闭环协议在现代电生理学中正日益普及。我们介绍一种简单、通用且成本低廉的方法，用于在皮层锥体神经元中执行复杂的电生理学实验方案 体外使用台式计算机和数字采集板。
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本文内容
摘要
摘要
实验神经科学正日益关注新型且通常较为复杂的闭环实验方案的开发与应用，其中施加的刺激会根据系统响应实时调整。近年来的应用包括：为研究小鼠1和斑马鱼2的运动反应而构建的虚拟现实系统，以及利用光遗传学技术控制皮层中风后癫痫发作3。闭环技术的一个关键优势在于能够探测那些无法直接获取或依赖于多个变量的高维特性，例如神经元兴奋性4和响应可靠性，同时还能最大化实验通量。在本研究中，结合细胞电生理学背景，我们描述了如何将多种闭环协议应用于锥体皮层神经元响应特性的研究，这些神经元来自幼年大鼠体感皮层的急性脑片，通过膜片钳技术进行细胞内记录。由于目前尚无任何商业或开源软件能够完全满足高效执行此类实验所需的所有功能，因此我们开发了一套名为LCG5的新软件工具箱，其模块化结构可最大化代码复用性，并有助于实现新型实验范式。刺激波形通过紧凑的元描述方式定义，完整的实验协议则以基于文本的配置文件进行描述。此外，LCG还提供命令行接口，适用于试验的重复执行及实验协议的自动化操作。
引言
近年来，细胞电生理学已从传统的电压钳和电流钳实验中所采用的开环模式，发展为现代的闭环实验方案。其中最为人熟知的闭环技术或许是动态钳6,7，从而实现了人工电压门控离子通道的合成注入，以测定神经元膜电位8非确定性闪烁对神经元反应动力学中离子通道影响的深入研究9，以及重建 体外 逼真的 在体内-类似于突触背景活动10.
其他已提出的闭环范式包括反应性钳制11，用于研究 体外 自持性持续活动的产生，以及响应钳制4,12，以研究神经元兴奋性背后的细胞机制。
本文介绍了一种强大的框架，可在急性脑片全细胞膜片钳记录的背景下，实现多种闭环电生理方案的应用。我们展示了如何通过膜片钳记录技术获取幼年大鼠体感皮层锥体神经元的胞体膜电位，并利用LCG——一种基于命令行的软件工具箱（由理论神经生物学与神经工程实验室开发）——实施三种不同的闭环实验方案。
简而言之，所述方案首先 自动注入一系列用于表征细胞多种主动与被动膜特性的电流钳刺激波形。这些波形可用于捕捉细胞在标准化刺激波形序列下的反应特性，从而反映其电生理表型。该方法被称为 e-code 细胞的例如，参见&#....
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方案
本方案符合安特卫普大学生物医学科学系伦理委员会的建议和指南。本方案需要使用经批准的人道安乐死技术获得的幼年Wistar大鼠的切除脑组织来制备无感知能力的材料。
1. 仪器准备
- 安装并配置数据采集与刺激系统。
- 使用配备有支持 Comedi 的数据采集（DAQ）卡的个人计算机（PC），记录信号并向电生理放大器发送模拟控制电压。
注意：Comedi 是一个 Linux 模块和库，支持来自最常见制造商的多种数据采集（DAQ）卡：更多信息请访问 http://www.comedi.org。 - 如果使用计算机控制的膜片钳放大器，请额外配备一台独立于放大器控制计算机的PC。
注意：尽管后者可能运行常规操作系统，但额外的计算机将通过特殊操作系统实现实时运行。在此条件下，可将显示器、鼠标和键盘直接连接至该额外计算机，同时通过远程桌面应用程序连接至专用计算机，从而便于操作。 - 从包含预装 LCG 的实时 Linux 操作系统的 Live CD 的 ISO 镜像下载 http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso，然后将其刻录到空白CD或U盘上。
- 将CD插入装有DAQ卡的PC驱动器中并启动即可。或者，从在线源代码仓库将LCG安装到运行Linux操作系统的PC上（例如， Debian....
- 使用配备有支持 Comedi 的数据采集（DAQ）卡的个人计算机（PC），记录信号并向电生理放大器发送模拟控制电压。
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结果
在前面的章节中，我们描述了如何使用软件工具箱 LCG 来表征 L5 锥体细胞的电生理特性，并在脑片制备中重现类似 in vivo 的突触活动。采用命令行界面和半自动化实验方案有利于提高实验的可重复性和效率，从而显著影响所产生数据的数量和质量。此外，由于数据以一致的方式保存，因此很容易将分析扩展到特定的研究目标。图1展示了一项典型实验结果，该实验使用六种不同的方案对一个细胞的基本电生理特性进行了表征。
动作电位波形和阈值的测量（图 1A）：注入短暂而强的去极化电流脉冲，以测量平均动作电位波形。动作电位的第三导数的第一个峰值被计算为放电阈值24。电压-电流曲线的测量（图 1B）：向细胞注入阈下电流脉冲，可用于测量被动反应特性（如输入电阻），并表征阈下离子电流。
测量引发持续放电所需的最小电流（图 1C）。注入的电流 ramp 可用于将细胞表征为 I 型或 I.......
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讨论
本文描述了一种利用膜片钳技术和一种新开发的名为LCG的软件工具箱，实施实时闭环单细胞电生理实验的完整方案。为了优化记录质量，确保记录装置正确接地、屏蔽并避免振动至关重要：这可以保证对细胞的稳定且持久的全细胞记录，结合刺激方案中多个部分的自动化可能性，能够最大化实验的通量。
本文展示了LCG可应用的两个案例，即根据细胞的电生理特性对其进行表征（图 1），包括快速计算神经元的主动输入-输出关系，以及在脑片中重现类似体内（in vivo）的活动状态（图 2）。这些应用展示了如何构建不同的实验方案，并突出了LCG的一些显著特性：其命令行界面适合脚本化操作，从而实现一系列实验方案的自动化执行。此外，如图 1所示，从前一个实验方案中提取的数值可用于调整后续实验方案的参数。
可以实时监测被分析细胞反应的高级特征例如，其瞬时发放率，如图所示 图1D
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
谨此致谢以下机构提供的经费支持：弗拉芒研究基金会 FWO（合同编号 12C9112N，授予 DL）、欧盟委员会第七框架计划（玛丽·居里网络“C7”，合同编号 238214；信息与通信技术未来新兴技术“ENLIGHTENMENT”项目，合同编号 306502）、比利时科学政策办公室发起的大学间引力项目计划（合同编号 IUAP-VII/20）以及安特卫普大学。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织切片机 | Leica | VT-1000S | |
| 玻璃微电极拉制仪 | Sutter | P-97 | |
| 微电极 | WPI | 1B150F-4 | 外径/内径 1.5/0.84 mm，带纤维 |
| 振动隔离台 | TMC | 20 系列 | |
| 显微镜 | Leica | DMLFS | 40X 浸液物镜 |
| 显微操作器 | Scientifica | PatchStar | |
| 放大器 | Axon Instruments | MultiClamp 700B | 计算机控制 |
| 数据采集卡 | National Instruments | PCI-6229 | 由 Comedi Linux 驱动程序支持 |
| 台式计算机 | Dell | Optiplex 7010 Tower | 操作系统：实时 Linux |
| 示波器 | Tektronix | TDS-1002 | |
| 灌流泵 | Gibson | MINIPULS3 | 配合 R4 泵头（F117606）使用 |
| 温度控制器 | Multichannel Systems | TC02 | PH01 灌流套管 |
| 压力计 | Testo | 510 | 可选 |
| 培养箱 | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| 葡萄糖 | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-葡萄糖酸盐 | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-磷酸肌酸 | Sigma | P7936 | ICS |
参考文献
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebraf....
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重印与许可
