通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

摘要

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。

摘要

多能干细胞具有无限增殖的能力，并可分化为几乎任何类型的细胞。此外，将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）的技术发展，激发了人们对定制化个体再生医学可能性的浓厚兴趣。然而，干细胞向特定谱系分化的效率仍然较低。本研究旨在描述一种通过组织工程方法从iPS细胞（iPS-RPE）分化获得视网膜色素上皮细胞（RPE）的实验方案，该方法通过生成均一的胚状体（EB）群体——一种常见的中间阶段——来实现 体外 分化。该方案采用微孔板技术生成特定大小的拟胚体（EBs）。文中还阐述了通过免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定视网膜色素上皮（RPE）蛋白及基因标志物的方法。最后，描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）分析RPE标志物，监测不同大小EBs中分化效率的过程。这些技术将有助于推动iPS细胞向RPE的分化，用于未来应用。

引言

诱导性多能干细胞（iPS细胞）是一类通过外源因子重编程体细胞而获得的多能干细胞¹相比之下，胚胎干细胞（ESCs）是另一种多能干细胞，来源于囊胚的内细胞团^2-3尽管来源不同，诱导多能干细胞（iPS细胞）与胚胎干细胞（ESCs）在无限自我复制能力方面具有可比性 体外 以及它们分化为任何细胞类型的能力^4-5这些iPS细胞的特性使其成为个性化再生医学应用的理想候选者。近期的研究工作集中于开发高效的分化方案，以生成包括视网膜色素上皮（RPE）在内的特化成体细胞^6-11.

对于iPS细胞在临床应用中的潜力，针对特定细胞类型的定向分化至关重要。目前已发表多种将ESC和iPS细胞定向分化为视网膜色素上皮（RPE）的方法，这些方法在分化效率上存在显著差异^{6-7, 12-16}我们对发育或分化过程中调控细胞/组织命运的许多分子事件仍不清楚。近年来，研究人员致力于开发尽可能模拟胚胎发育过程的分化方案。在囊胚阶段，未定向分化的干细胞群体共同存在于一个三维微环境中。因此，人们采用了多种策略促使胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPS细胞）聚集并以三维形式生长。这些干细胞聚集体被称为类胚体（embryoid bodies, EBs）。研究表明，干细胞的类胚体分化可模拟胚胎发育的早期阶段，并能自发在其外表面形成原始内胚层。随着类胚体进一步发育，三个胚层谱系的分化细胞表型相继出现....

方案

1. 培养试剂和培养板的准备

1. 通过将100 ml的5倍无血清添加剂加入400 ml干细胞基础培养基中，制备无饲养层干细胞培养基。该培养基在4 °C下可稳定保存最多2周，在-20 °C下可保存6个月。
2. 将10 µM的Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rock）抑制剂（Y-27362）溶液加入市售的拟胚体（EB）形成培养基中。
3. 通过向DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）中添加0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、10%敲除血清替代物（KSR）和10 µg/ml庆大霉素，制备分化培养基。
4. 通过向最低必需培养基Eagle（MEM）中添加1倍N1添加剂、0.1 mM非必需氨基酸、250 µg/ml牛磺酸、13 ng/ml三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml氢化可的松、5 µg/ml庆大霉素和15%胎牛血清（FBS）²¹，制备iPS-RPE培养基。调节pH至7.4。
5. 制备三碘甲腺原氨酸钠盐储备液。将1 mg三碘甲腺原氨酸钠盐在1 N氢氧化钠中轻轻旋转溶解。加入49 ml MEM，配制成50 ml浓度为20 µg/ml的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于-20 °C冷冻保存，使用时根据需要取适当体积稀释至终浓度。
6. 制备氢化可的松储备液。将1 mg氢化可的松在1 ml 100%乙醇中轻轻振荡溶解。加入19 ml MEM，配制成....

结果

在本实验中，将诱导性多能干细胞（iPS细胞）进行培养，并通过胚胎样体（EB）诱导其分化为视网膜色素上皮（RPE）谱系。利用微孔板技术形成尺寸可控的EB。如图1所示，微孔板中EB的形成具有良好的均一性。随后收集这些EB并接种于6孔板中（图2）。

RPE 可通过其典型的六边形形态、色素沉着以及 RPE 标志物的表达来鉴定。培养 12 周后，由 200 个细胞形成的 EB 出现了星形胶质细胞和成纤维细胞的形态，这些细胞中未观察到色素沉着（图 3A）。较大的 EB 则发育出具有典型 RPE 形态和色素沉着的单层细胞（图 3B 和 图 3C）。通过免疫细胞化学检测 RPE 标志物 MITF 和 ZO1，结果显示来源于 500 个细胞和 3,000 个细胞的 EB 均共表达这两种蛋白（图 4）。

通过PCR监测眼区和视网膜色素上皮（RPE.......

讨论

为了充分实现多能干细胞在细胞治疗中的潜力，必须以一致且可重复的方式调控其分化。本报告介绍了利用微孔板技术形成尺寸可控的拟胚体（EBs）、启动向视网膜色素上皮（RPE）分化的步骤，以及鉴定RPE蛋白和基因标志物的方法。为同步 体外 通过强制聚集法，在微孔板中将已知数量的iPS细胞离心，形成大小均一的拟胚体（EBs）。采用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测视网膜色素上皮（RPE）蛋白和基因的表达情况。最后，通过流式细胞术（FACS）分析不同大小EBs的分化效率。这些技术可促进iPS细胞向RPE的分化，为其未来的应用提供支持。

该方法中有几个关键步骤必须仔细执行，以确保本实验方案的成功以及获得准确的数据。第一个关键步骤出现在iPS细胞培养过程中。iPS细胞必须维持在多能状态，以保持其干性。为维持适当水平的bFGF，培养基必须每天更换，并且每天需仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，细胞具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mTeSR1 培养基 + 5x 补充剂	Stem Cell Technologies	5850
Y-27632（ROCK 抑制剂）	Stem Cell Technologies	72304
DMEM/F12	Life Technologies	11330-032
2-巯基乙醇	Sigma	M-7154
非必需氨基酸	Hyclone(Fisher)	SH30853.01
Knockout 胎牛血清替代物	Life Technologies	10828-028
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081
MEM 培养基	Life Technologies	10370-021
N1 补充剂	Sigma	N-6530-5ML
牛磺酸	Sigma	T-8691-25G
氢化可的松	Sigma	H0888-1G
胎牛血清	Hyclone(Fisher)	SH3008803HI
三碘甲腺原氨酸钠 盐	Sigma	T6397
氢氧化钠	Sigma	S5881
Dispase	Life Technologies	17105-041
Matrigel	BD Biosciences	354277
磷酸盐缓冲液	Hyclone(Fisher)	10010-023
Aggrewell 400 培养板	Stem Cell Technologies	27940
AggreWell 培养基	Stem Cell Technologies	5893
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
BD Cytofix/Cytoperm 固定/通透试剂盒	BD Biosciences	554714
小鼠抗 PAX6 抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank
兔抗 RX 抗体	Abcam	Ab23340
小鼠 抗 MITF 抗体	Thermo Scientific	MS-772-P
兔抗 ZO-1 抗体	Invitrogen	40-2200
RNeasy plus mini 试剂盒	Qiagen	74134
PCR master mix	Promega	M7502
高容量 RNA 反转录 cDNA 试剂盒	Life Technologies	4387406