近红外光可提高小鼠前庭感觉上皮中线粒体功能标志物的表达

摘要

线粒体功能障碍是细胞衰老的一个标志。本文采用无创近红外（NIr）治疗来改善衰老小鼠前庭感觉上皮中的线粒体功能。

摘要

针对随年龄增长而出现的平衡功能衰退，目前的干预策略主要集中于物理治疗，包括平衡训练和运动锻炼。然而，这些方法并未解决平衡功能下降的根本原因。本研究利用小鼠评估了近红外光（NIr）对前庭感觉上皮细胞代谢的影响。所获得的数据表明，这种简单且安全的干预手段可能保护这些易受损的细胞免受自然衰老的有害影响。研究人员从分离的周围前庭感觉上皮（壶腹嵴和椭圆囊斑）中提取mRNA，并将其反转录为cDNA文库。随后，通过检测普遍存在的抗氧化基因（SOD-1）的表达水平来评估该文库。抗氧化基因的表达被用于量化细胞代谢活性。通过经颅方式向年轻（4周龄）和年长（8至9月龄）小鼠施加近红外光，并采用短期治疗方案（每天90秒，持续5天），本研究结果提示，仅使用近红外光即可有效改善前庭感觉上皮中的线粒体功能。鉴于目前尚无可用、经济且无创的疗法可用于改善前庭毛细胞功能，外源性近红外辐射的应用为对抗衰老对前庭感觉上皮细胞代谢影响提供了一种潜在策略。

引言

平衡能力下降及随之而来的跌倒现象在自然衰老过程中十分常见，且不幸地成为老年人群的典型特征¹。这种功能衰退不仅带来身体上的影响，也造成社会功能的受限，显著降低了老年人的生活质量。针对这一问题，物理治疗和康复训练一直是防跌倒研究的重点，但其在持续降低反复跌倒发生率方面的效果尚不明确。与此同时，针对外周或中枢前庭系统（负责维持平衡的系统）变化的研究较为匮乏，针对这些系统及其失衡根本原因的潜在治疗策略也十分有限。

年龄相关性神经退行性疾病（包括年龄相关性黄斑变性）的最新研究进展^2-4，阿尔茨海默病模型^5-8，以及帕金森病^9-12 已证明近红外光（NIr）的简单无创应用具有神经保护作用。此外，在前庭系统中，NIr已被用于增强前庭初级传入神经元的活性。 体外¹³尽管近红外光（NIr）的作用机制尚未完全明确，但大多数使用NIr的研究均提示，NIr可刺激线粒体复合物IV（细胞色素c氧化酶）^14-17 以促进细胞代谢。在前庭感觉上皮中，I型毛细胞的皮下板富含线粒体。¹⁸ 因此可能是近红外光（NIr）治疗的作用位点。

本文介绍了一种简短、无创的经颅近红外光（NIr）治疗方案，可用于检测小鼠前庭感觉上皮中的细胞代谢（从而间接反映线粒体功能）。同时描述了前庭感觉上皮的制备方法，并展示了NIr可增加感觉上皮中一种普遍存在的抗氧化剂（超氧化物歧化酶1，SOD1）的表达——此前研究已证明该蛋白对耳蜗毛细胞的存活具有重要作用¹⁹。

方案

伦理声明：以下所述所有操作程序均已获得悉尼大学动物伦理委员会批准。

1. 动物

注意：1 月龄及 8–9 月龄的小鼠（C57/BL6）购自澳大利亚珀斯的动物资源中心。小鼠饲养于悉尼大学的博世啮齿类动物设施中。

1. 标准鼠笼中饲养的家鼠，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水 随意摄取.
2. 将每个年龄组的小鼠分为近红外光（NIr）处理组和假处理组（对照组）进行比较。

2. 近红外（NIr）照射与假照射处理

1. 使用电动剃刀尽可能贴近皮肤剃除小鼠头部和颈部区域的毛发，以防止在治疗方案完成前毛发快速再生。为维持小鼠的无病原状态，在不同动物间剃毛时，需用70%乙醇清洁器械；来自不同笼子的动物之间则使用F10兽用消毒剂进行消毒。此操作应在治疗开始前2 - 3天进行，以避免对动物造成过度操作。
2. 通过握住小鼠尾部近端固定其身体，并将其置于单手手掌或实验台面上使其放松，以尽量减少可能引起假性结果的应激反应。
3. 将近红外（670 nm）LED（发光二极管）设备置于暴露（已剃毛）区域上方1 - 2 cm处，并开启设备照射90秒（图1A）。
   注意：在100 ml水中测得照射90秒所导致的温度变化为<0.2 °C。
4. 对假处理组动物重复步骤2.2 - 2.3，但保持设备关闭状态（图1B）。
5. 对近红外光阻断处理组动物重复步骤2.2 - 2.3，但需用铝箔覆盖设备。
6. 每日重复步骤2.2 - 2.5 ，每次间隔约24小时，连续5天。
7. 在治疗后第五天，从小鼠双侧耳中提取前庭感觉上皮组织（3个壶腹嵴和1个椭圆囊斑）（见下文第3节）。

3. 组织提取²⁰

1. 配制 300 ml 甘油基人工脑脊液（ACSF），其成分如下（单位：mM）：26 NaHCO₃₃，11 葡萄糖，250 甘油，2.5 KCl，1.2 NaH₂PO₄，1.2 MgCl₂，以及 2.5 CaCl₂. 在加入 CaCl 之前₂，用碳合气（95% O₂，5% CO₂）向溶液通气₂ 和5% CO₂₂) 调节pH至7.4，以避免钙沉淀（溶液浑浊）。将溶液置于-80 °C冰箱中冷却45分钟，使形成冰浆。
2. 在已标记的螺旋盖微量离心管中配制RNA分离裂解缓冲液（可防止在液氮中冻融过程中因管内压力变化导致管盖弹开），具体操作按照制造商说明或实验室常规操作进行。准备好装有液氮的铝制杜瓦瓶。
   注意：操作液氮时需穿戴防护服和护目镜。确保在通风良好的房间内使用液氮，因其气态体积约为液态时的700倍，可能导致窒息。
3. 通过腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）使小鼠深度麻醉。待后肢反射完全消失，作为小鼠已充分麻醉的指征。
4. 用锋利的不锈钢剪刀将小鼠断头，然后使用刀片（圆形#22）沿颅骨矢状面皮肤做切口。自此步骤起及后续操作中 步骤 3.5 - 3.9定期将冰冻的ACSF溶液施加于组织上，以尽可能保持颅骨穹窿、脑组织及下方前庭器官的低温状态。
5. 使用标准图案剪刀的尖头端在人字缝处的颅骨上做一个小切口，并沿矢状缝剪开。
6. 将浅口咬骨钳的一侧钳臂轻轻滑入顶骨下方，使钳刃尽可能贴近颅骨内面，但避免拖拽脑组织。固定后，将顶骨向侧方、枕骨向后方移除，直至暴露脑组织。
7. 使用小型不锈钢刮勺将脑组织从前颅窝和中颅窝抬起，以暴露前庭蜗神经（CN VIII）。切断该神经，以避免对直接支配前庭毛细胞的初级传入轴突产生不必要的张力。
8. 取出大脑 整体上 在切断前庭蜗神经（CN VIII）后。
9. 在颅中窝观察包含耳蜗和周围前庭器官的骨迷路。在每个骨迷路旁做两个小切口，握住前半规管并向外侧牵拉，完整切除该结构。
10. 立即将切除的迷路组织浸入含有冰冻人工脑脊液（ACSF）的解剖培养皿中（具体配制方法见下文描述）。 步骤 3.1）同时持续用碳合气灌注。
11. 在体视显微镜下，用镊子夹住耳蜗固定迷路，并将其固定在培养皿底部。
    1. 使用直型精细镊子在前半规管（SSC）壶腹上方的骨质上刮出一个小开口。
    2. 轻轻触及骨性结构下方，向外侧快速拨动，以扩大此开口。操作时需格外小心，避免将镊子插入开口过深，以免损伤下方脆弱的膜迷路结构。以此方式继续操作，直至前庭、前半规管壶腹和外侧半规管壶腹均完全暴露。若条件允许，亦可一并去除后半规管壶腹。
12. 使用精细镊子轻轻将椭圆囊和壶腹从骨迷路中抬起，直至完全分离。尽可能通过与其相连的半规管进行夹持，以避免损伤感觉上皮。在某些情况下，可能需要用虹膜剪剪开膜性半规管的近端，以使壶腹从骨组织中释放。
13. 用镊子尖端牢固夹住前庭器官，并放入先前准备好的裂解缓冲液中 步骤 3.2轻轻晃动镊子周围的缓冲液，以确保前庭器官已从镊子上脱落。将镊子置于体视显微镜下观察，确认前庭器官是否已完全脱离。
    1. 拧上微量离心管盖，并立即在液氮中冷冻样品。

4. RNA 提取与逆转录 PCR

1. 根据制造商说明书或实验室常用方案，采用标准方法提取信使RNA（mRNA）。
   注意：本实验方案中使用了一种商业试剂盒，该试剂盒利用载体RNA帮助分离少量mRNA。可使用较小的洗脱体积以提高mRNA的最终浓度。
   注意：必须同时完成“无酶”阴性对照（NECs）和“无DNA模板”对照（NTCs），以确保所观察效应的有效性。
2. 采用标准方法将mRNA逆转录为互补DNA（cDNA），并扩增目标基因^21-23。

结果

为了比较近红外光（NIr）处理对年轻（4周）和年老（8-9个月）小鼠的影响，我们检测了经NIr处理、假处理或NIr阻断的年轻小鼠（n = 16）和年老小鼠（n = 20）中抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD-1）的表达水平。图2显示，与年轻假处理小鼠相比，年轻NIr处理小鼠中经β-actin归一化的SOD-1表达水平显著升高，超过2倍（p < 0.01）；与年轻NIr阻断小鼠相比亦显著升高，超过2倍（p < 0.01）。与年老NIr阻断小鼠相比，年老NIr处理小鼠的SOD-1表达也上调了2倍以上（p < 0.05）。

图1. 近红外（NIr）治疗。（A） ...

讨论

此处描述的代表性结果表明，与假照光处理的小鼠相比，对老年小鼠进行短暂的经颅近红外光照射（每天90秒，持续5天）足以提高其抗氧化蛋白的表达水平。尽管如大鼠前庭传入神经所报道的那样，发射的热量可能成为线粒体和/或神经元激活的一种来源²⁴ – 我们对近红外LED设备发射的热量的测量结果为 <90秒内温度升高0.2°C，因此不太可能引起此处所述的变化。此外，与上述报告不同，本研究中使用的近红外光治疗并未直接作用于感觉上皮或前庭传入神经元，因此也不太可能影响温度敏感性通道。例如， TRPV4）。最后，先前使用相同近红外设备在其他脑区的研究表明，观察到的差异并非由热效应引起。^7,9.

尽管这些结果表明，在基因水平上，细胞对与年龄相关的氧化应激反应出现了上调，但目前尚不清楚这些变化是否在蛋白质水平上进一步表达，更重要的是，是否反映在小鼠整体平衡功能的表现上。此外，所观察到的上调仅针对一种普遍存在的抗氧化剂。该处理方案很可能影响细胞代谢的多个标志物。此外，由于mRNA是从前庭器官中提取的 整体上 (即，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Quantum WARP 10	Quantum Devices	2070N030-A
带螺帽的微量离心管	Quality Scientific Plastics	520-GRD-Q
氯胺酮	Parnell, 澳大利亚亚历山德里亚
标准图案剪刀	FST	14001-12
碳素钢外科刀片 #22	Livingstone	SBLDCL 22
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	FST	16221-14
体视显微镜	Leica Microsystems	A60S
Dumont #5 SF 镊子	FST	11252-00
Isolate II RNA 微量提取试剂盒	Bioline	BIO-52075