采用电穿孔法将纯化的细菌毒力效应蛋白直接导入活的真核细胞中。通过共聚焦免疫荧光显微镜监测蛋白的定位。该方法可利用有活性的外源蛋白研究蛋白的转运、功能及蛋白-蛋白相互作用，避免了在真核细胞中进行异源表达的需要。
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摘要
摘要
在活细胞环境中研究蛋白质相互作用，可获得关于蛋白质定位、动态变化及相互作用伙伴的关键信息。此类信息在宿主-病原体相互作用研究中尤为重要。许多病原体蛋白在宿主细胞内以多种方式发挥作用，例如帮助病原体逃逸宿主免疫系统，或在细胞内环境中实现存活。为研究这些病原体蛋白与宿主细胞之间的相互作用，通常采用以下几种方法： 体内 感染表达标签蛋白或突变蛋白的菌株，或引入病原体基因 通过 转染或转导。这些方法各有优缺点。我们旨在探索一种将外源蛋白直接导入细胞的技术。电穿孔通常用于将核酸导入细胞，尽管其生物物理基础完全相同，但该技术较少应用于蛋白质的递送。本研究采用标准电穿孔仪将带有亲和标签的细菌效应蛋白导入哺乳动物细胞。人上皮细胞和小鼠巨噬细胞通过传统方法培养，经消化脱离后，与感兴趣的外源性细菌病原体蛋白一同加入含有0.4 cm间隙的电穿孔杯中例如 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌GtgE）。电穿孔（0.3 kV）后经过短暂（4小时）恢复期，通过亲和标签对蛋白进行荧光标记，并利用共聚焦显微镜观察其在细胞内的空间与时间分布，从而验证胞内蛋白的存在。电穿孔导入的蛋白在细胞内具有功能活性，能够正确进行亚细胞定位并参与蛋白-蛋白相互作用。尽管外源蛋白倾向于在细胞表面聚集，但与单纯孵育相比，电穿孔样本的胞内效应分子浓度显著升高。该方案操作简便、快速，可平行进行，适用于在宿主细胞中高通量地表征病原体蛋白，包括毒力蛋白的亚细胞靶向性及其功能研究。
引言
许多革兰氏阴性菌利用特化的分泌系统将与毒力相关的蛋白质（称为效应蛋白）直接注入宿主细胞中1-5。这些效应蛋白具有多种生物学功能，包括：抑制宿主免疫、细胞骨架改变、调控细胞内运输和信号转导、转录水平的变化以及宿主蛋白酶体的修饰6-9。部分效应蛋白的功能已被阐明，但许多其他效应蛋白的宿主靶标及其生化作用机制仍有待确定。尽管通过比较野生型和重组细菌感染是研究细胞内效应蛋白毒力机制的有效方法，但将单个效应蛋白直接导入宿主细胞往往更具优势。因此，开发简单有效的方法以在宿主细胞环境中引入并表征细菌效应蛋白具有重要意义。
使用单一效应分子简化实验分析至关重要，因为其他效应分子可能具有拮抗或冗余的功能。为实现这种简化，研究人员此前已通过多种方法将大分子导入细胞，包括病毒转导 10，显微注射 11，刮取上样 12,13，化学诱导显微注射的细胞融合 14，专有的蛋白质“转染”试剂 15，磷酸钙沉淀 16，以及电穿孔 17-20引入的分子包括核酸，如DNA、RNA， & RNAi 物种到蛋白质、细胞不可渗透性染料以及细胞内靶点抗体的递送 21,22某些方法存在局限性，包括可导入的大分子类型，以及由于细胞毒性高、作用机制具有损伤性、效率低或导入效率不佳，可能导致某些下游分析受限。转染是一种常用于在哺乳动物细胞中表达细菌基因的方法，但也存在局限，即某些相关宿主细胞类型（如巨噬细胞和原代细胞）对转染特别具有抗性。此外，在导入外源DNA后，难以控制细菌蛋白的表达水平。
大量研究已将核酸电穿孔技术确立为向细菌和哺乳动物细胞中导入核酸的常用实验方法；然而，如何在生理条件下将蛋白质高效递送至细胞内的最佳方法仍是当前研究的热点。已有文献报道了蛋白质转染技术，虽具潜力，但需要昂贵的试剂并进行条件优化。为了以最低成本将可能具有毒性的细菌效应蛋白导入多种不同的细胞靶标中，我们考虑采用电穿孔法作为在活体（in vivo）条件下研究这些蛋白质的手段。
蛋白质电穿孔23-25是一种通过电穿孔将蛋白质导入活细胞的方法，也称为电转染或电注射26。该技术利用高强度电脉冲在细胞膜上形成孔道。这些可逆的孔道允许通常无法进入细胞内空间的大分子进入细胞。当外部电场撤除后，细胞膜可重新闭合，从而使细胞保留通过孔道进入的分子27,28。
本研究使用标准电穿孔仪，将细菌效应蛋白稳定地导入小鼠类巨噬细胞和人上皮细胞中。该方法快速、高效且成本低廉，细胞活力未见明显下降。导入的蛋白质可通过免疫荧光显微镜观察，或用于功能分析。此方法已通过绿色荧光蛋白（GFP）作为无毒性的标准对照，以及两种 沙门氏菌 效应蛋白 SspH1 和 GtgE。我们建议将蛋白质电穿孔作为一种新工具，纳入研究细菌毒力蛋白及其在真核宿主细胞中功能的方法体系。
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方案
1. 提前准备
- 将无菌磷酸盐缓冲液（PBS）预热至 37 °C。
- 将添加了 10% 胎牛血清（FBS）、100 I.U./ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）和最低必需培养基（MEM）预热至 37 °C。注意：这分别代表 RAW 细胞和 HeLa 细胞的正常生长培养基（NGM）。
2. 细胞的制备
- 在 NGM 培养基中培养 RAW 264.7 细胞至 70–90% 汇合度。
- 将细胞置于 37 °C、湿度为 95% 空气/5% CO2 的培养环境中维持培养。
- 在 NGM 培养基中培养 HeLa 细胞至 70–90% 汇合度。
- 将细胞置于 37 °C、湿度为 95% 空气/5% CO2 的培养环境中维持培养。
- 收集前，用无菌 PBS 洗涤细胞单层一次。
- 将未完全汇合的细胞收集至无菌锥形管中。
- 用 PBS 中的橡胶刮棒轻轻刮取 RAW 细胞，并反复吹打以分散细胞聚集体。
- 使用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化 HeLa 细胞，直至显微镜下观察显示细胞从培养表面脱离。例如，T-75 培养瓶使用 2 至 3 ml，根据培养面积调整体积，确保胰蛋白酶溶液完全覆盖生长表面。
- 加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 NGM 培养基以终止消化反应。
- 加入的 NGM 体积至少为胰蛋白酶体积的两倍，并通过反复吹打分散细胞聚集体。
- 以 900 × g 离心 4 分钟，轻微沉淀细胞。
- 用无菌 PBS 重悬细胞，体积与胰蛋白酶/终止液总体积相同。
- 使用血细胞计数板或颗粒计数器对细胞进行计数。
- 以 900 × g 离心 4 分钟，轻微沉淀细胞。
- 用适量 PBS 重悬细胞，使细胞浓度为 5.5 × 106 至 6.0 × 106 个/ml。注意：例如，一个 T-75 培养瓶通常可收获约 7.5 × 106 个细胞29。
- 将细胞悬液置于冰上，直至进行电穿孔操作。
3. 电穿孔前的准备
- 将电穿孔杯（0.4 cm 间隙）预先在冰上冷却。
- 打开电穿孔仪，并将电压设置为 0.3 kV。
注意：电穿孔仪的电容和电阻不可调节（由制造商设定为 10 μF 和 600 Ω）。 - 在恢复平板中加入 NGM 培养基，并在 37°C、加湿的 95% 空气/5% CO2 气氛中平衡。
4. 电穿孔
- 将400 µl细胞悬液加入预冷的电转杯中，并向电转杯中加入20 µg选定的蛋白质（终浓度为50 µg/ml）。
- 轻轻弹动电转杯约10次以混匀，避免损伤细胞。注意：也可将电转杯反复倒置数次以充分混匀，但切勿使用移液器反复吹打或涡旋震荡，以免损伤细胞。
- 用纸巾或其他擦拭材料将电转杯外壁擦干，以防止电穿孔仪中发生电弧放电。
- 在0.3 kV条件下对样品进行电穿孔，持续时间为1.5–1.7 msec。注意：本研究中通常采用此参数。
- 电穿孔后立即轻轻弹动电转杯约10次，以充分混匀。
5. 细胞接种
- 将电穿孔后的细胞与比色皿一起置于冰上保存，直至准备转移至恢复培养板。
- 对于大多数后续分析，用预热的NGM洗涤细胞1次，以去除多余的效应蛋白。
- 移除用于分析的细胞，并重悬于3-5 ml NGM中。
- 离心收集细胞，900 × g 离心 4 分钟。
- 用适量的NGM重悬，以适应所需平板大小（例如 2 ml（用于35 mm培养皿）。
- 移取适量细胞用于后续分析。
- 示例1：将样品接种至玻璃底培养皿中，用于显微镜分析。
- 示例2：将细胞接种至细胞培养用塑料器皿中，用于蛋白质分析，例如亲和纯化。
- 让细胞在加湿的95%空气/5% CO₂环境中平衡的培养板中恢复2 37°C 气氛中孵育至少 4 小时。
6. 显微镜分析
6.1）固定/免疫荧光染色
- 4小时后用无菌PBS洗涤细胞1次 恢复期
- 用100%甲醇在室温下固定细胞2分钟。使用足量甲醇以完全覆盖细胞（例如 2 ml（用于35 mm培养皿）。
- 用无菌 PBS 洗涤 3 次。
- 用含 0.4% Triton X-100 的 PBS 处理细胞，透化 15 分钟。例如，35 mm 直径培养皿使用 1 ml。
- 根据目标蛋白的表位和定位调整透化时间和Triton X-100的浓度。注意：每种目标蛋白的最佳条件需通过实验确定，但上述条件适用于大多数胞质蛋白。
- 用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭1小时 在室温下进行。例如，35 mm 直径的培养皿使用 1 ml。
- 用 PBS 洗涤 3 次。
- 在抗体结合溶液（PBS 中含 0.1% Triton X-100 和 1% BSA）中 4℃ 过夜孵育一抗 °C 下轻柔摇动孵育。例如，35 mm 直径的培养皿使用 0.5 ml。
- 遵循抗体稀释的生产商推荐说明。注意：例如，链霉亲和素结合肽标签（SBP-tag）抗体按1:1,000稀释使用，而PKN1抗体则按1:200稀释使用。
- 用 PBS 洗涤 4 次。
- 在抗体结合溶液中加入合适的荧光标记二抗，孵育1小时 室温避光保存。
- 例如，使用 Alexa 488 或 Alexa 647 孵育 1 小时 在室温下
- 遵循制造商关于抗体稀释的建议。例如 约1:1,000（本研究中）。
- 根据制造商建议，如有需要可添加其他染料，例如 5 μM 与 Alexa 647 偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）或 DAPI，孵育 1 小时 在室温下。
- 例如，使用 Alexa 488 或 Alexa 647 孵育 1 小时 在室温下
- 用 PBS 洗涤 5 次，置于 4 °C 避光保存，直至准备成像。
6.2）共聚焦显微镜与图像分析
- 使用63倍油镜在倒置共聚焦显微镜上对样品进行成像。
- 使用氩离子激光器的488 nm谱线对绿色通道进行成像，发射波长范围为492–542 nm。
- 使用633 nm半导体激光器对红色通道进行成像，发射波长范围为640–718 nm。
- 使用405 nm半导体激光器对蓝色通道进行成像，发射波长范围为407–453 nm。
- 确保多通道z轴扫描覆盖整个细胞体积。
- 使用适当的图像处理软件对图像进行处理。
7. 亲和纯化
- 电穿孔4小时后，用4 °C的PBS洗涤细胞两次 恢复期
- 在冰上用约1.0 ml裂解缓冲液（含1% Triton X-100、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂的PBS溶液）进行裂解。抑制剂的使用请参照生产商说明书。注意：例如，本研究中使用的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均为100倍浓缩液，但其他配方同样适用。
- 立即用细胞刮刀刮取细胞，并收集到锥形管中。
- 通过剧烈涡旋和超声处理进行裂解。注意：其他裂解方法可能同样有效，但其效率需根据实验要求通过实验经验确定。
- 超声处理3次，每次30秒，期间间歇性涡旋振荡。
- 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，收集细胞碎片和不溶性聚集体；保留上清液。
- 将等体积（约1.0 ml）的电穿孔细胞裂解液与50 µl链霉亲和素琼脂糖树脂悬液在4 °C下颠倒旋转孵育过夜。注意：该树脂通过链霉亲和素结合肽亲和标签捕获电穿孔的蛋白质（及其相关复合物）。
- 在 2,500 × g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。
- 用40个柱床体积（约1 ml）的PBS洗涤两次。
- 加入 30 µl 4x LDS 上样缓冲液（141 mM Tris 碱，2% LDS，10% 甘油，0.51 mM EDTA，0.22 mM SERVA Blue G，0.175 mM 酚红，pH 8.5），20 µl 二水2O，以及1 µl 0.5 M 三(2-羧乙基)膦（TCEP），留出部分体积在珠子中。
- 95 °C 加热 10 分钟，然后冰上冷却。
- 旋转 >4 °C，5 分钟，10,000 × g 离心。
- 收集上清液。
- 使用适当的抗体进行蛋白质印迹实验。注意：此处使用抗PKN1一抗。
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结果
作为初步的概念验证实验，通过电穿孔成功将纯化的绿色荧光蛋白导入哺乳动物细胞。绿色荧光蛋白（GFP）是一种分子量约为27 kD的蛋白质，通常作为分子生物学工具被导入哺乳动物细胞（通常由质粒DNA表达），且无明显细胞毒性。HeLa细胞经与25 µg/ml GFP共孵育（图1A）或电穿孔处理（图1B）后，采用免疫荧光共聚焦显微镜检测荧光GFP信号。为证实GFP位于细胞胞质内，同时使用麦胚凝集素（WGA）对细胞进行染色以标记胞质边界（红色），并使用核酸染料DAPI（蓝色）标记细胞核。结果显示，仅在电穿孔处理的细胞中观察到胞内GFP信号，而在与GFP共孵育的细胞中未检测到胞内蛋白。在RAW264.7小鼠巨噬细胞样细胞中也观察到类似结果（图1C和图1D）。需要注意的是，WGA是一种凝集素，可优先结合细胞质膜上的残基，因此其染色模式可能因孵育时间长短而呈现点状分布。比较图1A与图2A，其中图2A的孵育时间长于
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讨论
致病菌分泌的效应蛋白已进化出在宿主细胞环境中发挥功能的能力，因此在宿主细胞内原位研究这些蛋白具有重要意义。in situ 向宿主细胞导入特定效应蛋白，可使相关病原体-宿主相互作用在不受其他细菌蛋白干扰的情况下被独立研究。本研究旨在探索利用电穿孔技术将细菌效应蛋白导入真核宿主细胞，从而避免转染或转导过程中存在的一些挑战。实验中以绿色荧光蛋白作为对照，并测试了Salmonella的效应蛋白。由于研究关注靶向宿主上皮细胞及免疫细胞的细菌病原体，因此采用了人源类上皮细胞系（HeLa）和小鼠类巨噬细胞（RAW 264.7）。电穿孔可将外源蛋白高效递送至宿主细胞，且细胞活力未出现明显下降，导入的蛋白在细胞内可检测长达四天。
为了分离电穿孔蛋白的作用，需要使用纯化的蛋白。在本研究中，蛋白在 E. coli BL21菌株表达带有N端多聚组氨酸和链霉亲和素结合肽标签的蛋白质。蛋白质经Ni-NTA树脂纯化，测定浓度（通常为5–25 mg/ml）和纯度后，于-80 °C保存，直至用于电穿孔。 commercially produced protein...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助（项目编号 GM094623）。本研究的大量工作在美国能源部生物与环境研究办公室（DOE/BER）下属的国家科学用户设施——环境分子科学实验室（EMSL）完成，该实验室位于太平洋西北国家实验室（PNNL）。PNNL 由巴特尔纪念研究所根据合同号 DE-AC05-76RLO1830 为美国能源部运营。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm 间隙一次性电穿孔比色皿 | 伯乐（Bio-Rad） | 165-2088 | |
| 100% 甲醇 | 任何 | N/A | 易燃，有毒 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| 细胞计数装置——血细胞计数板或库尔特计数器 | 贝克曼库尔特 | Model Z1 | |
| 细胞培养箱 | 任何 | N/A | 湿润的95%空气/5% CO₂2 37℃大气环境 °C |
| 细胞培养塑料器皿 | 任何 | N/A | 细胞培养瓶/板、移液管、试管、橡胶刮刀 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基’s 培养基（DMEM） | Cellgro | 10-013 | 37℃预热 °C |
| 电穿孔仪 | 伯乐（Bio-Rad） | 大肠杆菌电穿孔仪 | |
| 胎牛血清（FBS） | Cellgro | 35-016-CV | |
| 荧光共聚焦显微镜 | 齐斯 | 模型 LSM 710 | |
| 用于显微镜观察的玻璃底培养皿 | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT蛋白酶抑制剂混合物 | 皮尔斯 | 78430 | 腐蚀性，有毒 |
| HeLa细胞系 | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X 上样缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | |
| 最低必需培养基（MEM） | Cellgro | 10-010 | 37℃预热 °C |
| 其他荧光染料（WGA、DAPI）联合抗荧光淬灭剂 | 任何 | N/A | |
| 青霉素/链霉素 | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 细胞系 | ATCC | TIB-71 | |
| 针对目标蛋白的一抗 | 任何 | N/A | |
| 与荧光染料偶联的二抗 | 任何 | N/A | |
| 磷酸盐缓冲液 | 任何 | N/A | 冷却至 4 °C |
| 无菌磷酸盐缓冲液 | 任何 | N/A | 37℃预热 °C |
| [页眉] | |||
| 链霉亲和素琼脂糖树脂悬液 | 皮尔斯 | 20353 | |
| 可容纳锥形管的台式离心机（建议使用摆桶式） | 任何 | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | 腐蚀性，有毒 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | 刺激性，有毒 |
参考文献
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