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将人类视频荧光吞咽研究方法改良用于检测和表征小鼠疾病模型中的吞咽障碍

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DOI：

10.3791/52319

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2015年3月1日

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1Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Missouri, 2Department of Communication Science and Disorders, University of Missouri, 3Department of Medicine, University of Missouri

本文内容

摘要

本研究成功将人类视频荧光吞咽检查（VFSS）方法改进并应用于小鼠疾病模型，旨在促进吞咽困难的转化研究。

摘要

本研究调整了人类视频荧光吞咽检查（VFSS）方法，以适用于小鼠疾病模型，旨在促进吞咽困难的转化研究。成功的实验结果依赖于三个关键要素：允许小鼠在受限空间内直立且无束缚地自主进食的测试舱、可掩盖市售口服造影剂厌恶性味道/气味的配方，以及能够量化吞咽生理功能的逐步测试方案。若缺失其中任一要素，将对研究结果产生不利影响。此外，荧光成像系统的能量水平能力将决定可检测的吞咽参数范围。大多数研究中心配备的是适用于人类和较大动物的高能量荧光成像仪，这类设备在检测小鼠及其他小型啮齿类动物时图像质量极差。尽管存在这一限制，我们已确定在使用高能量荧光成像仪结合新型小鼠VFSS方案时，可稳定量化小鼠的7项VFSS参数。近期，我们获得了一套专为小鼠及其他小型啮齿类动物设计的低能量荧光成像系统，其成像分辨率和放大能力极佳。初步研究表明，将该新系统与新型小鼠VFSS方案结合使用，可稳定量化小鼠的13项吞咽参数，几乎是传统方法所得参数数量的两倍 即， 高能量）透视系统。随着我们不断优化该新系统的性能，预计还将发现更多吞咽相关参数。目前的结果表明，使用低能量透视系统能够检测并量化吞咽生理中的细微变化，而这些变化在采用高能量透视系统研究小鼠疾病模型时可能被忽略。

引言

吞咽障碍（吞咽功能受损）是多种疾病常见的症状，影响各个年龄段的人群。例如中风、帕金森病、阿尔茨海默病、脑瘫、肌营养不良、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、巴滕病、头颈部癌症、早产以及高龄衰老。吞咽障碍与死亡率高度相关，通常由严重营养不良或因含菌的食物/液体/唾液误吸入肺部引发肺炎所致1-4。仅在美国，每年就有超过1500万人受到这种致残且危及生命的医学状况影响3。尽管该病症患病率高且后果严重，目前对吞咽障碍的治疗手段仍局限于姑息性（而非根治性）方法，例如饮食调整（例如，避免特定性状的食物或液体）、姿势改变（例如，吞咽时低头收 chin）、运动干预（例如，针对口腔、咽部和喉部肌肉的锻炼）、感觉刺激干预（例如，使用风味、温度和/或机械刺激）以及管饲营养（例如，通过鼻胃管（NG）或经皮内镜胃造瘘管（PEG）提供营养和水分）。这些治疗方法仅能缓解症状，无法针对病因进行治疗。事实上，发现新型有效疗法的主要障碍在于对导致吞咽障碍的病理机制了解有限，而这些机制可能因疾病不同而各异。

吞咽困难的诊断主要通过一种称为视频荧光吞咽检查（videofluoroscopic swallowing study, VFSS）的放射学检查进行，该检查也被称为改良钡餐吞咽检查。在过去30多年中，该诊断方法一直被视为评估吞咽功能的金标准5-7。该检查要求患者坐在或站在荧光成像设备的X射线束路径中，主动吞咽与口服造影剂（通常为硫酸钡8,9或碘海醇10）混合的不同质地的食物和液体。当患者吞咽时，含有造影剂的食物和液体从口腔至胃的运动过程可通过计算机显示器实时观察。软组织结构亦清晰可见，可对其结构与功能进行评估。患者需对每种食物和液体质地进行多次吞咽，整个过程被视频记录，以便后续逐帧回放与分析，从而量化吞咽困难的存在与否及其严重程度。通常需分析吞咽过程中的多个生理成分，例如咽部吞咽的解剖触发点、食团通过咽部和食管的传输时间、喉部抬升的程度与持续时间、吞咽后残留物的位置与量，以及误吸的发生情况及其生理学原因7,11。

近期，人类吞咽造影检查（VFSS）方案的部分内容已被用于研究自由活动的大鼠；然而，由于大鼠在测试过程中无法始终保持在X线透视视野内，研究结果受到限制12。此前尚未在小鼠中尝试过VFSS。若能成功将人类VFSS方案适配用于小鼠和大鼠，将为研究目前已有的数百种已知会导致人类吞咽困难的啮齿类动物（小鼠和大鼠）疾病模型提供一种全新的研究方法。因此，这种新方法（下文称为啮齿类VFSS）将加速识别和验证适用于研究与人类吞咽困难相关的肌肉、神经及脑组织中潜在神经生理病理机制的啮齿类吞咽困难模型。此外，啮齿类VFSS将有助于识别吞咽功能/功能障碍的客观指标（生物标志物），这些指标可直接与人类进行比较。这些跨物种的吞咽造影生物标志物随后可作为新型结局指标，用于量化小鼠和大鼠临床前试验中的治疗效果，从而更好地向人类临床试验转化。

为此，使用约100只雌雄不限的小鼠建立了小鼠VFSS实验方案。所有小鼠均为C57或杂交C57/SJL品系。C57小鼠未经过基因改造，而C57/SJL则是转基因小鼠品系的背景品系。 SOD1-G93A （或 SOD1）小鼠，这是肌萎缩侧索硬化症（ALS）最常用的动物模型。SOD1品系群体中转基因个体与非转基因个体的比例约为1:1。即， ALS 患病小鼠和非转基因（即， 未受影响的同窝幼仔

小鼠VFSS方案包含三个组成部分：

  1. 定制设计的观察室，允许受试者在荧光成像机内受限空间中直立且无束缚地自愿进食和吞咽，
  2. 掩盖口服对比剂不良味道/气味并产生足够放射密度以充分显示吞咽过程的配方，
  3. 一种逐步测试方案，可最大程度提高动物依从性，减少总测试时间与辐射暴露，并允许对吞咽各阶段的多个吞咽参数进行量化即， 口腔、咽部和食管

这种联合作用营造了一个舒适、低应激的自主进食检查环境，能够对小鼠典型的摄食和吞咽行为进行评估。

方案

小鼠VFSS方案遵循经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案以及NIH指南。

1. 使用聚碳酸酯管材和片材构建观察室（图1）

  1. 使用手动铣床将宽5 cm、方形的聚碳酸酯管（壁厚约2 mm）切割成16 cm长的段。大多数小鼠均可适应该尺寸，形成狭窄的测试腔室，允许小鼠自由行走和转身。约2 mm的壁厚在提供足够刚性的同时，不会显著衰减X射线束。
    1. 本实验方案需要两种类型的腔室：“饮水管”，设计用于通过饮水管嘴递送液体；以及“通风管”，设计用于通过插针式食碗递送液体。
      1. 对于“饮水管”，使用手动铣床在每根管子一端顶部附近开一个小型椭圆形孔（12 × 8 mm）。该孔用于在行为训练和VFSS测试期间通过饮水管嘴递送饮用溶液。
      2. 对于“通风管”，在每根管子一端顶部附近钻9个小型通风孔。该管在VFSS测试中配合插针式食碗使用，而非饮水管。
      3. 可通过插针式食碗递送液体时也可使用饮水管；但必须封闭腔室顶板上的开口，以防止小鼠产生干扰性的探索行为（见步骤6.2.2）。
  2. 使用计算机控制的铣床（也称为计算机数控，CNC）将厚3/4英寸的聚碳酸酯板材切割成端盖（每管2个，尺寸为50 × 50 mm）。
    1. 在每个端盖内表面的一侧边缘附近铣出一个椭圆形凹槽（19 × 6 mm）。该凹槽用于固定插针式食碗，供小鼠在VFSS测试期间饮水。
    2. 在每个端盖上铣出5个圆形通风孔（直径6 mm）。
    3. 在端盖上铣出一个较小的圆形孔（直径5 mm），位置位于椭圆形凹槽正上方。该孔用于在VFSS测试期间向插针式食碗中注入液体。
    4. 在端盖外表面，围绕该小孔铣出一个直径9/16英寸、深1/4英寸的沉孔。
    5. 在端盖内表面边缘周围铣去2 mm，深度为7 mm，形成一个台阶，便于插入管子末端。
    6. 在端盖的台阶处铣出一个1 mm宽的凹槽，用于安装O型圈，以防止端盖从管子末端脱落。
    7. 将端盖所有外露边缘修圆，并对所有角落进行倒角，以防小鼠啃咬。
  3. 使用CNC机床从聚碳酸酯板材加工制作插针式食碗。整体尺寸应为24 × 19 × 6 mm3，一端设有10 × 3 mm2的碗状凹陷。每根管子需配备一个插针式食碗。插针式食碗应能紧密嵌入端盖的椭圆形凹槽中（图2）。

带壶嘴、通风口的动物固定管；透明塑料材质，端盖， peg-bowl；装置示意图。
图 1：观察室。 观察室的设计旨在使动物在透视成像视野中自由活动。这些图片展示了进行VFSS所必需的观察室组件。上方： “壶嘴管”，用于通过壶嘴输送液体。下方： “通风管”，用于通过 peg-bowl 输送液体。两种端盖可在壶嘴管和通风管之间互换使用。

端盖设计：内部和外部视图、销碗连接、工程部件分析。
图 2：销碗。每个销碗可卡入端盖内侧面上的凹槽中。左图：未组装的部件；中图：已组装的部件；右图：端盖的外侧面。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 使用离心管、硅胶塞和金属管嘴组装吸管瓶（图3）

  1. 使用一个冲孔钻（5/16”）在每个硅胶塞中心钻一个孔。
  2. 在钻好的孔中滴入几滴矿物油，并手动将金属导管插入塞子的宽端。建议使用直头圆珠形导管，因为直头开口导管会导致造影剂在观察室内部过度泄漏和飞溅，从而干扰测试过程中的可视化效果。
  3. 调整导管长度，使其贯穿整个硅胶塞，并从塞子宽端向外延伸约 3 cm。
  4. 将每个塞子的窄端（带有吸管）插入一支 30 ml 离心管中。
  5. 通过将导管穿过观察室顶部的椭圆形孔来检查其长度是否合适。导管尖端应距离观察室顶部约 1 cm，此长度足以让健康的成年小鼠轻松触及。
    注意：若导管过长，小鼠饮水时需转头或倾斜头部，这会遮挡VFSS检查期间对吞咽过程的观察。
  6. 对于幼龄小鼠、体型较小的小鼠品系，以及因肢体运动功能障碍而无法触及导管的小鼠疾病模型，应延长导管长度以适应其需求。
  7. 新制作的导管在使用前应进行清洗，以去除矿物油、硅胶碎屑以及操作过程中可能引入的其他污染物。

使用吸管瓶、离心管、硅胶塞的实验小鼠饮水装置；设备演示。
图 3：吸管瓶装置。 左图：未组装的组件。中图：已组装的组件。右图：小鼠在观察室内通过吸管饮水。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 构建用于 peg-bowls 的注射器输送系统（图 4）

  1. 使用车床加工用于连接聚乙烯（PE）管与观察室端盖的接头，具体如下所述。
    1. 将直径为1/2英寸的聚甲醛树脂棒材切割成长度为1 1/4英寸的节段，此处称为管适配器（或适配器）。
    2. 在每个接头的一端，将尖端1/2英寸长度的部分减小至3/16英寸直径，本文中称为细端。
    3. 对于每个转接头剩余的 3/4 英寸长度部分（即， 直径1/2英寸的一端）加工出便于手动握持的凹槽。本文将此部分称为宽端。
    4. 在每个接头的宽端，钻一个直径为0.098英寸、深度为1英寸的中心孔。
    5. 将每个接头中心孔的剩余部分钻孔并铰孔至0.096”，以确保与PE管紧密贴合。
  2. 使用剪刀将PE导管（PE 240，内径1.67 mm）剪至所需长度。3至4英尺的长度足以在VFSS检测期间增加操作者与荧光成像设备之间的距离，从而提高辐射安全性。
    注意：较长的测试时间在VFSS检查过程中将消耗更大体积的对比剂溶液，可能超过标准的30 ml配制量。
  3. 将钝头15 G针头完全插入PE管的一端。接头应紧密贴合。
  4. 将PE管的另一端（自由端）从适配管宽端的中心孔插入。
  5. 将PE管从接头的窄端拉出，使其延伸约2 mm。
  6. 将适配器的窄端（带有一段约2 mm的PE管）插入观察管的端盖中；适配器应紧密地嵌入位于 peg-bowl 正上方的沉孔内。
  7. 调整PE管在接头窄端的长度，使其刚好略微伸出钉碗凹槽上方。
  8. 用烧杯中的水填充一支10 ml注射器（不带针头），并排出所有气泡。
  9. 将装满液体的注射器连接到聚乙烯（PE）管的针头端。
  10. 缓慢推动注射器活塞，将水注入观察室的柱状饮水槽中。当饮水槽接近装满时停止注水。避免过度填充，否则会在动物饮水时引起水滴飞溅。
  11. 如果 peg-bowl 未能正常注满液体，请调整 PE 管在 peg-bowl 上方延伸部分的长度。
  12. PE管过度延伸会诱使小鼠在测试期间啃咬管子，而非从 peg-bowl 中饮水。
  13. 如果聚乙烯管未充分延伸，液体将流入观察室的地面，而不是充满钉碗。
  14. 使用后，取下注射器，并用肥皂和水清洗整个注射器输送系统。使用10 ml注射器向PE管路中推入空气以去除残留水分。根据需要进行高压灭菌消毒。

小鼠固定系统，注射器中的导管装置，管路；用于药物给药研究。
图4：注射器给药系统。左侧：未组装的组件。中间：已组装的组件。右侧：小鼠在观察室中从 peg-bowl（插钉式食槽）饮水。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 构建用于远程定位观察室的电动剪刀升降台（图5）

  1. 构建一个带有 12 × 12 cm 平台的剪式升降装置，可升高和降低 5 cm，以适应小鼠在透视成像视野内不同位置的观察。升降装置材料应为金属或塑料，便于使用消毒剂清洁。
  2. 安装步进电机，以调节升降装置的高度和纵向位置。
  3. 将第一个步进电机耦合至剪式升降机构，通过移动横杆来控制高度。该耦合方式可采用丝杠或齿条-齿轮传动。
  4. 将第二个步进电机耦合至剪式升降框架，通过相对于操作台移动整个升降框架来控制其纵向位置。该耦合方式可采用丝杠或齿条-齿轮传动。
  5. 将遥控系统连接至步进电机，以便在成像过程中调节观察室位置，同时尽量减少操作人员的辐射暴露。
  6. 将手持遥控按钮与微控制器芯片连接，以控制每个步进电机的启动和运转方向。

静态升降机构设置；用于实验室设备调节的剪叉式升降机机械示意图。
图 5：遥控剪叉式升降台。 左图：剪叉式升降台的侧视图。右图：带有观察室的升降台置于荧光成像仪中。该升降台可调节观察室的位置，以确保小鼠始终处于视野范围内。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 在 VFSS 检查前进行行为训练以确保最大程度的配合

  1. 在进行VFSS测试前1-2周，让实验小鼠经历一次过夜（12-16小时）的限水调节期以诱导口渴状态，在此期间停止提供笼内饮水。限水调节的目的是使动物产生口渴感，而非脱水。动物应保持清醒和反应灵敏。该持续时间与时间间隔至关重要，可防止因一周内进行两次限水调节而导致脱水的发生。即， 一个用于行为条件训练，另一个用于VFSS测试。
  2. 将一根“管状出口”（一端由端帽封闭）放置在含有新鲜垫料的家居笼底部。封闭端应靠近笼顶的出口开口。此步骤可确保多只小鼠在夜间于笼内深处聚集睡眠时具有足够的通风。开放端允许小鼠自由进出笼室。
  3. 去除其他富集物质（例如， 巢垫和小屋）以鼓励小鼠在实验箱内整夜探索和睡眠（图6此步骤可确保小鼠在进行VFSS测试前，已适应在腔室内长时间停留。
  4. 每只小鼠在笼底提供一粒标准食物颗粒供过夜进食；不提供水或其他补水来源。
  5. 使用标准滤膜盖将小鼠在笼中过夜，因为观察室的尺寸限制了标准金属网盖无法适配笼子。将取下的金属网盖（包含食物和饮水瓶）放置在滤膜盖上方，以增加重量压紧盖子，防止小鼠逃逸。
  6. 次日早晨进行适口性测试，具体步骤如下。
    1. 在30 ml吸管瓶中配制巧克力味测试溶液，不添加对比剂（即， 用水替代碘海醇）。该配方在 表1每个待测笼子制作一瓶。
    2. 移除观察室并更换为标准金属丝盖。提供巧克力味溶液（室温，~22 °C每个笼子通过金属丝网盖插入处理 2 分钟。
    3. 通过观察2 min测试期间的饮水行为来评估适口性。
    4. 根据以下标准对适口性进行评分：
      1. 首次有小鼠在饮水口持续不间断饮水至少5秒的潜伏期。
      2. 每笼小鼠中饮用该溶液的小鼠百分比
      3. 同时在饮水嘴处饮水的小鼠数量
    5. 如果每个笼子中的大多数小鼠出现多次较长（>5 秒）的饮水行为，以及多只小鼠是否同时从饮水嘴处饮水（图7).
    6. 如果巧克力味溶液适口性不佳，可使用不同浓度的其他风味增强剂重复适口性测试，以确定一种首选溶液。
    7. 在单次测试日中，以随机顺序依次向多笼小鼠提供最多四种不同溶液（不同浓度），无需设置清洗期或清洗溶液。可考虑用于小鼠的适宜风味增强剂包括糖、奶酪、花生酱、各种水果和坚果风味以及牛奶。
      注意：为防止因反复进行水分调节而导致脱水，每周进行味觉偏好测试不应超过一次。
    8. 可能需要数周时间才能成功确定每种小鼠品系的首选溶液。目标是鉴定出能够引发多次长时间（>小鼠立即进行持续5秒的饮水行为<30秒）后进行，因为这些条件被认为是获得成功VFSS结果的关键。
  7. 在确定偏好的风味溶液后，将观察室放回各自的家笼中，以继续进行行为条件化，具体步骤如下所述。
    1. 将一端盖连接到观察室靠近椭圆形（壶嘴）孔的一端。
    2. 将吸管瓶通过观察箱顶部的椭圆形孔插入，为小鼠提供巧克力味溶液，持续 2-3 小时。此步骤可确保所有小鼠均适应在观察箱内深处饮水。
    3. 取下金属丝盖子以安装观察室。
    4. 每只小鼠在笼底放置1粒食物颗粒，供测试期间自由取食。
    5. 用标准滤膜盖盖住笼具，以防止小鼠在行为条件训练期的剩余时间内逃逸。将取下的金属丝网盖（含食物和水瓶）放置在滤膜盖上方，以压住笼盖。
  8. 行为学训练完成后，在饲养笼中自由提供水和食物。
  9. 用肥皂和水清洗观察室（管体和端盖）以及吸管瓶（瓶嘴和离心管）；根据需要通过高压灭菌进行消毒。避免使用丙酮清洗管体，因为丙酮会导致永久性浑浊，使管体不透明而非半透明。

小鼠行为研究；在透明围栏中进行的小鼠社交互动实验。
图 6：小鼠探索观察室。 小鼠天性倾向于在狭小空间中寻找庇护所。因此，当观察管被放置在小鼠的饲养笼中时，它们会自由进入并探索该管道。大多数小鼠在早晨被发现于观察室内睡觉。请点击此处查看该图的放大版本。

成分巧克力溶液（用于适口性测试）巧克力味碘海醇（用于VFSS测试）
巧克力糖浆3 ml3 ml
Iohexol (350 mg 碘/ml)0 ml15 ml
水（去离子水或过滤水）调节至终体积30 ml（27 ml）调节至终体积30 ml（12 ml）
终体积30 ml30 ml

表1：C57和C57/SJL小鼠品系偏好的巧克力味测试溶液。

实验室大鼠从金属饮水嘴饮水，动物行为研究装置。
图7：适口性测试。 在适口性测试中，味觉偏好的一个指标是同时从笼内单个饮水嘴饮水的小鼠数量。该图像显示四只小鼠正在同时饮用一种巧克力味溶液，该溶液被C57和C57/SJL品系鉴定为首选的风味增强剂。

6. 吞咽造影检查准备

  1. 将小鼠置于过夜的饮水限制期（即，停止供水 12–16 小时），具体操作如上述第 5 步所述。
    1. 将一根“通风管”（一端用端帽封闭）放置在含有新鲜垫料的饲养笼底部。封闭端应靠近笼顶的通风孔。此步骤可确保多只小鼠在夜间于笼内深处聚集睡眠时仍具有充足的通风。开放端允许小鼠自由进出笼内。
  2. 次日早晨，从笼中取出已污染的观察笼并用自来水短暂冲洗，彻底干燥后以备 VFSS 检测使用。
    1. 每次仅取出并清洁一个观察笼，以防止不同笼子之间的观察笼混淆，避免引发过度探索行为，从而显著干扰 VFSS 检测。
    2. 若在 VFSS 检测中使用“出水口管”代替“通风管”，则需将硅胶塞插入观察笼顶部的出水口，以防止探索行为（图 8）。
    3. 对每个观察笼进行标记（例如，标注其对应的饲养笼编号），以防混淆。
      注意：在将清洁后的管子放回饲养笼前，使用白板笔标记每个管子。应避免使用永久性记号笔，因其会被管材吸收，即使使用酒精或丙酮也无法清除。
  3. 配制巧克力味碘海醇溶液（或其他适口性溶液）。
    1. 为多个饲养笼配制一份测试溶液（30 ml）（表 1）。
    2. 碘海醇使用注意事项：未开封的碘海醇瓶应于室温避光保存。已开封的碘海醇应在 24 小时内使用完毕，因为暴露于空气中约一天后其黏度和味道可能发生改变。或者，可将单次用量（15 ml）分装至离心管中冷冻保存以长期储存。配制好的碘海醇测试溶液必须在数小时内使用，以确保新鲜度并防止小鼠拒饮。应将碘海醇溶液在室温下给予，以避免因温度影响吞咽功能而干扰实验结果。不得冷冻剩余的已配制测试溶液，因为冷冻会使巧克力味变苦，导致小鼠拒饮。
  4. 准备荧光透视检测环境。
    1. 使用一个备用（空置）的观察笼及带插销的饮水碗（或饮水管出水口），确定在荧光透视束中的最佳高度和位置，以实现从侧方（水平面）清晰观察饮水行为。
    2. 将荧光透视帧率设为每秒 30 帧；若设备支持，可使用更高的帧率（但不得低于此值）。
    3. 确保在荧光透视相机/探测器上适当放置放射显影校准标记物，使其在整个检测过程中均能在显示屏幕上可见。此步骤对于校准用于量化吞咽参数的长度测量至关重要。

压力测试装置中用测试塞和容器演示静态平衡。
图8：使用 peg-bowl 时的硅胶塞。 左图：硅胶塞。右图：将硅胶塞穿过观察室顶部的吸管开口。在 VFSS 测试期间，当使用 peg-bowl 而非吸管时，该塞子可防止小鼠因吸嘴开口而分心。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 小鼠的VFSS检测

  1. 观察每个笼子，以确定小鼠何时自由进入观察室。
    1. 将培养室从笼中取出，并轻轻连接2nd 端盖（若不使用饮水管，则需安装带销碗的部件），操作时注意不要夹到小鼠（尤其是尾巴）。
      注意：该方法可最大限度地减少因操作引起的小鼠应激反应，对于首次进行测试的小鼠尤为重要。
    2. 经过多次测试，当将装置置于笼内小鼠前方，或通过尾巴悬吊使小鼠位于装置开口上方时，小鼠可被轻松引导进入装置内。
  2. 将观察室（含小鼠）置于透视机内，开始侧位视野下的VFSS检测即， 水平X射线束
  3. 提供巧克力味的碘海醇溶液（表1通过插杆式饮水瓶或吸管式饮水瓶提供。
    1. 若使用插针盘，请通过上述第3步中描述的注射器输送系统加入溶液。该系统可实现插针盘的快速、便捷补充。
    2. 若使用吸管式水瓶，将吸管穿过观察室顶部的椭圆形开口。倾斜水瓶，使瓶口朝向观察室中心。
  4. 当小鼠开始饮水时，启动视频荧光透视记录。
    1. 调整观察室的位置（使用第4步中描述的遥控剪刀式升降台），使吞咽机制在视野中可见。
    2. 每次小鼠转离桩碗或吸嘴时暂停录制，以尽量减少辐射暴露时间。
    3. 当小鼠返回饮水口或 peg-bowl 时，恢复记录。
    4. 根据需要补充钉碗中的液体。
    5. 若小鼠在5分钟内未饮水，则停止测试。目标是记录多次较长的（>5秒）的连续饮水行为，这在大多数小鼠测试开始后的前2分钟内较为典型。
    6. 将不符合要求的小鼠放回饲养笼（无水），于当天晚些时候重新测试；水限制时间不得超过24小时。连续三次测试均不符合要求的小鼠应从研究中剔除。
  5. 如有需要，重新调整X光透视仪位置，以在背腹位对小鼠进行检测（即， 垂直X射线束平面）。该平面用于识别吞咽过程中食团在咽部和食管内流动的异常情况。
  6. 同一笼饲养的多只小鼠进行检测时：
    1. 在小鼠之间用干燥的纸巾清洁饮水瓶插头（及聚乙烯管尖端）或饮水管出水口。
    2. 在小鼠实验之间根据需要清洁观察室，以清除溅到室壁上的碘海醇。用自来水冲洗观察室，并用纸巾擦干。
  7. 测试来自不同饲养笼的小鼠时：
    1. 使用新的插针碗（或更换饮水管嘴），否则小鼠可能会受到先前使用同一插针碗或饮水管嘴的其他小鼠气味的干扰。插针碗和饮水管应做好标记，以避免混淆。
  8. 当完成对单个笼内所有小鼠的测试后，在饲养笼中提供水和食物。
  9. 用肥皂和水清洗观察室（管体和端盖）、钉碗、注射器递送系统以及吸管瓶（若使用，包括瓶嘴和离心管）；根据需要通过高压灭菌进行消毒。
  10. 根据安全指南处置任何剩余的碘海醇溶液；大多数机构可接受排入下水道处理。

8. 视频分析

  1. 使用支持逐帧分析吞咽造影录像的视频编辑软件，以量化感兴趣的吞咽参数（表2）。
  2. 确定至少两名经过培训的评审人员，以盲法方式独立分析每段视频：一名主要评审员和一至两名次要评审员。
    1. 主要评审员：观看每段视频，识别并分析3–5次较长的（约5秒）饮水事件。该标准基于已发表的非放射性小鼠吞咽研究13,14以及大鼠吞咽造影研究12，表明每个吞咽参数测量3–5次已足以进行统计分析。
    2. 次要评审员：独立分析主要评审员最初识别并分析的每只小鼠每个吞咽参数的3–5次测量值。
  3. 针对每只小鼠识别评审人员之间的差异。评审小组应共同重新分析所有存在差异的数据，直至达成100%共识。
  4. 对每个吞咽参数的3–5个共识（即无争议）数值取平均值，得到每只小鼠的平均值，用于统计分析。若某只小鼠的某一吞咽参数获得的有效测量值少于3次，则在统计数据库中对应参数处输入缺失值（即非零值）。

吞咽参数描述
吞咽间期（ISI）两次连续且无中断的吞咽之间所间隔的视频帧数。计算吞咽间隔时间（ISI）的起始帧是食团从会厌谷转移至食管之前最后一个可见的“静止帧”，结束帧为下一次吞咽的“静止帧”。将两次连续吞咽之间的帧数除以每秒30帧（fps），即可转换为时间（秒）。
下颌运动速率（舔舐速率当量）在吞咽造影检查（VFSS）过程中，舌部无法清晰显示，因此无法对舔舐频率进行量化；然而，下颌运动频率则易于量化。在舔舐过程中，下颌必须张开以使舌头伸出出口腔。因此，饮水时每秒（30帧）下颌开合（运动）周期的次数即等同于舔舐频率。每个下颌运动周期始于下颌完全张开（此时与舌头伸出同步），结束于下颌再次完全张开。随后的下颌闭合与重新张开的周期被计为独立的下颌运动事件。
下颌运动距离下颌在下颌运动周期中张开的距离，以 mm 为单位测量上颌与下颌切牙之间的距离。
舔咽比率每次ISI期间发生的下颌运动周期次数即， 两次连续且无中断的吞咽之间）
吞咽速率每次在喷口处连续2秒饮水期间发生的吞咽次数。
咽部通过时间（PTT）食团通过咽部被吞咽所需的时间。起始帧与ISI的起始帧相同（即， 食团从会厌谷开始可见转移前的“静止帧”。结束帧为食团尾端完全通过2nd 颈椎（C2），这是小鼠颈椎中最明显的解剖学标志。起始帧与结束帧之间的帧数除以30 fps，再转换为毫秒（msec）。 
食团通过咽部的速度咽部食团速度相对于PTT（如上所述）进行测量。使用ImageJ软件，测量会厌谷至C2椎体的距离（mm），并利用校准标记进行标定。将该距离（mm）除以PTT（msec），以计算食团速度（mm/msec）。
食管通过时间（ETT）ETT 起始帧与 PTT 结束帧相同（如上所述）。ETT 结束帧是指食团完全进入胃内，定义为食团从食管中消失的帧。ETT 起始帧与结束帧之间的帧数除以 30 fps 后，转换为毫秒（msec）。
食团通过食管的速度食管团块速度相对于ETT（如上所述）进行测量。使用ImageJ软件，测量从C2椎体到胃食管连接处的距离（mm），并通过校准标记进行比例缩放。然后将该距离（mm）除以ETT（msec），以确定团块速度（mm/msec）。
食团通过咽部和食管的速度 该参数用于C2不易作为明显解剖标志的情况，因此无法区分吞咽的咽期和食管期。在此类情况下，食团通过咽部和喉部的速度被合并为一个单一的吞咽参数。起始帧与PTT的起始帧相同（即， 食团从会厌谷开始可见转移前的“静止帧”）。终止帧与ETT终止帧相同。即， 当食团完全进入胃部时）。这两个事件之间的帧数除以 30 fps，转换为毫秒。
团注区域使用 ImageJ 软件，在咽部吞咽启动前的会厌谷“静止帧”中测量团块面积，并利用校准标记进行标定。
咽部残留面积使用校准标记进行标定后，通过 ImageJ 软件测量咽部残留面积。
液体消耗量从吸管瓶中消耗的液体体积由于瓶嘴漏液而难以估算。然而，可更准确地计算从 peg-bowl 中消耗的液体体积，方法如下：1）确定密度（即， 重量与体积之比）已注入钉碗中的校准液体体积，2）测定含有残留液体的钉碗的重量，3）将这些数值输入重量与体积转换器（例如， http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php.

表2：小鼠VFSS期间可量化的吞咽参数。

结果

我们成功设计了一种新颖且可重复的小鼠特异性VFSS方案，该方案包括允许自主进食的测试舱、口服造影剂的调味配方，以及可对吞咽生理学参数进行定量分析的逐步测试流程。荧光成像系统的能量水平决定了可在小鼠中检测的吞咽参数。我们最初使用了专为人类及较大动物设计的高能量荧光成像设备（例如， GE Advantx、GE OEC 9600 和 Omega Cardiac Cath CS-25（均为每秒30帧）。然而，这些系统在测试小鼠时放大能力不足，导致动物仅占据视场的一小部分 (图9）。结果，图像质量极差，导致无法观察吞咽机制的大部分结构。尽管存在这一局限性，我们仍确定了7项在使用常规（即， 高能量荧光透视仪结合新型小鼠VFSS方案（表3）。此外，我们确定会厌谷空间为健康成年小鼠（3-17月龄）以及老龄病理性小鼠的吞咽解剖触发点（>18个月）和ALS晚期。

啮齿类动物吞咽的透视成像；放射影像；食管检查；医学研究。
图9：高能透视成像系统。 左图：使用高能（即 传统）透视成像系统获得的小鼠代表性图像。请注意，小鼠仅占据透视成像视野的一小部分，表明传统透视设备在啮齿类动物成像中放大能力不足。右图：通过视频编辑软件在采集后进行放大处理的同一图像。黑箭头：吞咽触发点（会厌谷）。白箭头：食管远端的食团，即将通过胃食管连接部（白色星号标记）。请点击此处查看该图的放大版本。

吞咽参数高能量系统低能量系统
吞咽间期 (ISI)XX
下颌运动速率（等效于舔舐速率）XX
下颌运动距离XX
舔舐-吞咽比XX
吞咽速率XX
咽部通过时间 (PTT)X
食团在咽部的移动速度X
食管通过时间 (ETT)X
食团在食管中的移动速度X
食团在咽部和食管中的移动速度XX
食团截面积X
咽部残留面积X
摄入液体体积XX

表3：使用高能量与低能量透视系统可量化的吞咽参数。

我们最近获得了一套名为 LabScope 的低能量放大荧光透视系统（Glenbrook Technologies，美国新泽西州兰道夫），该系统专为本实验室设计，适用于小鼠及其他小型啮齿类动物图10）。然而，该系统的显著更高的放大倍数使得无法在一个视野内完整观察小鼠的整个吞咽过程。因此，需要采用两个测试位置，如图所示 图11体位1可显示整个头部及近端胸腔区域，用于评估吞咽的口腔期和咽部期。体位2可显示从吞咽触发点开始的区域即， 会厌谷）至胃食管（GE）连接处。该位置对于评估吞咽的食管阶段至关重要。结合新型小鼠VFSS方案使用LabScope的初步工作已确定了13项可在小鼠中稳定量化的客观吞咽参数，这一数量几乎是使用高能量（即， 常规荧光透视仪（表3）。这一结果归因于LabScope先进的放大功能，该功能可实现对多种解剖结构的可视化观察图12在使用传统系统时几乎无法观察到的现象： 例如， 舌骨、气管和颈椎。因此，我们还能够分析视频中是否存在喉部渗透和误吸的证据。在本研究中，无论小鼠的健康或疾病状态如何，均未观察到任何渗透或误吸现象。

使用剪刀式升降台进行观察的X射线成像装置，包含相机和射线源。
图10：LabScope装置。 左图：LabScope可作为小型动物的台式透视仪使用。右图：LabScope的组件标注特写图。剪刀式升降台正在将观察室调整至透视仪的视野范围内。 请点击此处查看该图的高清版本。

X射线比较，动物颌位；放射学分析，骨骼结构，兽医学研究。
图11: 低能量透视成像系统。 使用低能量透视成像系统获取的小鼠图像。请注意，高倍放大能力导致无法在透视视野内完整显示整个吞咽过程。左图：位置1——可显示整个头部及近端胸腔区域，吞咽触发点（黑箭头）基本位于视野中心。右图：位置2——可显示从吞咽触发点（黑箭头）至胃食管连接部（白星号）的结构，注意食团正通过远端食管（白箭头）。请点击此处查看该图的高清版本。

鸟类头骨解剖结构的X射线图像，突出显示下颌骨和舌骨的方向。
图12：使用低能量透视系统可观察到的解剖结构。 即使在最低放大倍数下（左侧），利用我们的低能量透视系统（i.e., The LabScope），小鼠头部和颈部的骨性结构也清晰可见。黑色方框内的解剖结构在右侧以更高放大倍数显示并标注。对骨性结构的更佳可视化使得能够量化多种此前无法通过高能量透视设备分析的吞咽参数。请点击此处查看该图的高清版本。

吞咽频率和吞咽间期是代表性的VFSS参数，可使用低能量或高能量透视系统结合新建立的小鼠VFSS方案进行量化。本研究对三组小鼠的这两个吞咽参数进行了量化：SOD1-G93A（SOD1）转基因小鼠（即肌萎缩侧索硬化ALS模型）在4-5月龄疾病终末期、18-24月龄的衰老C57小鼠，以及健康年轻C57小鼠（4-8月龄）和来自SOD1品系的非转基因同窝对照小鼠组成的对照组。所有数据均仅针对饮水管饮水行为，使用低能量或高能量透视系统采集。在年轻C57小鼠与来自SOD1品系的年轻非转基因（对照）小鼠之间，上述两项吞咽参数未发现显著差异；因此，将这两组数据合并为一个总体的“对照”组，用于与衰老C57小鼠和终末期SOD1小鼠进行比较。SOD1小鼠的吞咽频率（即连续2秒不间断饮水期间的吞咽次数）显著慢于衰老C57小鼠和对照组小鼠。各组之间的吞咽间期（即两次连续吞咽之间的时间间隔）无显著差异。这些结果支持以下观点：不同疾病状态下吞咽困难的特征可能存在明显差异（图13）。

比较吞咽速率和吞咽间期的柱状图；对照组、SOD1组、老龄C57组。
图13：初步研究结果。 本图展示了使用小鼠VFSS方案定量分析的两项VFSS吞咽参数的代表性初步结果：吞咽速率（左图）和吞咽间期（右图）。SOD1小鼠的吞咽速率显著慢于老龄C57小鼠和对照组小鼠。在吞咽间期方面，各组之间未发现显著差异。柱状图顶部的连线表示组间具有统计学显著性差异（p < 0.05），该差异通过Bonferroni成对比较法确定。误差线表示±1个标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前有数百种小鼠（小鼠和大鼠）疾病模型可商业化获得，用于研究人类疾病。然而，针对吞咽困难（dysphagia）进行专门研究的啮齿类动物疾病模型仅有三种：肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型13,14，以及帕金森病12,15-17和脑卒中18的大鼠模型。这些初步研究各自采用了不同的方法来评估吞咽困难，导致无法在不同物种和疾病之间进行有意义的比较。这一主要局限性在未来的研究中可能通过采用新开发的啮齿类动物视频透视吞咽检查（VFSS）方案得以克服，该方案可在自主进食的动物中对多种吞咽参数进行客观量化。

成功的VFSS结果依赖于三个关键要素：1）测试腔室，允许动物在受限空间内站立且不受约束地自主进食；2）能够掩盖商用口服对比剂不良味道/气味的配方；3）可逐步执行的测试方案，用于量化吞咽生理参数。这三者共同作用，营造出舒适、低应激、自主进食的检查环境，从而诱发典型的摄食和吞咽行为。若缺失其中任一或多个要素，将对研究结果产生不利影响。可能出现的负面结果包括：无法使动物保持在透视成像视野内、出现干扰饮水的异常行为、对口服对比剂产生厌恶反应，以及因饮水次数不足而无法量化吞咽参数。

在获得理想的VFSS结果过程中，一个主要挑战是设计一个合适的测试腔室。经过对原型设计的多次修改，最终确定了一种观察腔室，该腔室能够充分使小鼠保持在视野范围内，并防止干扰饮水行为的动作。这些腔室采用铣床加工制成，以确保管体和端盖具有统一的尺寸，从而保证相同直径的多个观察腔室之间组件的可互换性。腔室内径（直径和长度）略大于成年小鼠的身体尺寸，形成狭窄的测试空间，既允许小鼠沿直线行走和转身，又对其活动形成适度限制。这种狭窄结构，结合仅在末端设置饮水嘴和插针式食碗的合理布局，可在小鼠饮水时使其头部和身体始终沿腔室长轴方向保持对齐。一旦开始饮水，小鼠会在饮水嘴或食碗处保持异常稳定的自我固定状态，每次持续数秒，从而极大减少了干扰检测的运动伪影。因此，可以在小鼠饮水过程中，从侧位和背腹位方向实现无明显形变的近距离观察、视频录制以及视频荧光成像。

小鼠（及其他小型啮齿类动物）天性倾向于在狭小空间中寻找庇护。因此，当测试装置（一端已由端帽封闭）被放置于动物的饲养笼中时，它们会自然地进入测试腔室，从而避免了因抓取和操作所引起的压力或焦虑即， 手动将动物放入腔室）。当小鼠进入腔室后，另一端通过连接一个2nd 封端设计。该设计可防止小鼠逃逸，同时营造低焦虑的测试环境，供小鼠自由探索。

该装置的方形结构提供了内置的运动稳定性，可独立使用，从而无需在标准啮齿类动物笼具内进行测试。整个装置重量轻、便于携带、可堆叠存放、结构坚固、易于清洁，并可进行高压灭菌。尽管这些舱室最初是为与透视设备配合使用而设计的，但它们同样兼容点片摄影、神经影像学（例如 MRI、PET、CT）以及对多种行为的直接观察或视频记录。

克服的第二个主要挑战是掩盖口服对比剂的不良味道/气味即， 硫酸钡和碘海醇）。鉴于不同小鼠品系的味觉敏感性存在广泛差异19-21 以及可能随着年龄增长22,23，有必要确定一种对所有小鼠（无论品系和年龄）均适口的单一测试溶液。这一结果对于在不同品系和年龄间直接比较吞咽功能/功能障碍至关重要，同时可消除因流变学差异导致的混杂结果例如， 黏度，密度 等等。）以及测试溶液的化学特性。为此，我们开发了一种简单、快速的适口性筛选方法，用于在小鼠吞咽功能检查（VFSS）过程中识别出可有效掩盖口服对比剂不良味道/气味的首选风味增强剂。该方法借鉴了短时暴露试验的设计，需使用舔舐计数仪（lickometer）即， 舔舐传感器）以记录在限水期后最初2分钟内的舔舐频率（即， 过夜禁水以诱导口渴24,25本研究未使用舔水测量仪；因此，通过行为观察以及本实验室先前已验证的标准视频记录方法来评估舔水频率以判断偏好性。13,14采用这种适口性筛选方法，发现巧克力是C57和C57/SJL品系小鼠偏好的风味增强剂。具体而言，每笼中100%的小鼠在接触后30秒内即开始饮用巧克力风味溶液，且多只小鼠可同时在饮水口饮水。然而，无论钡剂或巧克力的浓度如何，添加钡剂后大多数小鼠仅出现短暂的饮水行为。

钡剂的一种替代物是碘海醇，这是一种基于碘的造影剂，直到最近才被认识到可作为硫酸钡用于人类视频透视吞咽检查（VFSS）的合适替代品10；因此，其在该用途上的应用尚未标准化。研究人员向小鼠提供了多种不同浓度的巧克力味碘海醇溶液。大多数小鼠在经过一夜的饮水控制后， readily 饮用了含有最高达50%原液碘海醇（每毫升含350毫克碘）的配方。更高浓度则引发回避行为。50%碘海醇（每毫升含350毫克碘）溶液在小鼠吞咽过程中提供了足够的放射密度，而较低浓度则显影明显不足，影响吞咽生理学的定量分析。因此，针对小鼠VFSS的最佳测试溶液被确定为添加巧克力风味的50%碘海醇溶液。重复的适口性测试未引起回避行为或不良事件。

第三个需要克服的挑战是防止小鼠在饮水时转动或倾斜头部，这会遮挡吞咽机制在VFSS过程中的可视化。通过在观察室一端靠近地面的位置设置一个带钉碗（peg-bowl）来饮水，可解决这一问题。使用带钉碗相比使用吸管瓶具有多个额外优势。例如，可通过观察管端盖上的通气孔，将已知体积的液体用移液器精确加入带钉碗中。该方法可对VFSS短暂测试期间消耗的微量测试溶液进行定量分析。此外，与吸管口较小的开口相比，带钉碗中测试溶液具有更大的表面积，可能提供更强的嗅觉刺激，进一步促进小鼠饮水。带钉碗可能更适用于研究幼龄或体型较小的小鼠品系，因为碗的高度与地面之间的距离是标准化的。相比之下，吸管的长度需根据小鼠体型进行调整，这会引入另一个潜在的混杂变量。此外，神经系统疾病小鼠模型可能因肢体运动功能障碍而难以触及吸管瓶，但它们可以轻松够到带钉碗。患有舌和/或下颌功能障碍的小鼠可能无法充分按压吸嘴中的钢珠以获取液体，而使用带钉碗可消除这一干扰因素。基于上述原因，在小鼠VFSS测试中，优先选择带钉碗而非吸管瓶作为饮水方式。然而，观察室的设计也可根据需要适配吸嘴饮水。需要注意的一个重要问题是，已知吸嘴饮水与碗饮水的舔舐频率存在差异13,26。因此，在同一实验内及不同实验之间，必须保持VFSS测试中吸嘴或带钉碗选择的一致性。

第四个挑战是确定可用于小鼠的可量化吞咽参数，这些参数需与人类研究和临床实践中常用的VFSS参数具有可比性。我们的初步研究结果表明，所使用的透视系统类型决定了可在小鼠中检测的吞咽参数范围。大多数研究中心和医疗机构配备的是高能量（75–95 kV，1–5 mA）透视设备，专为人类和较大型动物设计，而在检测小鼠及其他小型动物时，图像质量极差。例如，最近一项使用高能量透视设备对大鼠进行的研究仅能识别出4个可量化的吞咽参数12；而在本研究中，我们仅能为小鼠识别出7个吞咽参数。为了克服这一主要限制，我们近期获得了一种名为The LabScope（Glenbrook Technologies）的低能量透视系统。该系统是一种微型透视装置，可产生连续的锥形X射线束，光子能量范围为15至40 kV，峰值管电流为0.2 mA（最大功率8 W）。由于该系统的较低能量更易被小鼠纤薄的骨骼和软组织吸收，因此相比传统的（即高能量）透视系统，可提供更高的对比度分辨率。The LabScope的X射线束投射至一个直径为5 cm的影像增强器上，明显小于传统透视系统所用的15–57 cm直径的影像增强器。The LabScope的最小焦点到增强器距离（SID）约为6 cm（相比之下，传统透视系统的SID约为30 cm），从而提供了更强的放大能力。此外，The LabScope采用专利技术，可在不改变SID的情况下实时将图像数字放大高达40倍。其效果本质上相当于一台X射线显微镜，可实时缩放，以观察小鼠吞咽机制等微小感兴趣区域。

这种低能量透视系统的显著优势在于提高了辐射安全性。除了实验动物接受的辐射剂量更低之外，使用该系统的科研人员所受到的散射辐射也显著减少。在设备前方控制面板处的辐射暴露为10.3 mR/hr。在设备前方1米距离处，辐射暴露降至580 µR/hr。房间内大多数其他位置的辐射暴露极低，低于10 µR/hr。尽管已有上述改进，我们仍采取了额外措施以进一步提升辐射安全性。例如，在The LabScope周围增加了含铅丙烯酸屏蔽装置，用于阻挡散射的X射线光子，从而使研究人员在进行小鼠VFSS检测时无需穿戴个人防护装备（例如铅围裙、甲状腺护具和防护眼镜）。此外，透明丙烯酸材料允许研究人员从远处观察小鼠。进一步的辐射安全保护由电动剪刀式升降台提供，该升降台由研究人员远程控制。在距离透视设备最远3米的位置，研究人员可通过遥控装置调节观察室在X射线束中的垂直和水平位置。因此，可在小鼠于观察室内自由活动的同时，持续将目标解剖区域保持在透视视野范围内。尽管该剪刀式升降台是为配合The LabScope使用而设计，但它也可与传统透视设备兼容，以提高研究人员的辐射安全性。在小鼠VFSS过程中进一步提升辐射安全性的最后一步是采用注射器液体输送系统。该系统包含一段3-4英尺（如有需要也可更长）的PE导管，可实现从远处快速高效地将液体注入 peg-bowl 中。这种注射器液体输送系统结合观察室，也可用于传统透视设备。

使用LabScope结合新型小鼠VFSS方案的初步工作表明，相较于传统系统，其主要优势在于可可靠量化吞咽参数的数量几乎增加了一倍。然而，吞咽机制的软组织结构（例如， 小鼠的舌、软腭、咽后壁和会厌在使用低能或高能透视系统时不易清晰观察。因此，我们重点量化食团流动的相关参数，而非吞咽的生物力学机制。我们主要关注那些能够基于时间、面积、距离和体积等单位进行量化的参数。 等等。，而不是采用李克特量表类的测量方法。在人类吞咽造影检查（VFSS）文献中，已有多种符合该要求的团注流参数被描述，例如口腔通过时间27-29咽部通过时间27-33，以及食管通过时间34-36，仅举几例而言。在小鼠中，食团经口腔的传输过程并不明显，这可能是由于自发饮水时食团体积较小所致。然而，我们能够可靠地量化咽部和食管的通过时间，以及与食团流动和清除相关的其他多个指标。随着我们进一步优化 The LabScope 的功能，预计将识别出更多具有转化意义的吞咽参数。

本研究结果显示，小鼠在自主饮水过程中每次吞咽前会进行多次节律性舔舐，每个小的液体团块依次充满会厌谷空间，随后触发咽部吞咽。这种行为在以舔舐为主要液体摄入方式的哺乳动物中较为典型37-40，类似于人类婴儿吞咽及其他所有哺乳动物幼崽的节律性吸吮-吞咽模式。婴儿吞咽生理特征表现为多次节律性吸吮后伴随一次反射性咽部吞咽，通常被称为吸吮-吞咽周期37,41-43。因此，小鼠摄食性舔舐行为中涉及的节律性舌部和下颌运动，可能更接近于人类婴儿的摄食性吸吮行为，而非儿童和成人用杯子饮水的行为。因此，我们正在定量分析小鼠的舔舐频率和舔舐-吞咽比，以便将来与人类婴儿的吸吮频率及吸吮-吞咽比进行比较。或许，小鼠的VFSS研究将有助于深入了解发育性吞咽障碍。

与任何新的研究方法一样，该方法也存在需要改进之处。例如，小鼠VFSS方案仅使用了C57和C57/SJL两个小鼠品系开发，尚未在大鼠中进行测试。为适应大鼠更大的体型，观察室的尺寸（直径和长度）需要相应放大。此外，巧克力味的碘海醇是否适合作为通用的小鼠VFSS测试溶液仍有待明确。因此，有必要在多种小鼠和大鼠品系中开展更大规模的测试。同时，不应排除使用钡剂作为小鼠VFSS对比剂的可能性。尽管小鼠明显更偏好碘海醇配方而非钡剂，但若能更严格、系统地掩盖钡剂令人厌恶的味道或气味，或许可提供可接受的替代方案。未来开展比较碘海醇与硫酸钡（以及其他潜在口服对比剂）在小鼠和大鼠中对味觉偏好及吞咽生理影响的研究，无疑将提供与人类VFSS直接相关且具有转化价值的重要信息。

人类的VFSS检查包含多种食物质地和液体，而吞咽障碍在吞咽稀薄液体和干燥固体食物时表现最为明显44,45。因此，小鼠VFSS方案正在扩展，以纳入更多不同质地的测试物质，从而有助于在疾病模型中检测和量化吞咽障碍。此外，还需对小鼠VFSS所用液体配方进行黏度测试，以便将其黏度调整至与人类VFSS中使用的标准一致。解决这些局限性将有助于识别可在小鼠、大鼠与人类之间直接比较的、具有转化应用价值的VFSS吞咽障碍生物标志物。

通过将射线不透性标记物植入吞咽机制的软组织结构中（这些结构原本不可见），可以显著提高小鼠VFSS的应用价值，从而允许对吞咽的生物力学进行研究。多年来，该方法已成功用于研究仔猪吞咽生物力学，采用多种金属夹和金属丝37,42。我们预计，在小鼠中使用类似但更小的标记物，将能够量化更多额外的吞咽参数，以便与包括人类在内的较大哺乳动物进行比较。目前，我们正在开发将射线不透性标记物植入小鼠舌、软腭、咽、喉及近端食管的方法，以验证这一假设。

LabScope 和传统荧光透视系统的视频录制帧率受限于每秒 30 帧（fps）。然而，我们的初步结果显示，健康小鼠吞咽的咽期全过程持续时间少于 66 毫秒（即 2 帧），约为人类吞咽速度的 10 倍。因此，小鼠吞咽的咽期发生得极为迅速，使用 30 fps 的摄像机无法清晰观察其细节。为了充分可视化并量化小鼠及其他啮齿类动物吞咽咽期极其快速且复杂的运动过程，需要更高的帧率（可能需>100 fps）。结合更高帧率，若进一步引入双平面技术以实现三维荧光成像，必将显著提升小鼠视频荧光吞咽检查（VFSS）的应用价值。因此，未来的设计改进应考虑采用更高帧率的摄像系统以及双平面成像功能。

最后，已有研究表明，低剂量辐射可导致雌性 C57 小鼠不育，引起卵巢刺激激素水平的改变，这可能干扰寿命研究46。与 VFSS 检测相关的重复低剂量辐射暴露对小鼠、其他动物或人类的具体影响尚未得到研究。然而，人类女性的卵巢功能障碍（与辐射暴露无关）已被证实与胃肠道动力障碍相关，在某些情况下尤其与吞咽困难相关47，这为未来包含雌性个体（动物及人类）的 VFSS 研究设计提供了另一个需要考虑的警示因素。应避免排除雌性个体，因为在人类中已报道存在显著的性别差异吞咽功能48,49，这些差异在动物疾病模型中同样需要被检测和表征。因此，针对雄性和雌性小鼠及大鼠开展的纵向 VFSS 研究结果，对于人类吞咽困难的转化研究以及重复 VFSS 检测相关的低剂量辐射暴露风险均具有巨大的转化潜力。

披露

本文的开放获取由Glenbrook赞助。

致谢

我们衷心感谢Lever实验室的其他成员在数据收集（Andries Ferreira、Danarae Aleman、Alexis Mok、Kaitlin Flynn、Elizabeth Bearce和Matan Kadosh）以及手稿审阅（Andries Ferreira、Rebecca Schneider和Kate Robbins）方面所做的贡献。我们还感谢密苏里大学物理机械加工车间的Roderic Schlotzhauer和Edwin Honse，他们在本研究中使用的啮齿类动物观察管的设计与制作方面提供了支持。我们特别感谢密苏里大学兽医学院兽医医学与外科系放射科主管Malea Jan Kunkel以及密苏里大学医学院研究动物导管实验室经理Jan Ivey，在我们建立小鼠VFSS方案期间，他们在操作高能透视设备时始终表现出极大的耐心与支持。本研究的资助来源包括：NIH/NIDCD（TE Lever）、NIH/NINDS（GK Pavlath）、耳鼻喉—头颈外科启动资金（TE Lever）、密苏里大学PRIME基金（TE Lever）、Mizzou Advantage（TE Lever）以及密苏里大学老龄化研究中心（TE Lever）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于观察室的聚碳酸酯管McMaster-Carr3161T41观察管主体，2"X2" 直径，0.080" 厚壁
聚碳酸酯板  用于观察室McMaster-Carr9115K71观察管端盖，2 个"x12"x3/4"
聚碳酸酯板  用于观察室McMaster-Carr8574K281用于观察管的 peg-bowls
硅胶O型圈  用于观察室端盖McMaster-Carr9396K108S1138 AS568-029，25 个装
http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r 
用于观察室的硅胶塞McMaster-Carr2903K22用于固定喂食碗时堵住观察室顶部椭圆形开口的10个塞子套装
http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
用于吸管瓶的离心管Evergreen Scientific222-3530-G8030 ml 独立式离心管，带盖，无菌
https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ 
用于吸管瓶的硅胶瓶塞圣戈班高性能塑料DX263031-10 编号31D，尺寸：底部26 mm，顶部32 mm，高度30 mm；10个装 
http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&&PageBrand=STOPPERS
用于吸管瓶的塞子钻孔器Thomas Scientific3276G40直径范围为 3/16–15/16 英寸的打孔器套装 
http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
饮水管瓶的吸管AncareTD-100 2 1/2” 长饮水管，直径5/16” 开口，直管球形喷口
http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point 
用于配制口服对比剂溶液的碘海醇GE Healthcare每毫升含350毫克碘
http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque 
用于调味口服造影剂的巧克力糖浆赫希斯
用于注射器输送系统的10 ml注射器Becton, Dickinson and Company309604带鲁尔锁头的无针注射器，每盒100支
http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
用于注射器输送系统的导管管路Becton, Dickinson and Company427451聚乙烯管（非无菌）（PE 240）100'
http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp 
注射器输送系统的针头Becton, Dickinson and Company42756015号针头，可插入PE 240导管管路
http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp 
用于注射器输送系统的聚甲醛乙缩醛树脂棒McMaster-Carr8576K151/2英寸直径，黑色
http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf 
剪刀式升降台用丙烯酸板Ponoko激光切割
http://www.ponoko.com 
3D打印的ABS框架密苏里大学快速原型制作中心
剪刀式升降台用黄铜杆亚马逊TTRB-03-12-03制成轴
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