本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。
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摘要
摘要
患者特异性细胞系的建立是诊断或转化医学研究中极为宝贵的工具，这些细胞可从患者诊断过程中获取的皮肤或肌肉活检组织中分离获得。本方案中，我们描述了一种从小量肌肉或皮肤组织中分离活细胞用于原代培养的技术。此外，我们还提供了一种将原代细胞来源的成肌细胞系和成纤维细胞系永生化的方法。一旦细胞系实现永生化，即可实现患者来源细胞的大规模扩增。永生化细胞适用于多种下游应用，包括药物筛选和 体外 纠正基因突变。总体而言，这些方案为生成和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。
引言
分子诊断在过去20年中取得了显著进展。如今，基因组DNA已可常规地从痰液或口腔拭子中分离获得，而过去则需要通过抽血获取。得益于当前快速的检测周期和便捷的基因测序技术，许多致病突变已能被常规识别，无需额外检测。在肌肉疾病诊断领域，过去十年中已发现数十个与肌营养不良或肌病相关的新基因，这极大地改变了这些疾病的诊断方式1,2。目前，已有数十个基因被确认为导致肌营养不良和先天性肌病的原因，尽管其中许多基因致病的具体机制仍不明确。特别是罕见病由于患者人群规模小，诊断和研究面临较大挑战。因此，无论是罕见病还是更常见的疾病，建立稳定的工具以促进发病机制研究和治疗药物筛选都具有重要意义。
尽管DNA诊断技术已取得显著进展，但对于许多疑似患有原发性代谢或肌肉疾病的患者，仍需进行肌肉活检以确立初步诊断。当必须进行肌肉活检时，可在对患者额外风险极小的情况下，同时获取更多用于诊断和研究的组织样本。由于每份组织标本均有多种用途，因此建立一种简单、高效且仅需少量组织即可开展原代细胞培养的技术显得尤为重要。为最大限度地从组织中分离原代细胞并实现活体材料的长期保存，必须对肌肉或皮肤活检样本进行合理的分流处理。此外，干细胞研究和药物筛选在利用基于细胞的检测方法开发多种疾病疗法方面具有广阔前景3,4。
本文介绍了从人体肌肉或皮肤活检样本中分离原代细胞的方法。此外，还包括一种成肌细胞永生化方案，该方法有助于从个体样本中获得大量细胞。这些细胞可用于后续应用，例如定制药物筛选，而此类应用通常难以通过原代组织获得的有限数量细胞来实现。
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方案
注意：人类组织采集方案必须经过机构伦理审查委员会（IRB）的审查和批准。波士顿儿童医院和布莱根妇女医院IRB委员会已批准对废弃的、去标识化的人类组织进行采集。以下所述方法已用于从去标识化、废弃的组织中分离成肌细胞。所述方法同样适用于从经患者知情同意采集的组织样本中分离细胞。
1. 细胞分离
- 肌肉活检组织的解离与成肌细胞的纯化
- 在组织培养生物安全柜中预先称量一个10 cm组织培养皿的重量，然后再次称量含有肌肉活检组织的培养皿，以计算待解离组织的量。
- 使用无菌手术刀将肌肉组织充分切碎，并加入几滴无菌1×HBSS，防止组织干燥。
- 每克待消化的肌肉组织中加入3.5 ml dispase II和3.5 ml collagenase D。用无菌25 ml 移液管将切碎的组织与酶溶液反复吹打数次。将培养皿置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育15 min ，持续消化组织，直至匀浆可轻松通过无菌5 ml移液管。
注：通常在45–90 min内通过酶消化完成组织解离。更多细节请参见“代表性结果”部分。 - 向已解离的组织中加入2倍体积的无菌生长培养基，通过100 µm细胞筛过滤至50 ml 离心管中，并在室温下以329 × g（约1,100 rpm）离心10 min ，收集细胞沉淀。培养基成分请参见材料表。
- 将细胞沉淀重悬于1倍体积的无菌生长培养基中，并加入7倍体积的红细胞裂解液。将溶液通过40 µm细胞筛过滤，然后在室温下以329 × g离心10 min，收集细胞沉淀。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于含0.5% BSA的1×HBSS中，浓度为1 × 106 个细胞/100 µl。预留约250,000个细胞于单个离心管中作为阴性（未染色）对照。另准备单色染色对照管，分别用于碘化丙啶（propidium iodide）和CD56染色，这些对照是通过FACS分选正确设门获取CD56阳性细胞所必需的。请参考细胞分选手册或咨询FACS分选核心设施专家，以确保包含适当的对照。
- 使用抗CD56抗体（5 µl/106 个细胞）对拟分选的细胞进行染色。将所有样本（包括对照）置于冰上孵育30 min。
- 用10 ml 1×HBSS洗涤样本，并在4°C下使用冷藏离心机以329 × g（约1,100 rpm）离心10 min ，收集细胞沉淀。
- 向待分选样本中加入碘化丙啶，终浓度为1 µg/ml，用于排除死细胞。使用荧光激活细胞分选仪从非成肌细胞中纯化CD56阳性的成肌细胞。
- 皮肤活检组织的解离
注：当无法获取肌肉活检样本时，可从患者皮肤钻取活检组织中分离真皮成纤维细胞。真皮成纤维细胞可作为多种研究的生物材料，包括通过MyoD转导生成成肌细胞。此外，真皮成纤维细胞还可用于诱导生成iPS细胞，进而分化为多种细胞类型以供进一步研究。- 将皮肤活检组织置于运输培养基中运送至实验室。样本收到后应尽快进行原代培养。若无法在当天建立原代培养，可将样本在室温下保存过夜。
- 在超净工作台中将皮肤活检组织转移至无菌35 mm培养皿中。
- 用无菌1×PBS在培养皿中冲洗皮肤活检组织，以去除血液和碎片。使用无菌手术刀去除脂肪组织。
- 加入2 ml胶原酶溶液，并用手术刀切碎组织，根据组织大小在37 °C孵育45 min至1 hr。
- 将消化后的组织转移至15 ml离心管中，用2 ml成纤维细胞培养基冲洗培养皿两次，并将冲洗液收集至同一离心管中。
- 在室温下以200 × g离心5 min ，收集细胞沉淀。
- 弃去上清液，用3 ml成纤维细胞培养基洗涤沉淀以去除胶原酶，再次离心收集细胞沉淀。培养基成分请参见材料表。
- 重复步骤1.2.7一次。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml成纤维细胞培养基中，接种至T25无菌组织培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
- 在接下来的1–3天内观察培养物中成纤维细胞的贴壁与生长情况。
注：部分小块组织也可能贴附于培养皿，成纤维细胞会从这些组织块中迁移而出。 - 在相同条件下维持培养，直至成纤维细胞生长至约80%汇合度。
- 通过胰酶消化收集成纤维细胞，并转移至新的培养瓶中进行扩增。胰酶消化操作：用无Ca++和Mg++的1×PBS洗涤培养物3次。向细胞中加入胰酶-EDTA（见材料表）（2 ml/T25培养瓶），在37 °C孵育2 min 。
- 将已脱落的细胞分种至其他培养瓶中。若部分组织块仍附着于原T25培养瓶，可向该瓶中加入5 ml新鲜培养基，成纤维细胞将持续迁移而出。
注：扩增后的成纤维细胞培养物可冻存为P1代，并储存在液氮中以备后续实验使用。
2. 肌源性细胞的永生化
- 将500万个Phoenix Ecotropic包装细胞（PE）接种于10 cm无菌组织培养皿中，使用DMEM与Medium 199按4:1比例混合的培养基，添加10%小牛血清，过夜培养。
- 转染前30分钟，用5 ml新鲜培养基（添加10 mM咖啡因）对细胞进行换液。
- 将中量提取的质粒DNA（CDK4或hTERT质粒）2 μg与Polyjet混合均匀，按制造商建议在室温下孵育15分钟。
- 将质粒/Polyjet混合物加入PE细胞中，过夜培养。
- 用新鲜培养基（DMEM与Medium 199按4:1比例混合，添加10%小牛血清）更换培养液。12小时后，收集含病毒的上清液，并通过0.45 μm孔径滤器过滤。
- 取1 ml收集的上清液感染amphotropic包装细胞系PA317 5，过夜后使用0.5 mg/ml新霉素（G418）筛选CDK4转导细胞，或使用0.5 mg/ml潮霉素筛选hTERT转导细胞，以获得稳定的病毒产生细胞系。
- 将稳定包装细胞培养至接近汇合状态，制备工作用病毒上清液；连续三天，每天早晨、晚上和次日早晨各收集一次上清液。
- 过滤病毒上清液，可直接使用，或分装为1 ml等份，于-80 °C保存备用。注意：每次冻融会使病毒感染效率降低50%。所有接触过病毒颗粒的物品在丢弃前必须用漂白剂清洗。
注意：稳定的PA317病毒产生细胞系可使用含10% DMSO和90%血清的冻存液冻存，并于-150 °C长期保存。 - 将经FACS纯化的成肌细胞（见步骤1.1–1.9描述）以5 × 104 个细胞/孔的密度接种于涂有0.1%明胶的6孔板中。确保细胞已贴壁后再进行病毒感染。
- 每孔加入400 μl过滤后的、新鲜制备或冻存的病毒上清液，过夜感染（保留2孔作为对照）。
- 更换培养基，每孔加入2.5 ml新鲜肌肉细胞培养基（DMEM与Medium 199按4:1比例混合，添加15%胎牛血清；0.02 M HEPES缓冲液；1.4 mg/L 维生素B12；0.03 mg/L ZnSO4；0.055 mg/L 地塞米松；2.5 μg/L肝细胞生长因子和10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子）。将含有病毒颗粒的培养基和移液器丢弃至含漂白剂的容器中。细胞继续在此培养基中培养3天以恢复，随后分别使用400 μg/ml新霉素（CDK4感染）或300 μg/ml潮霉素（hTERT感染）进行筛选处理。
- 持续在药物筛选条件下培养细胞，直至对照组培养皿中的细胞死亡（1–2周）。
- 在细胞达到汇合前（60–80%汇合度，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA）进行传代，即使在筛选期间也应如此。将细胞重铺至多个10 cm培养皿中，使用新鲜成肌细胞培养基（如步骤2.11所述）并补充筛选药物。可将永生化筛选后的细胞作为异质性群体维持，或进行克隆以获得完全均一的遗传背景（每个细胞中外源基因插入位点相同）。
- 采用以下步骤进行单克隆筛选：
- 以低密度接种细胞（例如，10 cm培养皿中接种300–500个细胞），培养约两周，直至形成小克隆（10–20个细胞）。
- 此时移除大部分培养基，仅保留薄层液体以防止细胞干燥。
- 将克隆环（一端浸有硅酮真空润滑脂）置于目标克隆上方，并加入数滴胰蛋白酶/EDTA。
- 待细胞变圆后，用1 ml枪头或巴斯德移液管小心吸出细胞，转移至最小规格的多孔板中（96孔、48孔、24孔或12孔板）。
- 根据需要扩增克隆，避免局部汇合。
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结果
图1 展示了原代组织解离过程中的一些关键步骤：将精确称量的组织置于无菌的组织培养培养皿中（图1A, B）。随后使用无菌手术刀将组织精细切碎，直至形成组织浆液（图1C, D）。加入消化酶后，通常在45–90分钟内通过酶消化法完成原代肌肉组织的解离。为防止过度消化和细胞死亡，通常每15–20分钟监测一次组织消化的进程。每15–20分钟可轻柔地用移液器吹打并混匀数次。消化步骤结束后，细胞悬液依次通过100 µm（图1E, F）和40 µm滤网进行过滤。根据起始肌肉组织的量以及样本来源于轻度或重度病变肌肉的不同，所获得的解离原代细胞具有异质性。图1G 显示了消化后立即悬浮的单核细胞示例，而 图1H 显示了消化并接种于组织培养皿后3–6小时的解离原代细胞示例。成肌细胞通常与成纤维细胞和脂肪生成细胞混合存在。在患者疾病伴有炎症的情况下，也可能存在免疫细胞。因此，可能需要对不同类型的细胞进行前瞻性分离。对于人成肌细胞的前瞻性分离，CD56或N-CAM...
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讨论
细胞作为一种有用的资源
分离和培养成肌细胞群体在建立疾病表型或 体外 疾病模型。本文所述的肌源性细胞分离方法可从骨骼肌标本中分离出成肌细胞和成纤维细胞，这些细胞随后可用于扩增、诱导分化或直接进行分析。通过显微镜观察、细胞存活率评估、细胞融合能力检测，或对RNA及蛋白质表达的分子学研究，可评估成肌细胞的结构与功能。此外，成肌细胞可分化为成肌管细胞，后者具有未成熟肌纤维的多种特征，从而可在肌肉发育及组织损伤后修复的背景下直接评估成肌细胞的功能。尽管上述表型在肌源性细胞早期传代中通常具有较好的可重复性，但许多原代肌源性细胞系的行为特征可能随着传代次数的增加而发生改变。因此，有时有必要对特定的肌源性细胞系进行永生化处理（如本文所述），这有助于简化细胞培养的建立过程，并在较长时间内获得可重复的实验结果。
特定细胞群体的筛选
本方案描述了使用荧光激活细胞分选（FACS）作为纯化手段，从骨骼肌组织中分离成肌细胞的方法。所提出的细胞筛选策略包括使用碘化丙啶（死细胞指示剂...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本出版物由Cure CMD、法国肌肉疾病协会（AFM）资助（项目编号16297）以及美国国立卫生研究院（资助号：K08 AR059750、L40 AR057721 和 2R01NS047727）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| 组织 培养生物安全柜 | Baker Company, Inc. | Model SterilGuard Hood | |
| 台式离心机，例如 Beckman 型号 | Beckman Coulter | Model Allegra 6R | 若进行细胞分选，建议使用带制冷功能的离心机 |
| 显微镜 | 尼康 | Model Eclipse TS100 | |
| 组织培养箱，连接至CO₂2 源 | Forma Scientific | 第二系列 | |
| 荧光激活细胞分选仪（FACS） | Becton Dickinson | 模型 Aria | |
| 从组织中分离原代成肌细胞的试剂 | |||
| Dispase II | 罗氏应用科学 | #04942078001 | 在DMEM中配制2.4 U/ml的sock溶液 |
| 胶原酶D | 罗氏应用科学 | #088882001 | 配制10 mg/ml的储备液 |
| 1x 无菌 Hank氏液’不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS） | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| 牛血清白蛋白，第五组分 | Sigma | #05470 | 制备无菌的 用于FACS分选的1X HBSS 0.5% BSA溶液 |
| 用于成肌细胞的无菌培养基：Dulbecco’s 改良伊格尔’高糖（4.5 g）DMEM培养基，添加30%胎牛血清 | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | 含 L-谷氨酰胺 |
| 红细胞裂解液 | Qiagen | 158904 | |
| 碘化丙啶储存液 10 mg/ml | Sigma | P4170 | 通过将粉末溶于无菌蒸馏水中来配制储备液 |
| 用于流式细胞术的抗人CD56抗体 | Biolegend | 318310 | APC标记的抗体，其他标签也可提供 |
| 原代成肌细胞永生化试剂 | |||
| 嗜鼠包装细胞系 PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| 兼嗜性包装细胞系 PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| 猪皮明胶 | Sigma | G1890-500g | 配制0.1%明胶水溶液作为储备液。将培养皿用该溶液在37℃下进行包被。°37°C 孵育一小时。移除溶液，加入培养基。 |
| PolyJet | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| 潮霉素 | EMD Biosciences | 400051 | |
| 含有 mCDK4 和 hTERT 的 pBabe 质粒 | 非商业供应 | Stadler 等，2013 | |
| Qiagen 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | Medium 199 (31150022) | |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | Life Technologies | DMEM (11965-092) | DMEM:199（4:1）混合液 |
| 成肌细胞生长培养基：4:1 Dulbecco’改良型伊格尔培养基（DMEM）和199号培养基（Medium 199），添加15%胎牛血清；0.02 M HEPES缓冲液；1.4 mg/L维生素B12；0.03 mg/L ZnSO4；0.055 mg/L地塞米松；2.5 μ克/升肝细胞生长因子和10 μg/L β成纤维细胞生长因子 | Life technologie（DMEM，F199）；Atlanta Biological（FBS）；Invitrogen（Hepes）；Fisher（ZincSulfate）；Sigma（Vit.B12，Dexamethasone）；Chemicon international（HGF）；Biopioneer（betaFGF） | #15630-080（Hepes）；#Z68-500（ZnSO）；#V2876.#D4902（维生素B12，Dex）；GF116（HGF）；HRP-0011（bFGF） | 准备培养基和储备液：维生素B12（20 mg/ml）；硫酸锌（60µg/ml）；Dex（55µ克/µl) 分装保存以便于使用。HGF 储存液（5µ微克/毫升）和 FGF（20µg/ml）应每周新鲜添加，至最终工作浓度。 |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| 用于免疫染色的肌球蛋白重链抗体 | 发育型杂交瘤库 | MF20 | 克隆 MF20 |
| 用于免疫染色的Desmin抗体 | 赛默飞世尔科技 | MS-376-S0 | 克隆 D33 |
| 马血清 | Invitrogen | 26050-088 | |
| 原代皮肤成纤维细胞分离试剂 | |||
| 运输培养基：RPMI 1640 添加 10% 胎牛血清和 0.2% 青霉素/链霉素 | RPMI 1640 培养基：GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| 人原代成纤维细胞培养基：RPMI 1640 培养基添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素 | 胎牛血清：Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| 胶原酶溶液：将胶原酶 II 型（100 mg）溶于 12.5 ml 成纤维细胞培养基中，过滤除菌 | 沃辛顿 | 4176 | |
| 无钙无镁无菌 1X 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza | 17-516F | |
| 分离原代成肌细胞的材料 | |||
| 50 ml 和 15 ml 无菌锥形管 | GeneMate/Bioexpress | C-3394-4（50 ml）；C3394-1（15 ml） | |
| 无菌手术刀 | Aspen Surgical | 372610 | |
| 血细胞计数板 | 豪泽科学 | 1492 | |
| 无菌的5、10和25 ml移液管 | 贝尔科玻璃 | 1226-05010（5 ml）；1200-10010（10 ml）；1228-25050（25 ml） | 可重复使用的移液管在使用前需清洗、塞入棉花并进行高压灭菌 |
| 无菌组织培养处理的塑料培养皿（10 cm） | BD Falcon | 353003 | |
| 无菌尼龙细胞滤网（100 µ米和40 µm 大小） | BD Falcon | 352340 (40µ米）；352360（100µm) | |
| 用于成肌细胞永生化的材料 | |||
| 无菌 0.45 µm 滤膜 | Millipore | SLHV013SL | |
| 克隆环 | 康宁 | #3166-8 | 使用前后需清洗并高压灭菌 |
| 成纤维细胞系所需材料 | |||
| 无菌35 mm组织培养处理塑料培养皿 | Greiner bio-one | 628160 | |
| 无菌手术刀 | DeRoyal | D4510A | |
| 无菌T25细胞培养瓶 | Techno Plastic Product, TPP | 90026 | 由MIDSCI在美国销售 |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
