方法文章

从肌肉活检中分离并永生化患者来源的细胞系用于疾病建模

DOI：

10.3791/52307

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2015年1月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

本文内容

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摘要

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本方案描述了从肌肉或皮肤组织中分离活细胞并建立成肌细胞和成纤维细胞原代培养体系的技术。同时介绍了一种使这些细胞系永生化的方法。总体而言，这些方案为获取和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

患者特异性细胞系的建立是诊断或转化医学研究中极为宝贵的工具，这些细胞可从患者诊断过程中获取的皮肤或肌肉活检组织中分离获得。本方案中，我们描述了一种从小量肌肉或皮肤组织中分离活细胞用于原代培养的技术。此外，我们还提供了一种将原代细胞来源的成肌细胞系和成纤维细胞系永生化的方法。一旦细胞系实现永生化，即可实现患者来源细胞的大规模扩增。永生化细胞适用于多种下游应用，包括药物筛选和 体外 纠正基因突变。总体而言，这些方案为生成和保存患者来源的细胞以用于后续应用提供了可靠的工具。

引言

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分子诊断在过去20年中取得了显著进展。如今，基因组DNA已可常规地从痰液或口腔拭子中分离获得，而过去则需要通过抽血获取。得益于当前快速的检测周期和便捷的基因测序技术，许多致病突变已能被常规识别，无需额外检测。在肌肉疾病诊断领域，过去十年中已发现数十个与肌营养不良或肌病相关的新基因，这极大地改变了这些疾病的诊断方式1,2。目前，已有数十个基因被确认为导致肌营养不良和先天性肌病的原因，尽管其中许多基因致病的具体机制仍不明确。特别是罕见病由于患者人群规模小，诊断和研究面临较大挑战。因此，无论是罕见病还是更常见的疾病，建立稳定的工具以促进发病机制研究和治疗药物筛选都具有重要意义。

尽管DNA诊断技术已取得显著进展，但对于许多疑似患有原发性代谢或肌肉疾病的患者，仍需进行肌肉活检以确立初步诊断。当必须进行肌肉活检时，可在对患者额外风险极小的情况下，同时获取更多用于诊断和研究的组织样本。由于每份组织标本均有多种用途，因此建立一种简单、高效且仅需少量组织即可开展原代细胞培养的技术显得尤为重要。为最大限度地从组织中分离原代细胞并实现活体材料的长期保存，必须对肌肉或皮肤活检样本进行合理的分流处理。此外，干细胞研究和药物筛选在利用基于细胞的检测方法开发多种疾病疗法方面具有广阔前景3,4。

本文介绍了从人体肌肉或皮肤活检样本中分离原代细胞的方法。此外，还包括一种成肌细胞永生化方案，该方法有助于从个体样....

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方案

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注意：人类组织采集方案必须经过机构伦理审查委员会（IRB）的审查和批准。波士顿儿童医院和布莱根妇女医院IRB委员会已批准对废弃的、去标识化的人类组织进行采集。以下所述方法已用于从去标识化、废弃的组织中分离成肌细胞。所述方法同样适用于从经患者知情同意采集的组织样本中分离细胞。

1. 细胞分离

  1. 肌肉活检组织的解离与成肌细胞的纯化
    1. 在组织培养生物安全柜中预先称量一个10 cm组织培养皿的重量，然后再次称量含有肌肉活检组织的培养皿，以计算待解离组织的量。
    2. 使用无菌手术刀将肌肉组织充分切碎，并加入几滴无菌1×HBSS，防止组织干燥。
    3. 每克待消化的肌肉组织中加入3.5 ml dispase II和3.5 ml collagenase D。用无菌25 ml 移液管将切碎的组织与酶溶液反复吹打数次。将培养皿置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育15 min ，持续消化组织，直至匀浆可轻松通过无菌5 ml移液管。
      注：通常在45–90 min内通过酶消化完成组织解离。更多细节请参见“代表性结果”部分。
    4. 向已解离的组织中加入2倍体积的无菌生长培养基，通过100 µm细胞筛过滤至50 ml 离心管中，并在室温下以329 × g（约1,100 rpm）离心10 min ，收集细胞沉淀。培养基成分请参见....

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结果

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图1 展示了原代组织解离过程中的一些关键步骤：在无菌的组织培养培养皿中称取准确重量的组织（图1A、B）。然后使用无菌手术刀将组织切碎至形成匀浆状（图1C，D）。加入消化酶后，通常在45–90分钟内通过酶消化完成原代肌肉组织的解离。组织消化过程一般每15–20分钟监测一次，以防止过度消化和细胞死亡。每15–20分钟可轻轻吹打并混匀数次。消化步骤结束时，细胞悬液经100 µm滤膜过滤（图1E、F）然后通过40 µm滤膜。根据起始肌肉组织的量以及样本来源于轻度或重度受累的肌肉，所获得的解离原代细胞将具有异质性。 图1G 显示消化后立即悬浮的单个核细胞示例，而 图1H 显示了组织消化后3-6小时在培养皿中接种的原代细胞解离示例。肌源性细胞通常与成纤维细胞和脂肪源性细胞混合存在。在患者疾病伴有炎症的情况下，也可能存在免疫细胞。因此，可能需要对不同类型的细胞进行前瞻性分离。对于人肌源性细胞的前瞻性分离，CD56或N-CAM已被广泛用作可靠的标志物 .......

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讨论

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细胞作为一种有用的资源

分离和培养成肌细胞群体在建立疾病表型或 体外 疾病模型。本文所述的肌源性细胞分离方法可从骨骼肌标本中分离出成肌细胞和成纤维细胞，这些细胞随后可用于扩增、诱导分化或直接进行分析。通过显微镜观察、细胞存活率评估、细胞融合能力检测，或对RNA及蛋白质表达的分子学研究，可评估成肌细胞的结构与功能。此外，成肌细胞可分化为成肌管细胞，后者具有未成熟肌纤维的多种特征，从而可在肌肉发育及组织损伤后修复的背景下直接评估成肌细胞的功能。尽管上述表型在肌源性细胞早期传代中通常具有较好的可重复性，但许多原代肌源性细胞系的行为特征可能随着传代次数的增加而发生改变。因此，有时有必要对特定的肌源性细胞系进行永生化处理（如本文所述），这有助于简化细胞培养的建立过程，并在较长时间内获得可重复的实验结果。

特定细胞群体的筛选

本方案描述了使用荧光激活细胞分选（FACS）作为纯化手段，从骨骼肌组织中分离成肌细胞的方法。所提出的细胞筛选策略包括使用碘化丙啶（死细胞指示剂.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本出版物由Cure CMD、法国肌肉疾病协会（AFM）资助（项目编号16297）以及美国国立卫生研究院（资助号：K08 AR059750、L40 AR057721 和 2R01NS047727）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
组织 培养生物安全柜Baker Company, Inc.Model SterilGuard Hood
台式离心机，例如 Beckman 型号 Beckman CoulterModel Allegra 6R若进行细胞分选，建议使用带制冷功能的离心机
显微镜尼康Model Eclipse TS100
组织培养箱，连接至CO₂2 源Forma Scientific 第二系列
荧光激活细胞分选仪（FACS）Becton Dickinson模型 Aria
从组织中分离原代成肌细胞的试剂
Dispase II罗氏应用科学#04942078001在DMEM中配制2.4 U/ml的sock溶液
胶原酶D 罗氏应用科学#088882001配制10 mg/ml的储备液
1x 无菌 Hank氏液’不含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）GIBCO Life Technologies#14185-052
牛血清白蛋白，第五组分Sigma#05470制备无菌的  用于FACS分选的1X HBSS 0.5% BSA溶液
用于成肌细胞的无菌培养基：Dulbecco’s 改良伊格尔’高糖（4.5 g）DMEM培养基，添加30%胎牛血清GIBCO Life Technologies11965-092含 L-谷氨酰胺
红细胞裂解液Qiagen158904
碘化丙啶储存液 10 mg/mlSigmaP4170通过将粉末溶于无菌蒸馏水中来配制储备液
用于流式细胞术的抗人CD56抗体Biolegend318310APC标记的抗体，其他标签也可提供
原代成肌细胞永生化试剂
嗜鼠包装细胞系 PECell BiolabsRV-101
兼嗜性包装细胞系 PA3174Cell BiolabsRV-102
猪皮明胶SigmaG1890-500g配制0.1%明胶水溶液作为储备液。将培养皿用该溶液在37℃下进行包被。°37°C 孵育一小时。移除溶液，加入培养基。
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
潮霉素EMD Biosciences400051
含有 mCDK4 和 hTERT 的 pBabe 质粒非商业供应Stadler 等，2013
Qiagen 质粒中量提取试剂盒Qiagen12143
Medium 199Life Technologies Medium 199 (31150022)
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Life Technologies DMEM (11965-092)DMEM:199（4:1）混合液
成肌细胞生长培养基：4:1 Dulbecco’改良型伊格尔培养基（DMEM）和199号培养基（Medium 199），添加15%胎牛血清；0.02 M HEPES缓冲液；1.4 mg/L维生素B12；0.03 mg/L ZnSO4；0.055 mg/L地塞米松；2.5 μ克/升肝细胞生长因子和10 μg/L β成纤维细胞生长因子Life technologie（DMEM，F199）；Atlanta Biological（FBS）；Invitrogen（Hepes）；Fisher（ZincSulfate）；Sigma（Vit.B12，Dexamethasone）；Chemicon international（HGF）；Biopioneer（betaFGF） #15630-080（Hepes）；#Z68-500（ZnSO）；#V2876.#D4902（维生素B12，Dex）；GF116（HGF）；HRP-0011（bFGF） 准备培养基和储备液：维生素B12（20 mg/ml）；硫酸锌（60µg/ml）；Dex（55µ克/µl) 分装保存以便于使用。HGF 储存液（5µ微克/毫升）和 FGF（20µg/ml）应每周新鲜添加，至最终工作浓度。
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
用于免疫染色的肌球蛋白重链抗体发育型杂交瘤库MF20克隆 MF20
用于免疫染色的Desmin抗体赛默飞世尔科技MS-376-S0克隆 D33
马血清Invitrogen26050-088
原代皮肤成纤维细胞分离试剂
运输培养基：RPMI 1640 添加 10% 胎牛血清和 0.2% 青霉素/链霉素RPMI 1640 培养基：GIBCO Life Technologies11875-093
人原代成纤维细胞培养基：RPMI 1640 培养基添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素胎牛血清：Thermo ScientificSH30071.03
胶原酶溶液：将胶原酶 II 型（100 mg）溶于 12.5 ml 成纤维细胞培养基中，过滤除菌沃辛顿4176
无钙无镁无菌 1X 磷酸盐缓冲液（PBS）Lonza17-516F
分离原代成肌细胞的材料
50 ml 和 15 ml 无菌锥形管GeneMate/BioexpressC-3394-4（50 ml）；C3394-1（15 ml）
无菌手术刀Aspen Surgical372610
血细胞计数板豪泽科学1492
无菌的5、10和25 ml移液管贝尔科玻璃1226-05010（5 ml）；1200-10010（10 ml）；1228-25050（25 ml）可重复使用的移液管在使用前需清洗、塞入棉花并进行高压灭菌
无菌组织培养处理的塑料培养皿（10 cm）BD Falcon353003
无菌尼龙细胞滤网（100 µ米和40 µm 大小）BD Falcon352340 (40µ米）；352360（100µm)
 用于成肌细胞永生化的材料
无菌 0.45 µm 滤膜MilliporeSLHV013SL
克隆环康宁#3166-8使用前后需清洗并高压灭菌
成纤维细胞系所需材料 
无菌35 mm组织培养处理塑料培养皿Greiner bio-one628160
无菌手术刀DeRoyalD4510A
无菌T25细胞培养瓶Techno Plastic Product, TPP90026由MIDSCI在美国销售
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010

参考文献

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  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E.

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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勘误

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Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

标签

FACS CDK4 hTERT

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