本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。
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摘要
摘要
免疫组织化学是一种广泛使用的技术，用于原位检测抗原的存在、定位及其相对丰度。in situ。本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、设备及技术。具体而言，本文提供了一个逐步操作的实验流程，通过针对Iba1和Pan-neuronal的免疫组织化学方法，分别实现对小胶质细胞和神经元的荧光可视化。荧光双标技术特别适用于在同一组织样本中定位多种蛋白质，能够精确观察细胞类型之间、受体与配体之间、细胞与细胞外基质之间的相互关系，以及单个细胞内蛋白质的共定位情况。与其他可视化技术不同，若未采取适当预防措施，荧光免疫组织化学的染色强度可能在染色后的数周至数月内逐渐减弱。尽管存在这一局限性，在许多应用中，荧光双标仍优于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）或碱性磷酸酶（AP）等替代方法，因为荧光技术更节省时间，并能更精确地区分两种或多种标记物。本文还包含故障排除建议和提高实验成功率的实用指导。
引言
免疫组织化学是一种利用可特异性结合目标抗原（即蛋白质）的一抗来检测组织切片中抗原的技术。1934年，J.R. Marrack 确定抗体能够高度特异地定位抗原，由此开创了免疫组织化学技术1。自1942年起，一些首次采用荧光标记抗体进行免疫组织化学可视化的体外研究相继发表2,3，随后首个体内组织化学研究也得以发表4。20世纪60年代，在免疫组织化学方法诞生三十年后，酶标记抗体开始被用作二抗试剂。这些方法由法国和美国的研究者同时但独立地开发出来5,6。如今，种类繁多的抗体为免疫组织化学研究提供了无限可能7。
本文的总体目标是简要介绍免疫组织化学染色技术，而非对该技术进行全面详尽的综述。文中所述方法展示了针对两种抗原（小胶质细胞和神经元的标记物）的免疫组织化学染色技术，适用于经多聚甲醛灌注、蔗糖冷冻保护并进行冷冻切片的大鼠脑组织。免疫组织化学染色首先通过封闭非特异性抗原结合位点，以降低背景染色。随后，加入一抗孵育，使其与组织中的特定抗原结合。在一抗之后，再加入另一种称为二抗的抗体，以将一抗连接至偶联的可视化信号8。二抗靶向识别一抗宿主物种特异性的免疫球蛋白G（IgG）结构域。由于二抗的Fab区可结合于一抗IgG结构域上的多个位点，因此能够放大一抗的信号。酶类或荧光分子偶联在二抗的Fc区，从而实现信号的可视化。例如，兔源抗Iba1一抗是一种针对Iba1的兔IgG分子。当使用驴抗兔IgG作为二抗时，它将识别并结合兔抗Iba1 IgG的多个区域（见图1）。驴源抗体可通过多种方法进行可视化。本文重点介绍通过荧光显微镜观察与二抗偶联的荧光基团，以检测识别一抗的信号。在荧光免疫组织化学中，可使用Hoechst或DAPI等核染料对所有细胞核进行染色和观察。
图1：直接与间接抗体标记技术的示意图。 抗体可结合目标抗原，并可通过针对一抗来源物种的二抗进行信号放大。该技术可采用亲和素-生物素复合物（ABC）进行信号放大，并以DAB显色（A）；或使用直接偶联荧光染料的二抗进行检测（B）。此外，一抗也可直接偶联多种不同标签，包括生物素或荧光染料（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
一种用于免疫组织化学染色可视化的替代方法是使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB；参见图1和图2）。该方法与荧光检测不同，其采用生物素化或辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，通过酶促反应将DAB转化为在明场显微镜下可见的沉淀物。当仅需检测单一抗原或需要染色结果长期保存时，DAB染色可能比荧光染色更为合适。然而，DAB染色不适合用于多重标志物的区分，尤其是当两种抗原均位于细胞核内时。有关DAB试剂及实验方案修改的详细信息，请参阅表1。此外，也可使用硝基蓝四唑氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT/BCIP）来显色碱性磷酸酶（AP）标记的二抗。
图 2：镍增强DAB单标记大鼠脑组织切片的代表性图像。 使用镍增强DAB对Iba1（A）和全神经元标记物（B）进行标记的大鼠脑组织切片，可用于对小胶质细胞或神经元进行长期单独分析。比例尺为20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
必须考虑待分析组织中目标抗原的预计丰度。对于丰度较低的靶标，可采用间接法（如上所述）。当目标抗原丰度较高时，则可应用直接法。直接法使用直接偶联了显色信号的初级抗体，因此无需使用二抗。该方法简化了染色流程，但无法实现间接法所具有的信号放大效果。在进行双重标记时，使用直接偶联的初级抗体还可避免二抗之间的交叉反应。
本文详细介绍了使用 Iba1 和 Pan-neuronal 进行双重标记的实验方案（详见表1）。Iba1 可标记多种活化状态的小胶质细胞，包括分支状、过度分支状、活化态、阿米巴样和杆状。Pan-neuronal 可标记神经元的轴突、树突和胞体。由于 Iba1 能标记大多数小胶质细胞，而 Pan-neuronal 靶向神经元，因此该染色组合有助于广泛理解小胶质细胞与神经元之间的相互作用。
总之，免疫组织化学染色依赖于抗体的谨慎选择。随着研究问题变得更为具体，可能需要选用针对不同抗原的抗体。为了靶向特定的小胶质细胞活化状态，可选择使用 CD45 或 CD68 抗体，而非 Iba1。此外，在小鼠实验中，F4/80 可能提供所需的结果。类似地，神经元结构可通过针对细胞核、突触（突触前或突触后）、轴突以及生长锥的特异性抗体进行精确标记。此外，还有一些标记物可用于区分神经元的发育阶段（如 Double-cortin、NeuN）以及神经元再生（如 GAP-43）。
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方案
注意：所有操作均按照亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定执行。推荐使用的材料和设备列表见表1。
1. 组织制备
- 灌注
- 使用过量戊巴比妥钠（25 mg/kg，腹腔注射）处死啮齿类动物，随后以磷酸盐缓冲液（PBS）进行经心灌注，流速为 8 ml/min，持续 3–5 分钟，直至完全放血。有关详细的灌注操作说明，请参见 Gage 等人 20129。
- 在 PBS 冲洗完成后立即进行固定，以含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液以 8 ml/min 的流速灌注 15–20 分钟，以固定组织。
- 取出脑组织，置于 4% 多聚甲醛中固定 24 小时，随后依次浸入梯度蔗糖溶液（15%、30%、30%；以三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水配制）中，4 °C 下保存。只有当脑组织在某一浓度蔗糖溶液中完全沉底后，方可转移至下一级溶液。注意：通常在每种溶液中放置 5 天足以使组织沉底。
- 组织冷冻与冰冻切片
- 将脑组织置于包埋介质（如 O.C.T. 化合物）中，并浸入温度为 -35 °C 的异戊烷中。冷冻时间至少 10 分钟，随后于 -80 °C 保存。若未严格控制温度，可能出现问题；请参见讨论部分以获取故障排除信息。
- 以 20 µm 厚度和 -20 °C 温度连续切取冠状面切片，将组织收集至带正电荷的载玻片上。脑切片可置于锡箔包裹的载片盒中，再放入自封袋，长期保存于 -80 °C。此保存方法可形成双重屏障，防止组织接触空气和结霜。
2. 组织处理
注意：染色所需的示例设备和材料如图3所示。虽然存在其他替代选项，但这些图像将有助于初次进行免疫组织化学染色的人员在购买前直观了解合适的实验用品。
图3：免疫组织化学染色所需示例物品。 图（A）所示的黑色盒子是进行免疫荧光实验的理想湿盒，载玻片可免受光照，无需再用铝箔包裹盒子。切片完成后，载玻片可存放于如图（B）所示的黄色盒子中。将盒子紧密包裹铝箔，并在放入冷冻箱前置于自封袋中，有助于防止组织样本发生冻伤。图（C）展示了载玻片的示例，图（D）和（E）则显示了不同的染色皿。盖玻片的尺寸和厚度可能有所不同（F），但厚度为1.2的盖玻片在大多数直立式和共聚焦显微镜上均可获得良好的成像效果。如图（G）所示的铅笔可用于标记载玻片。应避免使用永久性记号笔，因其墨水可能晕染，影响染色结果以及样本的识别。如图（H）所示的微型疏水笔可在载玻片上绘制出疏水性边界。
- 载玻片制备
- 从冰箱中取出载玻片，在室温下解冻。
- 可选步骤：如果组织切片先前曾从载玻片上脱落，可将解冻后的载玻片置于60 °C烘箱中不超过4小时，以帮助防止组织切片脱落。
- 将载玻片放入载玻片架及其对应的染色缸中。
- 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟，每次更换溶液。从本步骤开始，避免组织切片长时间暴露于无液体环境中。注意：若切片干燥，背景染色会增强，无法可靠获得有意义的数据。
- 从冰箱中取出载玻片，在室温下解冻。
- 组织染色
- 在避光染色盒中，使用浸有去离子水的无绒纸巾创建“湿化室”。
- 用无绒纸巾擦干载玻片边缘，使用小型疏水笔在载玻片边缘（远离组织切片处）画出疏水边界。该边界应确保液体弯月面与组织边缘之间留有足够空间，以避免表面张力影响染色效果。
注意：若目标抗体无需微波抗原修复，则可在步骤2.1.3之前应用疏水笔绘制疏水边界。若在PBS洗涤前已使用疏水笔，则在此步骤需检查疏水边界的完整性。如有缺口，使用小型疏水笔补全。 - 将载玻片水平放置，加入含4% v/v血清的PBS（封闭液）以封闭非特异性抗原结合位点。每张载玻片加入300 µl封闭液，室温孵育1小时。确保封闭液延伸至载玻片边缘的疏水线，并完全覆盖组织，以避免因组织边缘表面张力导致染色不均。
- 使用与二抗来源相同的物种血清。注意：本实验中二抗来源于驴，因此使用驴血清。若使用两种或以上不同来源的二抗，则应包含相应物种的血清。
- 将一抗滴加至载玻片上。注意：本染色中Iba1和Pan-neuronal抗体的最佳浓度分别为1:5,000和1:500。这些浓度可在无背景染色的情况下实现有意义的特异性染色。
- 将封闭液稀释为含1%血清的PBS，并加入一抗。每张载玻片加入300 µl含1%血清的一抗溶液。再次确保液体到达疏水线边缘。4 °C过夜孵育。
- 设置三张对照载玻片：一张不加Iba1和Pan-neuronal抗体，一张仅加Iba1抗体（不加Pan-neuronal抗体），一张仅加Pan-neuronal抗体（不加Iba1抗体）。这些对照载玻片应与实验组使用相同的试剂同时进行染色，但省略一抗，以检测二抗的非特异性结合。
- 次日早晨，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟，每次更换溶液。
- 荧光抗体对光敏感，因此从本步骤开始，应尽量减少光照，确保洗涤容器用铝箔包裹，杂交盒为黑色或置于暗处。将适当浓度为1:250的二抗（溶于封闭液，见步骤2.2.3）滴加至所有载玻片，在避光“湿化室”（见步骤2.2.1）中室温孵育60分钟。
- 使用不同激发波长的二抗。此处，针对兔源一抗anti-Iba1，使用驴抗兔594作为相应的二抗；针对鼠源一抗anti-Pan-neuronal，使用驴抗鼠488作为相应的二抗。也可选择抗兔488和抗鼠594。
- 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
- 可选步骤：进行细胞核染色。
- 将载玻片置于双蒸H2O中含0.03 µg/ml Hoechst（或其他核染料）的溶液中，精确染色60秒。
- 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
- 用ddH20洗涤。
- 封片
- 使用水溶性封片剂（如Fluoromount-G或ProlongGold）进行封片。使用棉签小心去除所有气泡。
注意：也可使用其他封片剂，但有报道称在封片后数天内可能出现染料间显著串色现象。 - 用透明指甲油密封盖玻片边缘，防止因蒸发导致切片干燥。将载玻片平放于避光容器中，待指甲油干燥后，再将其存放在用铝箔包裹的避光容器中，4 °C保存。
- 使用水溶性封片剂（如Fluoromount-G或ProlongGold）进行封片。使用棉签小心去除所有气泡。
3. 成像染色组织
- 显微镜观察
- 在开始显微镜观察前，让指甲油至少干燥一小时，显微镜操作应在暗室中进行。
- 使用配备荧光光源和数字相机附件的共聚焦显微镜或研究级显微镜拍摄显微照片。通过配套软件，分别设置每个波长（405、488 和 594）的曝光参数。注意：详细的成像操作说明可从显微镜制造商的官方网站获取。
- 在不移动切片或调整焦距的情况下，分别在每个通道中获取显微图像。图像可直接以彩色模式拍摄，或以灰度模式拍摄后转换为彩色。
注意：各通道的彩色或灰度图像可在后期处理中合并。 - 确保组织切片不长时间暴露于环境光或显微镜光源下，以免发生光漂白现象。为避免此问题，应通过延长曝光时间而非提高光源/激光强度来优化成像。
- 荧光光源开启后30分钟内不得关闭。
注意：短时间内频繁开关光源可能会缩短荧光灯泡的使用寿命。
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结果
该染色方案可使大鼠脑组织切片中的小胶质细胞在594通道（红色）呈现荧光标记，神经元在488通道（绿色）被标记（见图4）。如果进行了细胞核染色，则会在405通道（蓝色）中显示。可在不同通道中分别采集图像，并进行叠加，以直接比较三个通道之间或任意两个通道之间的信号。许多数字图像采集软件套件均具备此功能。本实验中使用Iba1与泛神经元标记物进行双标，结果显示小胶质细胞主要呈分支状，且在皮质各层中可见细长的神经元突起。
图 4：Iba-1/泛神经元双标共聚焦荧光图像的代表性结果。 第一列显示用 Iba1 标记的微胶质细胞（红色）。第二列为绿色显示的神经元，第...
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讨论
本文的总体目标是向读者介绍免疫组织化学实验方法。为此，以使用Iba1和泛神经元抗原进行双重标记为例，观察经多聚甲醛灌注、蔗糖冷冻保护并进行冷冻切片的大鼠脑组织中的小胶质细胞和神经元。
该技术可经调整后用于多种用途。通过对接实验方案进行微调，可对多种组织类型（如脑、肺、肝、肾和肠道等，但不限于这些组织）中的不同抗原进行免疫组织化学检测。免疫组织化学技术允许对多个标记物进行直接比较，并可在单个样本中同时检测多达四种不同的抗体。由于荧光波长的重叠（即串色效应），单一样本中可使用的抗体数量受到限制。荧光光谱范围有限，因此也限制了单个样本中的染色组合（见图6）。
...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Ryan Hart 先生和 Arriz Lucas 先生对本文提出的宝贵意见。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所 R01 NS065052 项目和凤凰城儿童医院任务支持基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fisherbrand Superfrost Plus 玻片 | Fisher Scientific | 22-034-979 | 用于组织贴附（1.2.2） |
| 烘箱 | Thermo Scientific | 51028112 | 用于组织干燥（2.1.1） |
| 迷你 Pap 笔 | Life Technologies | 00-8877 | 用于步骤 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek 染色盒 | Fisher Scientific | 22-149-429 | 用于染色过程中的所有洗涤步骤（2.2），以及 Hoechst 步骤（2.2.8） |
| Kimwipes 擦镜纸 | Fisher Scientific | 06-666-A | 用于玻片干燥（2.2） |
| 黑色染色盒 | Ted Pella | 21050 | 用于封闭和染色步骤（2.2） |
| 正常驴血清 | Fisher Scientific | 50-413-253 | 用于封闭和抗体孵育（2.2） |
| 小鼠 α-泛神经元抗体 | Millipore | MAB2300 | 用作一抗（2.2.4） |
| 兔 α-Iba1 抗体 | Wako Chemical | 019-19741 | 用作一抗（2.2.4） |
| 驴 α-兔 594 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 用作二抗（2.2.6） |
| 驴 α-鼠 488 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | 用作二抗（2.2.6） |
| 烘焙用铝箔 | 任意品牌 | N/A | 用于步骤 1.2.2 和 2.3.2 |
| Fluoromount-G 封片剂 | Southern Biotech | 0100-01 | 用于盖片（2.2.8） |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12544E | 用于盖片（2.2.8） |
| 透明指甲油 | 任意品牌 | N/A | 用于盖片（2.2.8） |
| Axio Observer.Z1 与 LSM 710（激光扫描共聚焦显微镜） | Carl Zeiss | N/A | 用于成像（3） |
| Axioskop A2 显微镜 | Carl Zeiss | N/A | 用于成像（3） |
| CitriSolv 去蜡剂 | FisherScientific | 用于 DAB 染色流程 | |
| ABC 试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | 用于 DAB 染色流程 |
| DAB 过氧化物酶试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | 用于 DAB 染色流程 |
| 生物素化马 α-兔 IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | 用于 DAB 染色流程 |
| 生物素化马 α-鼠 IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | 用于 DAB 染色流程 |
| 30% 过氧化氢 | FisherScientific | H325-500 | 用于 DAB 染色流程 |
| Wheaton 染色架和染色盒 | TedPella | 21043 | 用于 DAB 染色流程 |
| Masterflex 灌注泵及管路 | Cole-Parmer | 用于灌注（1.1.1 和 1.1.2） | |
| Andwin Scientific Tissue-tek CRYO-OCT 包埋剂（12 支装） | Fisher Scientific | 14-373-65 | 用于组织冷冻（1.2.1） |
| 温度计（-50 至 50 °C） | Fisher Scientific | 15-059-228 | 用于组织冷冻（1.2.1） |
| 冷冻切片机 | Leica | CM3500S | 用于组织切片（1.2.2） |
| 带两个盖子的塑料染色盒 | Grale Scientific | 353 | 用于抗原修复 |
| 20 片位水平染色架 | Grale Scientific | 354 | 用于抗原修复 |
| 微波炉 | 任意品牌 | N/A | 用于抗原修复 |
参考文献
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
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- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
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- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
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