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方法文章

实时电生理学：利用闭环协议探究神经元动态及其更广泛应用

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DOI：

10.3791/52320

⸱

2015年6月24日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Antwerp

本文内容

摘要

闭环协议在现代电生理学中正日益普及。我们介绍一种简单、通用且成本低廉的方法，用于在皮层锥体神经元中执行复杂的电生理学实验方案 体外使用台式计算机和数字采集板。

摘要

实验神经科学正日益关注新型且通常较为复杂的闭环实验方案的开发与应用，其中施加的刺激会根据系统响应实时调整。近年来的应用包括：为研究小鼠1和斑马鱼2的运动反应而构建的虚拟现实系统，以及利用光遗传学技术控制皮层中风后癫痫发作3。闭环技术的一个关键优势在于能够探测那些无法直接获取或依赖于多个变量的高维特性，例如神经元兴奋性4和响应可靠性，同时还能最大化实验通量。在本研究中，结合细胞电生理学背景，我们描述了如何将多种闭环协议应用于锥体皮层神经元响应特性的研究，这些神经元来自幼年大鼠体感皮层的急性脑片，通过膜片钳技术进行细胞内记录。由于目前尚无任何商业或开源软件能够完全满足高效执行此类实验所需的所有功能，因此我们开发了一套名为LCG5的新软件工具箱，其模块化结构可最大化代码复用性，并有助于实现新型实验范式。刺激波形通过紧凑的元描述方式定义，完整的实验协议则以基于文本的配置文件进行描述。此外，LCG还提供命令行接口，适用于试验的重复执行及实验协议的自动化操作。

引言

近年来，细胞电生理学已从传统的电压钳和电流钳实验中所采用的开环模式，发展为现代的闭环实验方案。其中最为人熟知的闭环技术或许是动态钳6,7，从而实现了人工电压门控离子通道的合成注入，以测定神经元膜电位8非确定性闪烁对神经元反应动力学中离子通道影响的深入研究9，以及重建 体外 逼真的 在体内-类似于突触背景活动10.

其他已提出的闭环范式包括反应性钳制11，用于研究 体外 自持性持续活动的产生，以及响应钳制4,12，以研究神经元兴奋性背后的细胞机制。

本文介绍了一种强大的框架，可在急性脑片全细胞膜片钳记录的背景下，实现多种闭环电生理方案的应用。我们展示了如何通过膜片钳记录技术获取幼年大鼠体感皮层锥体神经元的胞体膜电位，并利用LCG——一种基于命令行的软件工具箱（由理论神经生物学与神经工程实验室开发）——实施三种不同的闭环实验方案。

简而言之，所述方案首先 自动注入一系列用于表征细胞多种主动与被动膜特性的电流钳刺激波形。这些波形可用于捕捉细胞在标准化刺激波形序列下的反应特性，从而反映其电生理表型。该方法被称为 e-code 细胞的例如，参见 13,14)，多个实验室利用此类电生理反应集合，根据神经元的电学特性对其进行客观分类。这包括对稳态输入-输出传递关系（f-I曲线）的分析，采用一种创新技术，通过比例-积分-微分（PID）控制器实现闭环、实时控制放电频率；其次为重建真实 体内样 背景突触活动 体外 制备10 第三，通过计算机模拟的虚拟GABA能中间神经元，实时建立两个同时记录的锥体神经元之间的人工连接。

此外，LCG 实现了称为有源电极补偿（Active Electrode Compensation, AEC）15 的技术，该技术允许使用单个电极实施动态钳制协议。这可以补偿记录电极在用于传递细胞内刺激时所产生的不良效应（伪迹）。该方法基于对记录电路等效电学特性的非参数估计。

本文所述的技术和实验方案可直接应用于传统的开环电压钳和电流钳实验，并可扩展至其他实验体系，例如细胞外记录4,16或在体内的细胞内记录in vivo17,18。全细胞膜片钳电生理实验装置的精心组装是获得稳定、高质量记录的重要步骤。下文假设实验者已具备此类实验装置，因此我们将重点描述LCG的使用方法。关于优化和故障排查的更多建议，读者可参考文献19–22。

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方案

本方案符合安特卫普大学生物医学科学系伦理委员会的建议和指南。本方案需要使用经批准的人道安乐死技术获得的幼年Wistar大鼠的切除脑组织来制备无感知能力的材料。

1. 仪器准备

  1. 安装并配置数据采集与刺激系统。
    1. 使用配备有支持 Comedi 的数据采集（DAQ）卡的个人计算机（PC），记录信号并向电生理放大器发送模拟控制电压。
      注意：Comedi 是一个 Linux 模块和库，支持来自最常见制造商的多种数据采集（DAQ）卡：更多信息请访问 http://www.comedi.org。
    2. 如果使用计算机控制的膜片钳放大器，请额外配备一台独立于放大器控制计算机的PC。
      注意：尽管后者可能运行常规操作系统，但额外的计算机将通过特殊操作系统实现实时运行。在此条件下，可将显示器、鼠标和键盘直接连接至该额外计算机，同时通过远程桌面应用程序连接至专用计算机，从而便于操作。
    3. 从包含预装 LCG 的实时 Linux 操作系统的 Live CD 的 ISO 镜像下载 http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso，然后将其刻录到空白CD或U盘上。
    4. 将CD插入装有DAQ卡的PC驱动器中并启动即可。或者，从在线源代码仓库将LCG安装到运行Linux操作系统的PC上（例如， Debian 或 Ubuntu）。有关安装步骤的详细信息，请参阅在线手册。该手册可在线获取，网址为 http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf。
    5. 从Live CD启动：这将自动加载一个完全配置好的系统。操作方法是将LCG Live CD放入计算机的CD-ROM驱动器，然后从光盘启动计算机；当启动菜单出现时，立即选择实时内核（默认选项），并等待系统初始化完成。
    6. 在命令提示符下输入以下命令以校准DAQ卡：
      sudo comedi_calibrate
      或
      sudo comedi_soft_calibrate
      根据数据采集板支持硬件校准还是软件校准而定（可使用命令 sudo comedi_board_info 获取板卡信息）。
    7. 设置适当的模数和数模转换系数：需要查阅细胞电生理放大器的手册，特别是其关于转换系数的技术参数。
    8. 使用文本编辑器在文件 /home/user/.lcg-env 中为环境变量 AI_CONVERSION_FACTOR_CC、AI_CONVERSION_FACTOR_VC、AO_CONVERSION_FACTOR_CC、AO_CONVERSION_FACTOR_VC 指定适当的数值。
      注意：这些参数分别表示电流钳（CC）和电压钳（VC）模式下的输入（AI）和输出（AO）增益，以及计算机提供的电压指令与放大器生成的电流或电压之间的转换系数。
    9. 或者，可使用提供的 LCG 脚本（lcg-find-conversion-factors）来确定其系统的转换系数。
      注意：lcg-find-conversion-factors 计算出的数值为估算值，在某些情况下需要进行数值截断或舍入，以反映转换因子的精确值。
    10. 使用 lcg-find-conversion-factors 时，首先将通常随放大器一起购买的“模型细胞”连接至相应的探头。然后，在运行 Live CD 的 Linux 机器上打开终端，并在命令行提示符下输入以下命令：
      lcg-find-conversion-factors -i $HOME/.lcg-env -o $HOME/.lcg-env 
      注意：在这两种情况下（即， 手动修改 /home/user/.lcg-env 或使用 lcg-find-conversion-factors）后，关闭并重新打开终端以使更改生效。
    11. 若使用多个头级放大器，请将所有通道的转换系数设置为相同值；若无法实现，请参考LCG在线手册，了解如何在lcg-stimulus中使用多个转换系数，或如何生成更符合用户需求的配置文件。

2. 体感皮层急性脑切片的制备

  1. 电生理实验溶液的配制
    1. 配制人工脑脊液（ACSF），其成分为（单位：mM）125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、25 葡萄糖、1.25 CaCl₂ 和 1.25 MgCl₂2PO4，26 NaHCO₃3，25 葡萄糖，2 CaCl2，以及 1 MgCl2. 配制10倍浓缩液 配制储备液以减少实验当天的准备时间。准备2 L溶液，其中1 L用于脑片制备，另1 L用于记录。
    2. 用95% O₂ 饱和ACSF2 和5% CO2 在操作开始前至少30分钟。
    3. 用于电流钳记录时，使用含有以下成分的细胞内液（ICS）（单位：mM）：115 K-葡萄糖酸盐、20 KCl、10 HEPES、4 ATP-Mg、0.3 Na2-GTP，10 Na2-磷酸肌酸。在冰上配制该溶液，并在记录开始前过滤，以消除堵塞移液管的风险。
  2. 脑组织提取
    1. 将动物置于含4%异氟烷的诱导室中麻醉，随后使用断头器或大型剪刀迅速断头。
    2. 沿中线切开皮肤，并将其剥离至耳部。
    3. 使用精细的剪刀沿颅骨中线剪开，刀片应尽可能贴近颅骨表面，以最大限度减少对下方脑组织的损伤。用镊子打开颅骨，用解剖刀切断视神经和脑干，将脑组织轻轻放入冰冻的ACSF溶液中。
    4. 使用解剖刀（24号刀片）分离小脑和两个半球。
    5. 从两个半球中去除多余的水分，用一滴超级胶水将其粘附在倾斜的平台上。迅速在脑组织上添加数滴人工脑脊液（ACSF），然后转移至振动切片机的切片室中。
      注意：制备矢状切片时，切片平台的角度至关重要，以避免在切片过程中损伤锥体细胞的树突。
  3. 切片的制备。
    1. 将刀片置于脑组织上方，弃去前2.5 - 3 mm。调整速度和频率，以在尽量减少切片操作所需时间的同时，限制对切片表面的损伤。
    2. 将厚度设为 300 µm 并开始切片。当刀片切过皮层后，使用剃刀刀片或弯针在海马上方以及目标皮层区域的边缘进行切割。
    3. 将切片置于多孔孵育板中，保持在 32 - 34 °C
    4. 收回刀片，重复步骤2.3.2和2.3.3，直至切出5 - 8片切片。最佳切片通常为血管与切片表面平行的那些。
    5. 在将最后一片样本放入孵育 chamber 后，孵育切片 30 分钟。

3. 来自第5层锥体神经元的膜片钳记录

  1. 将脑片放入记录室，寻找状态良好的细胞。这些细胞通常对比度较低、表面光滑且未出现肿胀。
  2. 使用显微镜的40倍物镜观察脑片，并在距脑表面约600至1,000 µm的第5层中寻找细胞。
  3. 找到合适细胞后，用约三分之一的体积吸取细胞内液（ICS）填充微电极，并将其插入放大器的电极夹持器中。
  4. 在运行实时光盘或预配置Linux操作系统的个人计算机上，启动命令行终端（例如，bash），在提示符下输入命令 lcg-zero。此操作可确保数据采集板不会驱动放大器。
  5. 通过推动连接至电极夹持器的普通注射器活塞，施加30–50 mbar的正压，并借助显微镜将电极移至距脑片上方约100 µm处。
    注意：应将电极置于可直接通向目标细胞的位置，建议使用显微操作器的“接近模式”进行定位。
  6. 通过调节膜片钳放大器的控制装置，调整电极偏移电压，并在电压钳模式下输出测试脉冲（10 mV）。
  7. 通过回拉注射器活塞，将压力降至10–30 mbar（根据电极大小调整）；轻柔地接近细胞，并通过视频监视器观察细胞表面是否形成“凹陷”。始终通过示波器上显示的电流波形监测测试脉冲的电阻变化（也可使用命令 lcg-seal-test 监测电极电阻）。
  8. 释放正压，当观察到电极电阻升高且细胞表面出现“凹陷”时，必要时可施加轻微负压以促进封接形成。
  9. 在封接形成过程中，逐步将保持电位降至-70 mV。
  10. 一旦形成吉欧姆级封接（gigaohm seal），确保保持电流在0– 30 pA之间。施加短暂的负压脉冲（抽吸）以破裂细胞膜，建立全细胞记录模式。或者，也可根据所用脑片和玻璃电极的类型，施加强而短暂的电压脉冲（即，使用放大器上的“ZAP”命令或将细胞钳制在极负电位）来击穿膜结构。
  11. 切换至电流钳模式，确认静息膜电位符合健康细胞的典型范围。对于使用谷氨酸钾溶液记录的大脑皮层锥体神经元，该值通常在-65至-75 mV之间。

4. 神经元电反应特性的半自动表征

  1. 创建一个目录以存储用户数据。为此，请使用 LCG 启动光盘中包含的一个脚本，该脚本可根据日期创建文件夹。使用方法是在命令行中输入以下命令：
    cd ~/experiments
    lcg-create-experiment-folder -s psp,in_vivo_like
    该命令将创建一个用于保存该细胞数据的文件夹（并创建 'psp' 和 'in_vivo_like' 子文件夹），并在终端窗口中打印出文件夹名称；此外，还可以通过此脚本存储其他信息，例如电极阻抗和细胞类型。
  2. 使用以下命令切换到新创建的文件夹：
    cd ~/<foldername>
    文件夹名称由 lcg-create-experiment-folder 命令显示，包含当天的时间戳（即 年-月-日），例如 20140331A01。
  3. 确保放大器设置为电流钳模式，电缆已正确连接，并且如果存在外部电压指令，则已启用放大器的外部电压指令功能。
  4. 在命令行中输入命令 lcg-ecode。该命令会调用一系列用于表征细胞基本响应特性的子命令（即 lcg-ap、lcg-vi、lcg-ramp、lcg-tau 和 lcg-steps）。lcg-ecode 要求用户指定两个参数：用于诱发细胞产生单个动作电位的 1 ms 长电流脉冲的幅度，以及注入细胞的电流斜坡的最大幅度，以确定其阈值电流（rheobase）。
    使用如下命令语法：
    lcg-ecode --pulse-amplitude X --ramp-amplitude Y
    其中 X 和 Y（单位为 pA）应分别选择足够使细胞对 1 ms 电流脉冲和持续电流注入产生放电反应的数值。
    注意：这些实验方案需要进行“电极核”（electrode kernel）的数值估计，以便使用主动电极补偿（AEC）15。通过注入噪声电流来估计电极核，系统将提示用户确认构成电极核的采样点数量。有关电极核的含义及如何选择核采样点数的详细信息，请参见文献15。

5. 通过模拟突触注入电导及模拟类似体内的背景活动

  1. 模拟兴奋性突触后电位的注入
    1. 在 shell 的命令提示符下输入以下命令，切换到将要保存下一个实验的目录：
      cd psp/01
    2. 将一个 LCG 配置文件复制到当前目录，并使用文本编辑器（本例中为 Nano）打开，方法是在 shell 的命令提示符下输入以下命令（此示例配置文件包含在源代码和 Live CD 中）：
      cp ~/local/src/lcg/configurations/epsp.xml 
      nano epsp.xml
      注意：这只是一个包含多个相互连接实体的文本文件。更多细节请参见代表性结果部分。
    3. 如有必要，请编辑该文件中的 inputChannel、outputChannel、inputConversionFactor 和 outputConversionFactor，以匹配用户的实验设置。
    4. 通过执行以下命令计算执行主动电极补偿所需的电极核（LCG 用于实现单电极动态钳的方法）：
      lcg-kernel
      系统将提示输入核中的点数。请再次选择一个数值，使得电极核覆盖指数衰减尾部的终点。
    5. 使用以下命令执行动态钳实验：
      lcg-experiment -c epsp.xml
    6. 使用以下命令列出文件并可视化结果：
      ls -l
      lcg-plot-file -f last
  2. 模拟抑制性突触后电位的注入
    1. 在 shell 的命令提示符下输入以下命令，创建一个文件夹并将 epsp.xml 文件复制到其中：
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      cd ../02
    2. 使用文本编辑器编辑配置文件：将模型突触 Exp2Synapse 的突触反转电位以及上升和衰减时间常数修改为以下值：
      parameters>
      <E>-80</E>
      <tauRise>0.8e-3</tauRise>
      <tauDecay>10e-3</tauDecay>
      <parameters>
      退出文本编辑器。
    3. 与 5.1 节相同，通过在 shell 的命令提示符下输入以下命令计算电极核并执行实验：
      lcg-kernel
      lcg-experiment -c ipsp.xml
    4. 通过在 shell 的命令提示符下输入以下命令列出文件并可视化结果：
      ls -l
      lcg-plot-file -f <filename.h5>
  3. 模拟类似 in vivo 的背景活动：
    1. 如前所述，在 shell 的命令提示符下输入以下命令，切换到要保存后续实验的目录：
      cd ../../in_vivo_like/01
    2. 在 shell 的命令提示符下输入以下命令，从 LCG 源代码目录复制配置文件：
      cp ~/local/src/lcg/configurations/in_vivo_like.xml 
      nano in_vivo_like.xml
      注意：该文件只是之前文件的组合；两个泊松点过程生成脉冲序列，进而驱动抑制性和兴奋性模型突触，从而产生背景活动。
    3. 根据 5.1.3 节所述，调整用户实验设置的 DAQ 配置参数，然后退出编辑器。
    4. 与 5.1 节相同，通过在 shell 的命令提示符下输入以下命令计算电极核并执行实验：
      lcg-kernel
      lcg-experiment -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
      “-n 10”和“-i 3”选项表示刺激应重复 10 次，每次间隔 3 秒。
    5. 在 shell 的命令提示符下使用以下命令可视化原始轨迹：
      lcg-plot-file -f all

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结果

在前面的章节中，我们描述了如何使用软件工具箱 LCG 来表征 L5 锥体细胞的电生理特性，并在脑片制备中重现类似 in vivo 的突触活动。采用命令行界面和半自动化实验方案有利于提高实验的可重复性和效率，从而显著影响所产生数据的数量和质量。此外，由于数据以一致的方式保存，因此很容易将分析扩展到特定的研究目标。图1展示了一项典型实验结果，该实验使用六种不同的方案对一个细胞的基本电生理特性进行了表征。

动作电位波形和阈值的测量（图 1A）：注入短暂而强的去极化电流脉冲，以测量平均动作电位波形。动作电位的第三导数的第一个峰值被计算为放电阈值24。电压-电流曲线的测量（图 1B）：向细胞注入阈下电流脉冲，可用于测量被动反应特性（如输入电阻），并表征阈下离子电流。

测量引发持续放电所需的最小电流（图 1C）。注入的电流 ramp 可用于将细胞表征为 I 型或 I...

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讨论

本文描述了一种利用膜片钳技术和一种新开发的名为LCG的软件工具箱，实施实时闭环单细胞电生理实验的完整方案。为了优化记录质量，确保记录装置正确接地、屏蔽并避免振动至关重要：这可以保证对细胞的稳定且持久的全细胞记录，结合刺激方案中多个部分的自动化可能性，能够最大化实验的通量。

本文展示了LCG可应用的两个案例，即根据细胞的电生理特性对其进行表征（图 1），包括快速计算神经元的主动输入-输出关系，以及在脑片中重现类似体内（in vivo）的活动状态（图 2）。这些应用展示了如何构建不同的实验方案，并突出了LCG的一些显著特性：其命令行界面适合脚本化操作，从而实现一系列实验方案的自动化执行。此外，如图 1所示，从前一个实验方案中提取的数值可用于调整后续实验方案的参数。

可以实时监测被分析细胞反应的高级特征例如，其瞬时发放率，如图所示 图1D

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

谨此致谢以下机构提供的经费支持：弗拉芒研究基金会 FWO（合同编号 12C9112N，授予 DL）、欧盟委员会第七框架计划（玛丽·居里网络“C7”，合同编号 238214；信息与通信技术未来新兴技术“ENLIGHTENMENT”项目，合同编号 306502）、比利时科学政策办公室发起的大学间引力项目计划（合同编号 IUAP-VII/20）以及安特卫普大学。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织切片机LeicaVT-1000S
玻璃微电极拉制仪SutterP-97
微电极WPI1B150F-4外径/内径 1.5/0.84 mm，带纤维
振动隔离台TMC20 系列
显微镜LeicaDMLFS40X 浸液物镜
显微操作器ScientificaPatchStar
放大器Axon InstrumentsMultiClamp 700B计算机控制
数据采集卡National InstrumentsPCI-6229由 Comedi Linux 驱动程序支持
台式计算机DellOptiplex 7010 Tower操作系统：实时 Linux
示波器TektronixTDS-1002
灌流泵GibsonMINIPULS3配合 R4 泵头（F117606）使用
温度控制器Multichannel SystemsTC02PH01 灌流套管
压力计Testo510可选
培养箱MemmertWB14
NaClSigma71376ACSF
KClSigmaP9541ACSF, ICS
NaH2PO4SigmaS3139ACSF
NaHCO3SigmaS6014ACSF
CaCl2SigmaC1016ACSF
MgCl2SigmaM8266ACSF
葡萄糖SigmaG7528ACSF
K-葡萄糖酸盐SigmaG4500ICS
HEPESSigmaH3375ICS
Mg-ATPSigmaA9187ICS
Na2-GTPSigma51120ICS
Na2-磷酸肌酸SigmaP7936ICS

参考文献

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实时电生理学：利用闭环协议探究神经元动态及其更广泛应用
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