需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

10.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52262

⸱

2015年2月4日

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research

本文内容

摘要

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。

摘要

多能干细胞具有无限增殖的能力，并可分化为几乎任何类型的细胞。此外，将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）的技术发展，激发了人们对定制化个体再生医学可能性的浓厚兴趣。然而，干细胞向特定谱系分化的效率仍然较低。本研究旨在描述一种通过组织工程方法从iPS细胞（iPS-RPE）分化获得视网膜色素上皮细胞（RPE）的实验方案，该方法通过生成均一的胚状体（EB）群体——一种常见的中间阶段——来实现 体外 分化。该方案采用微孔板技术生成特定大小的拟胚体（EBs）。文中还阐述了通过免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定视网膜色素上皮（RPE）蛋白及基因标志物的方法。最后，描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）分析RPE标志物，监测不同大小EBs中分化效率的过程。这些技术将有助于推动iPS细胞向RPE的分化，用于未来应用。

引言

诱导性多能干细胞（iPS细胞）是一类通过外源因子重编程体细胞而获得的多能干细胞1相比之下，胚胎干细胞（ESCs）是另一种多能干细胞，来源于囊胚的内细胞团2-3尽管来源不同，诱导多能干细胞（iPS细胞）与胚胎干细胞（ESCs）在无限自我复制能力方面具有可比性 体外 以及它们分化为任何细胞类型的能力4-5这些iPS细胞的特性使其成为个性化再生医学应用的理想候选者。近期的研究工作集中于开发高效的分化方案，以生成包括视网膜色素上皮（RPE）在内的特化成体细胞6-11.

对于iPS细胞在临床应用中的潜力，针对特定细胞类型的定向分化至关重要。目前已发表多种将ESC和iPS细胞定向分化为视网膜色素上皮（RPE）的方法，这些方法在分化效率上存在显著差异6-7, 12-16我们对发育或分化过程中调控细胞/组织命运的许多分子事件仍不清楚。近年来，研究人员致力于开发尽可能模拟胚胎发育过程的分化方案。在囊胚阶段，未定向分化的干细胞群体共同存在于一个三维微环境中。因此，人们采用了多种策略促使胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPS细胞）聚集并以三维形式生长。这些干细胞聚集体被称为类胚体（embryoid bodies, EBs）。研究表明，干细胞的类胚体分化可模拟胚胎发育的早期阶段，并能自发在其外表面形成原始内胚层。随着类胚体进一步发育，三个胚层谱系的分化细胞表型相继出现。17-18因此，基于EBs的分化方案已受到广泛关注 体外 ESC/iPS细胞的分化，是利用多能干细胞生成视网膜色素上皮（RPE）的良好候选方法13.

可以通过多种方法利用胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPS细胞）制备拟胚体（EBs）。最初，拟胚体是通过刮取贴壁生长的细胞集落，并将其维持在非贴壁悬浮培养中来制备的。然而，这种方法产生的拟胚体群体具有异质性，导致可重复性较低。悬滴培养法和基于微孔的拟胚体制备技术是另外两种常用的拟胚体制备方法，能够产生大小均一、高度可重复的拟胚体。此外，微孔技术能够以较少的操作获得大量细胞聚集体。

EBs 中细胞的分化受到来自细胞外和细胞内微环境的多种形态发生信号的调控。与单层培养条件下的分化相比，EBs 为细胞的复杂组装以及细胞间信号传递提供了平台17。有趣的是，用于形成单个 EBs 的多能干细胞数量被发现会影响细胞的命运。例如，在一项关于人胚胎干细胞造血分化的研究中，观察到由 500 个细胞形成的 EB 更倾向于向髓系分化，而由 1,000 个细胞形成的 EB 则更倾向于向红系分化20。在另一项研究中，较小的 EBs 更有利于内胚层分化，而较大的 EBs 则促进神经外胚层分化11, 17。

既往研究强烈表明，用于形成单个胚胎小体（EB）的胚胎干细胞（ESC）/诱导多能干细胞（iPS细胞）数量会影响EB向各类细胞分化的程度。然而，据我们所知，目前尚无研究阐明EB大小对其向视网膜色素上皮细胞（RPE）分化倾向的影响。本研究旨在表征EB大小对诱导多能干细胞（iPS细胞）向视网膜色素上皮（iPS-RPE）分化的影响，并确定用于定向诱导RPE谱系分化的最佳EB形成细胞数量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 培养试剂和培养板的准备

  1. 通过将100 ml的5倍无血清添加剂加入400 ml干细胞基础培养基中，制备无饲养层干细胞培养基。该培养基在4 °C下可稳定保存最多2周，在-20 °C下可保存6个月。
  2. 将10 µM的Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rock）抑制剂（Y-27362）溶液加入市售的拟胚体（EB）形成培养基中。
  3. 通过向DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）中添加0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、10%敲除血清替代物（KSR）和10 µg/ml庆大霉素，制备分化培养基。
  4. 通过向最低必需培养基Eagle（MEM）中添加1倍N1添加剂、0.1 mM非必需氨基酸、250 µg/ml牛磺酸、13 ng/ml三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml氢化可的松、5 µg/ml庆大霉素和15%胎牛血清（FBS）21，制备iPS-RPE培养基。调节pH至7.4。
  5. 制备三碘甲腺原氨酸钠盐储备液。将1 mg三碘甲腺原氨酸钠盐在1 N氢氧化钠中轻轻旋转溶解。加入49 ml MEM，配制成50 ml浓度为20 µg/ml的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于-20 °C冷冻保存，使用时根据需要取适当体积稀释至终浓度。
  6. 制备氢化可的松储备液。将1 mg氢化可的松在1 ml 100%乙醇中轻轻振荡溶解。加入19 ml MEM，配制成20 ml浓度为50 µg/ml的氢化可的松储备液。分装后于-20 °C冷冻保存，使用时根据需要取适当体积稀释至终浓度。
  7. 用DMEM/F12配制浓度为1 mg/ml的分散酶工作液。
  8. 基质包被板的制备
    1. 将从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肉瘤细胞提取的蛋白基质用DMEM/F12稀释至0.08 mg/ml。每孔加入1 ml基质溶液包被6孔板。室温孵育1小时。
    2. 孵育1小时后，吸除多余DMEM/F12液体，每孔加入0.5 ml无饲养层干细胞培养基以防止孔壁干燥。基质包被板即可使用。
  9. 用2 ml DMEM/F12冲洗每个微孔，制备微孔板。吸除DMEM/F12后，每孔加入0.5 ml含Rock抑制剂的EB形成培养基。以2,000 × g离心5分钟，以去除气泡。
  10. 通过将2% FBS和0.09%叠氮化钠溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备FACS染色缓冲液。调节缓冲液pH至7.4。
  11. 通过向DMEM/F12中加入10% FBS，制备胰酶中和溶液。

2. iPS 细胞培养

  1. 在接种iPS细胞之前，将无饲养层干细胞培养基预热至37 °C，并准备好已包被基质的培养板。
  2. 将IMR90-1 iPS细胞在37 °C水浴中快速解冻。随后从水浴中取出冻存管，用70%乙醇擦拭管壁。使用2 ml移液器将细胞转移至15 ml锥形离心管中，以尽量减少细胞团块的破碎。
  3. 逐滴加入5 ml预热的无饲养层干细胞培养基，轻柔混匀。在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  4. 用2 ml无饲养层干细胞培养基小心重悬细胞团块，并将细胞团块接种至已包被基质的培养板孔中。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。
  5. 每日更换iPS细胞培养基。接种后5至7天观察未分化的细胞集落。在光学显微镜下检查中心致密、适合传代的未分化集落。

3. iPS 细胞的传代

  1. 在开始传代iPS细胞之前，将dispase溶液、DMEM/F12和无饲养层干细胞培养基在水浴中预热至37 °C。
  2. 传代iPS细胞前，通过刮除分化区域并吸除培养基来去除任何分化区域。用2 ml DMEM/F12小心冲洗iPS细胞。
  3. 每孔加入1 ml浓度为1 mg/ml的dispase，于37 °C孵育7分钟。吸除dispase后，用2 ml DMEM/F12轻轻冲洗细胞集落两次。冲洗后，每孔加入2 ml无饲养层干细胞培养基。
  4. 使用5 ml移液管轻轻刮取培养板上的细胞集落，形成细胞团块。将脱落的细胞团块转移至15 ml锥形管中。加入足量的无饲养层干细胞培养基，用于接种下一次传代的细胞。

4. 使用微孔板生成拟胚体

  1. 诱导多能干细胞单细胞悬液的制备
    1. 移除诱导多能干细胞的培养基，并用 2 ml DMEM/F12 洗涤细胞。在 6 孔板的每孔中加入 750 µl accutase。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育，使细胞从培养板表面脱落（约 5–10 分钟）。
    2. 使用移液器轻轻吹打，使残留的细胞解离并脱离培养板表面。将细胞转移至 50 ml 锥形管中。用 5 ml DMEM/F12 洗涤培养板，并将洗涤液与细胞悬液合并至锥形管中。将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网，以去除可能存在的细胞团块。
    3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，去除 accutase。将细胞沉淀重悬于拟胚体形成培养基中，使细胞浓度约为 0.5–1.0 × 107 个细胞/ml。
    4. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数，确定活细胞数量。
  2. 调整微孔板中细胞密度以形成尺寸可控的拟胚体
    1. 根据所需拟胚体大小，调整每个微孔中的细胞数量。将细胞加入第 1.9 步准备好的微孔板中，通过轻柔反复吹打使细胞均匀分布。
      注意：每孔所需细胞数 = 每个拟胚体所需细胞数 × 每孔微孔数量。
    2. 向微孔中补充含 Rock 抑制剂的拟胚体形成培养基，调整终体积为 2.0 ml。通过轻柔吹打重新混匀各孔中的细胞。将微孔板以 100 × g 离心 3 分钟。将板置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度的培养箱中培养 24 小时。
  3. 从微孔板中收集拟胚体
    1. 使用 1 ml 移液器反复吹打微孔中的培养基，将大部分拟胚体吹下并收集。将拟胚体悬液通过倒置的 40 µm 细胞滤网，滤入 50 ml 锥形管中，以去除单个细胞。
    2. 用 1 ml DMEM/F12 洗涤微孔板 5 次，以回收所有残留的拟胚体。收集每次洗涤液并经倒置的细胞滤网过滤。将细胞滤网翻转至新的 50 ml 锥形管上，用拟胚体形成培养基冲洗以收集滤网上的拟胚体。计数拟胚体以确定收获量。

5. 胚状体铺板与分化诱导

  1. 将拟胚体接种于包被有蛋白基质的六孔板中（同1.8.1步骤），密度为 < 每孔1,000个EB，置于EB形成培养基中，并添加10 µM Rock抑制剂。将EB在37 °C、5% CO₂条件下培养2 和95%湿度下培养24小时。
  2. EB 接种后 24 小时，更换为分化培养基以启动分化。每隔一天更换一半分化培养基，直至细胞收集用于进一步分析。
  3. 在第6、17、29和60天收集样本，进行RT-PCR、免疫细胞化学和FACS分析，以验证特征性RPE基因和蛋白的表达。

6. RNA 提取与 PCR

  1. 根据市售试剂盒提供的说明，从EB样本中提取RNA。使用分光光度计测定RNA浓度。
  2. 对100 ng总RNA，按照市售RNA反转录为cDNA试剂盒的说明进行反转录反应。
  3. 使用以下引物（表1），取10 ng cDNA进行PCR扩增，引物终浓度为10 µmol / 10 ng cDNA。PCR程序设置如下：95 °C 变性5 min，随后进行35个循环（95 °C 15 sec，60 °C 30 sec，72 °C 1 min），最后在72 °C 延伸10 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

7. 免疫细胞化学

  1. 在室温下用 PBS 洗涤 EBs 两次。在室温下用 4% 多聚甲醛固定 EBs 10 分钟。在室温下用 PBS 冲洗一次。将样品保存在 4 °C 的 PBS 中，待染色时使用。
  2. 染色当天，用固定和通透试剂处理固定后的细胞。在室温下用封闭液（含 10% 山羊血清的通透溶液）孵育样品 1 小时。
  3. 在含 10% 山羊血清的通透溶液中进行免疫化学染色，使用以下一抗及其指定稀释比例：anti-Pax6 (1:10)、anti-RX (1:200)、anti-MITF (1:30) 和 anti-ZO1 (1:100)。在 4 °C 下与相应一抗孵育过夜。
  4. 次日，从细胞中移除一抗，并用 PBS 冲洗样品三次。在室温下用荧光标记的二抗孵育样品 1 小时。
  5. 从细胞中移除二抗，并用 PBS 冲洗样品三次。将盖玻片用含 DAPI 的封片剂封固于载玻片上，置于避光环境中过夜固化。使用荧光显微镜观察染色结果。

8. FACS 分析染色

  1. 用 PBS 清洗培养的拟胚体两次。加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 5–10 分钟，以获得单细胞悬液。用胰蛋白酶中和液（1 ml/孔）中和胰蛋白酶。
  2. 将单细胞悬液转移至 15 ml 圆底离心管中，在 600 × g 条件下离心 10 分钟。
  3. 弃去上清液，在离心管中的细胞中加入 10 ml DMEM/F12 培养基。轻轻颠倒混匀细胞。在 600 × g 条件下离心。离心后弃去上清液，将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液中。
  4. 计数总细胞数。在 600 × g 条件下离心 10 分钟。离心后弃去上清液。立即加入 0.5 ml 4% 多聚甲醛固定细胞。轻轻涡旋充分混匀。将细胞在 4 °C 下孵育 20 分钟。
  5. 在 600 × g 条件下离心 10 分钟，去除上清液。轻轻涡旋以打散细胞沉淀。加入 1 ml 冰冷的通透化溶液进行细胞通透化处理。轻轻涡旋混匀，并在冰上孵育 30 分钟。
  6. 在 600 × g 条件下离心 10 分钟，去除上清液。加入 3 ml FACS 染色缓冲液并重悬细胞。重复此步骤一次。将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液中，最终浓度为 5 × 106 个细胞/ml。
  7. 将 100 μl 细胞悬液（含 0.5 × 106 个细胞）转移至各微量离心管中，并加入推荐体积的一抗。对于 Pax6 染色，在 100 μl 细胞悬液中加入 5 µl PE 标记的抗-Pax6 抗体。对于 MITF 染色，在 100 μl 细胞悬液中加入 5 µl 抗-MITF 抗体。
  8. 混匀后在室温下孵育 60 分钟。加入 3 ml FACS 染色缓冲液。混匀后在 600 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并重复本步骤两次。
  9. 对于 MITF 染色，将细胞与二抗（山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488）在 4 °C 下孵育 1 小时，稀释比例为 1:2,000。对于 Pax6 染色，跳过此步骤。
  10. 用 5 ml FACS 染色缓冲液洗涤细胞，在 600 × g 条件下离心 10 分钟。重复该过程两次。
  11. 将细胞重悬于 500 μl FACS 染色缓冲液中，轻轻涡旋以打散细胞沉淀。样品即可用于流式细胞术分析。

9. iPS-RPE 的分离与培养

  1. 在第29天，使用200 µl移液器吸头小心地在培养板上围绕选定的色素化菌落进行切割。将漂浮的菌落转移至15 ml锥形管中。在室温下以600 × g离心10分钟，并弃去上清液。
  2. 用10 ml DMEM/F12重悬细胞菌落，并以600 × g离心10分钟。弃去上清液。
  3. 加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育7–10分钟，使菌落解离成单细胞悬液。轻轻涡旋细胞悬液以充分分散菌落。
  4. 加入2 ml iPS-RPE培养基以中和胰蛋白酶。以600 × g离心10分钟，并弃去上清液。将单细胞重悬于2 ml iPS-RPE培养基中，转移至包被有蛋白基质的6孔板中，置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中培养。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在本实验中，将诱导性多能干细胞（iPS细胞）进行培养，并通过胚胎样体（EB）诱导其分化为视网膜色素上皮（RPE）谱系。利用微孔板技术形成尺寸可控的EB。如图1所示，微孔板中EB的形成具有良好的均一性。随后收集这些EB并接种于6孔板中（图2）。

RPE 可通过其典型的六边形形态、色素沉着以及 RPE 标志物的表达来鉴定。培养 12 周后，由 200 个细胞形成的 EB 出现了星形胶质细胞和成纤维细胞的形态，这些细胞中未观察到色素沉着（图 3A）。较大的 EB 则发育出具有典型 RPE 形态和色素沉着的单层细胞（图 3B 和 图 3C）。通过免疫细胞化学检测 RPE 标志物 MITF 和 ZO1，结果显示来源于 500 个细胞和 3,000 个细胞的 EB 均共表达这两种蛋白（图 4）。

通过PCR监测眼区和视网膜色素上皮（RPE...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

为了充分实现多能干细胞在细胞治疗中的潜力，必须以一致且可重复的方式调控其分化。本报告介绍了利用微孔板技术形成尺寸可控的拟胚体（EBs）、启动向视网膜色素上皮（RPE）分化的步骤，以及鉴定RPE蛋白和基因标志物的方法。为同步 体外 通过强制聚集法，在微孔板中将已知数量的iPS细胞离心，形成大小均一的拟胚体（EBs）。采用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测视网膜色素上皮（RPE）蛋白和基因的表达情况。最后，通过流式细胞术（FACS）分析不同大小EBs的分化效率。这些技术可促进iPS细胞向RPE的分化，为其未来的应用提供支持。

该方法中有几个关键步骤必须仔细执行，以确保本实验方案的成功以及获得准确的数据。第一个关键步骤出现在iPS细胞培养过程中。iPS细胞必须维持在多能状态，以保持其干性。为维持适当水平的bFGF，培养基必须每天更换，并且每天需仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，细胞具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文所包含的观点或主张均为作者的个人观点，不应被视为官方立场，也不代表美国陆军部或美国国防部的观点。本研究是在作者 Alberto Muñiz、Ramesh R Kaini、Whitney A Greene 和 Jae-Hyek Choi 担任美国陆军研究所（USAISR）国家研究委员会博士后研究协会成员期间完成的。本工作得到了美国陆军临床康复医学研究计划（CRMRP）和军事作战医学研究计划（MOMRP）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
mTeSR1 培养基 + 5x 补充剂Stem Cell Technologies5850
Y-27632（ROCK 抑制剂）Stem Cell Technologies72304
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-巯基乙醇SigmaM-7154
非必需氨基酸Hyclone(Fisher)SH30853.01
Knockout 胎牛血清替代物Life Technologies10828-028
Gentamicin Life Technologies15750-060
L-谷氨酰胺Life Technologies25030-081
MEM 培养基Life Technologies10370-021
N1 补充剂SigmaN-6530-5ML
牛磺酸SigmaT-8691-25G
氢化可的松SigmaH0888-1G
胎牛血清Hyclone(Fisher)SH3008803HI
三碘甲腺原氨酸钠 盐SigmaT6397
氢氧化钠SigmaS5881
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
磷酸盐缓冲液Hyclone(Fisher)10010-023
Aggrewell 400 培养板Stem Cell Technologies27940
AggreWell 培养基Stem Cell Technologies5893
AccutaseStem Cell Technologies7920
BD Cytofix/Cytoperm 固定/通透试剂盒BD Biosciences554714
小鼠抗 PAX6 抗体Developmental Studies Hybridoma Bank
兔抗 RX 抗体AbcamAb23340
小鼠 抗 MITF 抗体Thermo ScientificMS-772-P
兔抗 ZO-1 抗体Invitrogen40-2200
RNeasy plus mini 试剂盒Qiagen74134
PCR master mixPromegaM7502
高容量 RNA 反转录 cDNA 试剂盒Life Technologies4387406

参考文献

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

诱导性多能干细胞类胚体形成微孔板技术定向分化免疫细胞化学RT-PCR分析荧光激活细胞分选RPE标志物表达细胞培养孵育
通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。