持续 24 小时。之后，移除病毒上清液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在完全培养基（RPMI 添加 10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素）中培养。
3. 48 小时后，向培养物中加入 10 μg/ml 嘌呤霉素，并持续维持 5 天，以筛选成功转导的细胞。

2. 细胞分选与铺板的准备

1. 在细胞分选前24小时，以1:1,000稀释度加入Shield1。使用未用Shield1处理的稳定转导OVCAR-3细胞作为阴性对照（图1）。吸去培养瓶中的培养基，用1×PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化3分钟。
2. 用完全培养基（见....

结果

在传统的成球实验中，RFP+ OVCAR-3细胞在初次成球实验中形成单个肿瘤球的比例约为40%，而RFP-细胞的比例为20%（图4A）。此外，RFP+细胞形成的球体体积大于RFP-细胞形成的球体。

在单细胞为基础的实验中，RFP+细胞形成的球体也多于RFP-细胞，证实了上述结果。然而，与多细胞为基础的实验相比，单细胞实验中每个接种细胞形成的球体数量有减少的趋势（图4A,B），表明在此类实验中，球体形成可能受到技术性假象的影响，例如在非黏附培养基中发生机械性球体融合或解离。

为了进一步探讨这些方面，我们比较了细胞接种密度对成球形成的影响。我们采用有限稀释法，将细胞以每孔1,000个至1个的密度接种于96孔板中，发现形成的球体数量高度依赖于初始接种的细胞数量。令人意外的是，在MGEM和基于DMEM/F12的培养基中，接种细胞数量越少，形成的球体数量反而越多，表明接种方式确实会显著影响本实验的结果（图5）。相比之下，当在基于DMEM.......

讨论

类球体培养是一种广泛使用的方法，用于检测多种人类肿瘤细胞中肿瘤干细胞的潜能，并富集具有干细胞样特性的细胞^15,25,26。在此类培养条件下，缺乏自我更新能力的癌细胞会分化并最终发生细胞死亡。尽管它们在初期可能形成细胞簇，甚至在初次检测中形成肿瘤球体，但由于不具备自我更新能力，在连续传代培养后无法维持成球能力。因此，类球体形成实验被用作替代性检测手段，以鉴定肿瘤干细胞（CSCs）并评估其在整个肿瘤细胞群体中的频率。

然而，遵循不同已发表方案进行的成球实验之间可观察到显著的变异性^5,10,27-35（表1）。在本实验室，我们此前曾报道使用添加了B-27、bFGF、肝素和SingleQuot^TM（含胰岛素、rEGF和氢化可的松）的MEGM培养基培养人卵巢癌细胞形成细胞球。其他实验室则使用完整的DMEM/F12培养基，而有些仅添加B-27和rEGF。因此在本研究中，OVCAR-3细胞的多细胞成球实验在不同条件下进行。在MEGM或DMEM/F12培养基中添加全部补充成分时，这些细胞的成球能力未.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低吸附培养板	Corning	3474
MEGM	Lonza	CC-3151
胰岛素	Lonza	CC-4136	SingleQuots™ 试剂盒
氢化可的松	Lonza	CC-4136	SingleQuots™ 试剂盒
EGF	Lonza	CC-4136	SingleQuots™ 试剂盒
EGF	Sigma	E9644	终浓度：20 ng/mL
FGF	PeproTech	100-18B	终浓度：20 ng/mL
B-27	Invitrogen/Gibco	17504-044	终浓度：1X
肝素钠-25000 IU	Ratiopharm	N68542.02	稀释比例：1:1,000
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
胎牛血清	Gibco	10500-064
RPMI 1640	Gibco	21875-034
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
Dulbecco’s PBS (1X)	Gibco	14190-094
Shield1	Clontech	632189	稀释比例：1:1,000
DMEM/F12	Gibco	21041-025
DMEM/F12（粉末）	Gibco	42400-010
甲基纤维素	Sigma	M0387
嘌呤霉素二盐酸盐	Applichem	A2856
细胞分选仪	BD		Aria III 细胞分选仪
FACS 分析仪	BD		Accuri c6 流式细胞仪
显微镜	Olympus		IX50 Osiris