冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

摘要

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。

摘要

免疫组织化学是一种广泛使用的技术，用于原位检测抗原的存在、定位及其相对丰度。in situ。本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、设备及技术。具体而言，本文提供了一个逐步操作的实验流程，通过针对Iba1和Pan-neuronal的免疫组织化学方法，分别实现对小胶质细胞和神经元的荧光可视化。荧光双标技术特别适用于在同一组织样本中定位多种蛋白质，能够精确观察细胞类型之间、受体与配体之间、细胞与细胞外基质之间的相互关系，以及单个细胞内蛋白质的共定位情况。与其他可视化技术不同，若未采取适当预防措施，荧光免疫组织化学的染色强度可能在染色后的数周至数月内逐渐减弱。尽管存在这一局限性，在许多应用中，荧光双标仍优于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）或碱性磷酸酶（AP）等替代方法，因为荧光技术更节省时间，并能更精确地区分两种或多种标记物。本文还包含故障排除建议和提高实验成功率的实用指导。

引言

免疫组织化学是一种利用可特异性结合目标抗原（即蛋白质）的一抗来检测组织切片中抗原的技术。1934年，J.R. Marrack 确定抗体能够高度特异地定位抗原，由此开创了免疫组织化学技术¹。自1942年起，一些首次采用荧光标记抗体进行免疫组织化学可视化的体外研究相继发表^2,3，随后首个体内组织化学研究也得以发表⁴。20世纪60年代，在免疫组织化学方法诞生三十年后，酶标记抗体开始被用作二抗试剂。这些方法由法国和美国的研究者同时但独立地开发出来^5,6。如今，种类繁多的抗体为免疫组织化学研究提供了无限可能⁷。

本文的总体目标是简要介绍免疫组织化学染色技术，而非对该技术进行全面详尽的综述。文中所述方法展示了针对两种抗原（小胶质细胞和神经元的标记物）的免疫组织化学染色技术，适用于经多聚甲醛灌注、蔗糖冷冻保护并进行冷冻切片的大鼠脑组织。免疫组织化学染色首先通过封闭非特异性抗原结合位点，以降低背景染色。随后，加入一抗孵育，使其与组织中的特定抗原结合。在一抗之后，再加入另一种称为二抗的抗体，以将一抗连接至偶联的可视化信号⁸。二抗靶向识别一抗宿主物种特异性的免疫球蛋白G（IgG）结构域。由于二抗的Fab区可结合于一抗IgG结构域上的多个位点，因此能够放大一抗的信号。酶类或荧光分子偶联在二抗的F_c

方案

注意：所有操作均按照亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定执行。推荐使用的材料和设备列表见表1。

1. 组织制备

1. 灌注
   1. 使用过量戊巴比妥钠（25 mg/kg，腹腔注射）处死啮齿类动物，随后以磷酸盐缓冲液（PBS）进行经心灌注，流速为 8 ml/min，持续 3–5 分钟，直至完全放血。有关详细的灌注操作说明，请参见 Gage 等人 2012⁹。
   2. 在 PBS 冲洗完成后立即进行固定，以含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液以 8 ml/min 的流速灌注 15–20 分钟，以固定组织。
   3. 取出脑组织，置于 4% 多聚甲醛中固定 24 小时，随后依次浸入梯度蔗糖溶液（15%、30%、30%；以三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水配制）中，4 °C 下保存。只有当脑组织在某一浓度蔗糖溶液中完全沉底后，方可转移至下一级溶液。注意：通常在每种溶液中放置 5 天足以使组织沉底。
2. 组织冷冻与冰冻切片
   1. 将脑组织置于包埋介质（如 O.C.T. 化合物）中，并浸入温度为 -35 °C 的异戊烷中。冷冻时间至少 10 分钟，随后于 -80 °C 保存。若未严格控制温度，可能出现问题；请参见讨论部分以获取故障排除信息。
   2. 以 20 µm 厚度和 -20 °C 温度....

结果

该染色方案可使大鼠脑组织切片中的小胶质细胞在594通道（红色）呈现荧光标记，神经元在488通道（绿色）被标记（见图4）。如果进行了细胞核染色，则会在405通道（蓝色）中显示。可在不同通道中分别采集图像，并进行叠加，以直接比较三个通道之间或任意两个通道之间的信号。许多数字图像采集软件套件均具备此功能。本实验中使用Iba1与泛神经元标记物进行双标，结果显示小胶质细胞主要呈分支状，且在皮质各层中可见细长的神经元突起。

图 4：Iba-1/泛神经元双标共聚焦荧光图像的代表性结果。 第一列显示用 Iba1 标记的微胶质细胞（红色）。第二列为绿色显示的神经元，第.......

讨论

本文的总体目标是向读者介绍免疫组织化学实验方法。为此，以使用Iba1和泛神经元抗原进行双重标记为例，观察经多聚甲醛灌注、蔗糖冷冻保护并进行冷冻切片的大鼠脑组织中的小胶质细胞和神经元。

该技术可经调整后用于多种用途。通过对接实验方案进行微调，可对多种组织类型（如脑、肺、肝、肾和肠道等，但不限于这些组织）中的不同抗原进行免疫组织化学检测。免疫组织化学技术允许对多个标记物进行直接比较，并可在单个样本中同时检测多达四种不同的抗体。由于荧光波长的重叠（即串色效应），单一样本中可使用的抗体数量受到限制。荧光光谱范围有限，因此也限制了单个样本中的染色组合（见图6）。

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fisherbrand Superfrost Plus 玻片	Fisher Scientific	22-034-979	用于组织贴附（1.2.2）
烘箱	Thermo Scientific	51028112	用于组织干燥（2.1.1）
迷你 Pap 笔	Life Technologies	00-8877	用于步骤 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek 染色盒	Fisher Scientific	22-149-429	用于染色过程中的所有洗涤步骤（2.2），以及 Hoechst 步骤（2.2.8）
Kimwipes 擦镜纸	Fisher Scientific	06-666-A	用于玻片干燥（2.2）
黑色染色盒	Ted Pella	21050	用于封闭和染色步骤（2.2）
正常驴血清	Fisher Scientific	50-413-253	用于封闭和抗体孵育（2.2）
小鼠 α-泛神经元抗体	Millipore	MAB2300	用作一抗（2.2.4）
兔 α-Iba1 抗体	Wako Chemical	019-19741	用作一抗（2.2.4）
驴 α-兔 594 抗体	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	用作二抗（2.2.6）
驴 α-鼠 488 抗体	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	用作二抗（2.2.6）
烘焙用铝箔	任意品牌	N/A	用于步骤 1.2.2 和 2.3.2
Fluoromount-G 封片剂	Southern Biotech	0100-01	用于盖片（2.2.8）
盖玻片	Fisher Scientific	12544E	用于盖片（2.2.8）
透明指甲油	任意品牌	N/A	用于盖片（2.2.8）
Axio Observer.Z1 与 LSM 710（激光扫描共聚焦显微镜）	Carl Zeiss	N/A	用于成像（3）
Axioskop A2 显微镜	Carl Zeiss	N/A	用于成像（3）
CitriSolv 去蜡剂	FisherScientific		用于 DAB 染色流程
ABC 试剂盒	Vector Laboratories	PK-6100	用于 DAB 染色流程
DAB 过氧化物酶试剂盒	Vector Laboratories	SK-4100	用于 DAB 染色流程
生物素化马 α-兔 IgG	Vector Laboratories	BA-1100	用于 DAB 染色流程
生物素化马 α-鼠 IgG	Vector Laboratories	BA-2001	用于 DAB 染色流程
30% 过氧化氢	FisherScientific	H325-500	用于 DAB 染色流程
Wheaton 染色架和染色盒	TedPella	21043	用于 DAB 染色流程
Masterflex 灌注泵及管路	Cole-Parmer		用于灌注（1.1.1 和 1.1.2）
Andwin Scientific Tissue-tek CRYO-OCT 包埋剂（12 支装）	Fisher Scientific	14-373-65	用于组织冷冻（1.2.1）
温度计（-50 至 50 °C）	Fisher Scientific	15-059-228	用于组织冷冻（1.2.1）
冷冻切片机	Leica	CM3500S	用于组织切片（1.2.2）
带两个盖子的塑料染色盒	Grale Scientific	353	用于抗原修复
20 片位水平染色架	Grale Scientific	354	用于抗原修复
微波炉	任意品牌	N/A	用于抗原修复