SDF-1α-壳聚糖-硫酸葡聚糖纳米颗粒的制备与表征

摘要

本实验方案的目的是将干细胞归巢因子 SDF-1α 负载至硫酸葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒中。对所得颗粒的粒径、Zeta 电位，以及其中 SDF-1α 的含量、活性和 体外 纳米颗粒中SDF-1α的释放速率

摘要

壳聚糖（CS）和硫酸葡聚糖（DS）是带电多糖（糖类），在适当条件下混合时可形成基于聚电解质复合物的纳米颗粒。这类糖类纳米颗粒可作为蛋白质因子的有效载体，有助于 体内 递送蛋白质并维持其在靶组织中的滞留。糖类聚电解质复合物也适用于蛋白质递送，因为其包载过程在水溶液中进行，降低了蛋白质失活的可能性。具有肝素结合位点的蛋白质可轻易与硫酸葡聚糖结合，并通过该结合得到稳定。这些颗粒在递送时也具有较低的炎症反应和毒性 在体在下述方案中，首先将干细胞归巢因子 SDF-1α（基质细胞衍生因子-1α）与右旋糖酐硫酸酯混合并孵育。随后向混合物中加入壳聚糖，形成聚电解质复合物，再加入硫酸锌，通过锌桥结构稳定该复合物。对所得 SDF-1α-DS-CS 颗粒的粒径（直径）和表面电荷（zeta 电位）进行测定。随后测定颗粒中包载的 SDF-1α 含量，并对其释放行为进行检测 体外 释放速率及其以颗粒结合形式存在的趋化活性

引言

右旋糖酐硫酸钠（DS）和壳聚糖（CS）是多糖类物质，其中DS含有多个取代的带负电荷的硫酸根基团，而脱乙酰化的CS则含有带正电荷的氨基基团。当两者在水溶液中混合时，可通过静电相互作用形成聚电解质复合物。这些复合物可能形成较大的聚集体，从而从水相中分离出来（沉淀），也可能形成可分散于水中的小颗粒（胶体）。影响上述结果的具体条件已被广泛研究，并在近期的一篇综述中进行了系统总结和详细图示¹。在这些条件中，生成可水分散颗粒的两个基本要求是：带相反电荷的聚合物必须满足：1）具有显著不同的摩尔质量；2）以非化学计量比混合。这些条件可使电荷中和过程中产生的电中性复合聚合物链段发生相分离并形成颗粒的核心，而过量的聚合物则构成颗粒的外层壳结构¹。本实验方案所描述的糖类颗粒旨在用于肺部递送，设计为表面净带负电荷且粒径处于纳米级别。负电荷表面可降低颗粒被细胞摄取的可能性^2,3，而纳米级粒径有助于颗粒通过远端气道。为实现这一目标，本制备过程中DS的用量超过CS（质量比为3:1），并采用高分子量DS（重均分子量500,000）和低分子量CS（分子量范围50–190 kDa，脱乙酰度为75–85%）。

SDF-1α 是一种干细胞归巢因子，通过其趋化活性发挥归巢功能。SDF-1α 在造血干细胞向骨髓归巢及维持其在骨髓中的定位方面发挥重要作用，同时也参与祖细胞向外周组织的募集，以促进损伤修复^4,5。SDF-1α 的蛋白质序列中含有一个肝素结合位点，使其能够与肝素/硫酸乙酰肝素结合，形成二聚体，免受蛋白酶（CD26/DPPIV）降解失活，并通过细胞表面受体与靶细胞相互作用^6-8。硫酸软骨素（DS）具有与肝素/硫酸乙酰肝素相似的结构特性；因此，SDF-1α 与 DS 的结合方式应与其天然多聚配体的结合方式相似。

在以下实验方案中，我们描述了SDF-1α-DS-CS纳米颗粒的制备方法。该方法代表了此前已研究过的一种配方形式⁹。本方案最初借鉴自VEGF-DS-CS纳米颗粒的研究¹⁰。此处描述的是小规模制备过程，可使用相同的储备溶液和制备条件轻松放大生产。制备完成后，通过检测颗粒的粒径、zeta电位、SDF-1α包封率、体外释放时间以及所包封SDF-1α的生物活性对其进行表征。

方案

1. SDF-1α 糖蛋白纳米颗粒的制备

由于其目的 体内 递送，准备过程中使用的所有容器、移液器及吸头均需灭菌。

1. 在超纯水中配制以下储备液：1% 硫酸葡聚糖；1 M NaOH（使用 PES 膜无菌过滤）；0.1% 壳聚糖溶于 0.2% 冰醋酸中（依次通过 0.8 和 0.22 μm 滤膜过滤，随后用 NaOH 调节 pH 至 5.5）；0.1 M ZnSO₄；15% 甘露醇；以及 0.92 mg/ml SDF-1α（分装后于 -80 °C 保存，解冻后置于 4 °C 保存）。
2. 将储备液通过 0.22 μm 滤膜进行无菌处理。使用鲎试剂（LAL）凝胶法检测所配溶液中的内毒素水平，确保其低于<0.06 EU/ml。
3. 向含有磁力搅拌子的 1.5 ml 玻璃小瓶中加入 0.18 ml 超纯水，将搅拌速度设为 800 rpm。加入 0.1 ml 1% 硫酸葡聚糖，搅拌 2 分钟。再加入 0.08 mg SDF-1α（即 0.92 mg/ml SDF-1α 溶液的 0.087 ml），继续搅拌 20 分钟。
4. 逐滴加入 0.33 ml 0.1% 壳聚糖，搅拌 5 分钟。将搅拌速度调至最大，随后用 0.1 ml 注射器缓慢加入 0.1 ml 0.1 M ZnSO₄（在 1 分钟内加完）。
5. 将搅拌速度恢复至 800 rpm，继续搅拌 30 分钟。加入 0.4 ml 15% 甘露醇，搅拌 5 分钟。将反应混合物转移至 1.5 ml 微量离心管中，在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟。
   注意：甘露醇的存在有助于离心后颗粒的重悬。根据沉淀的紧密程度，甘露醇浓度可在 0% 至 5% 范围内调整。每次离心后确保颗粒完全重悬，对避免最终悬浮液中形成聚集体至关重要。
6. 吸除上清液，并用移液器缓慢移除最后一滴液体。加入 0.2 ml 5% 甘露醇，使用 0.5 ml 配 29 G 针头的注射器重悬沉淀。再加入 1 ml 5% 甘露醇，以 16,000 × g 离心 15 分钟。
7. 重复步骤 1.6。
8. 吸除上清液，将沉淀重悬于 0.2 ml 5% 甘露醇中，将颗粒悬浮液于 4 °C 保存。
   注意：颗粒悬浮液也可在 -80 °C 冻存或冻干保存。在悬浮液中添加 5% 甘露醇对于防止颗粒在冻融或冻干再水化后发生聚集至关重要。储存后可通过离心去除甘露醇。

2. 颗粒大小和Zeta电位的测量

采用材料列表中指定的粒径分析仪，分别通过动态光散射和电泳光散射法分析颗粒大小和泽塔电位。

1. 设置粒径测量的以下参数：累积时间：70；重复次数：4；温度：25 °C；稀释液：水；强度调节：自动。
2. 用水稀释SDF-1α-DS-CS样品（10倍稀释）。取100 μl样品加入一次性紫外比色皿（如Eppendorf比色皿）中。将比色皿插入样品池架。等待强度调节达到“最佳”状态（约10,000 cps），开始数据采集。
3. 测量完成后，记录粒径（nm）和多分散系数的累积量结果。对4次重复测量所得结果取平均值，并计算标准偏差。
4. 取500 μl经10倍稀释的粒子样品加入流动池，用于测量zeta电位。设置以下测量参数：累积时间：10；重复次数：5；温度：25 °C；稀释液：水；强度调节：自动。记录zeta电位（mV）结果。对5次重复测量所得结果取平均值，并计算标准偏差。

3. 颗粒中SDF-1α的定量分析

1. 将游离形式的 SDF-1α 用 1.3x Laemmli 样品缓冲液稀释至浓度分别为 0.01、0.02、0.03、0.04 和 0.05 mg/ml。将 6 µl SDF-1α-DS-CS 样品与 40 µl 1.3x Laemmli 样品缓冲液混合稀释。（配制 4x Laemmli 储存缓冲液，其成分为 0.25 M Tris-HCl，pH 7.5，8% SDS，40% 甘油，0.05 mg/ml 溴酚蓝，以及 8% 2-巯基乙醇。将储存液分装成小份，于 -20 °C 保存，仅供单次使用。）
2. 将样品在 100 °C 加热 10 分钟。在加热过程中涡旋振荡样品两次（每次最大速度持续 10 秒），以确保颗粒完全解离。加热后将样品冷却至室温 2 分钟。以 10,000 × g 离心 0.5–1 分钟，以收集管壁上的冷凝水。再次涡旋振荡，使样品充分混匀。
   注意：此时样品溶液应澄清，无可见沉淀物。
3. 每孔上样 10 µl，使用 4–20% SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，于 200 V 电压下运行 20 分钟。电泳结束后用考马斯亮蓝蛋白染色液对凝胶染色。
4. 使用分子成像仪及密度分析软件分析 SDF-1α 蛋白条带的密度。根据游离 SDF-1α 标准品绘制的标准曲线，计算颗粒中 SDF-1α 的含量。

4. 体外 释放实验

1. 将SDF-1α糖颗粒与不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）按1:1（v/v）比例混合。
2. 将颗粒悬液分装至1.5 ml离心管中，每管0.05 ml。将样品加至管底，避免引入气泡或扰动液体表面。用Parafilm密封管口。
   注意：如此操作可确保在后续管式混合器自上而下的旋转过程中液体始终位于管底。
3. 在37 °C下使用旋转微型离心管混合器旋转孵育。在指定时间点取出分装样品，并立即在4 °C下以16,000 × g离心10分钟。
4. 分离上清液和沉淀物，用0.05 ml D-PBS重悬沉淀物。将样品于−20 °C保存。待所有样品收集完毕后，按照前述方法在SDS凝胶上分析上清液和沉淀物。

5. 迁移实验

该实验用于检测SDF-1α的趋化活性。SDF-1α与其细胞表面受体（CXCR4）相互作用，可诱导细胞向SDF-1α浓度梯度方向迁移。在本实验中，将细胞加入上室（通过半透膜与下室分隔），并将SDF-1α溶液加入下室。

1. 用迁移缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白的RPMI-1640培养基）将SDF-1α（游离形式或颗粒结合形式）进行3倍系列稀释，最终浓度分别为100、33、11、3.7、1.2、0.41、0.14和0.05 ng/ml。
2. 向24孔板的每个孔中加入0.6 ml稀释后的SDF-1α溶液或仅加入迁移缓冲液（阴性对照）。另取一孔加入0.57 ml迁移缓冲液作为输入细胞对照。37 °C孵育30分钟。将通透性细胞培养小室（如Transwell，孔径5 μm，直径6.5 mm）置于下层孔上方。向Transwell小室内加入0.1 ml Jurkat细胞（5 × 10⁵）。直接向输入细胞对照孔中加入0.03 ml细胞。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2小时。
3. 移除Transwell小室。将迁移至下层孔中的细胞转移至4 ml聚苯乙烯管中。用流式细胞仪计数迁移细胞。
4. 迁移率以输入细胞数的百分比计算（输入细胞对照孔中的细胞数 × 100/30），并减去阴性对照组的数值（迁移至仅含迁移缓冲液孔中的细胞数）。

结果

采用粒度分析仪测定所制备的SDF-1α-DS-CS颗粒的粒径和Zeta电位。图1展示了粒径测定的分析结果。根据四次重复测量所得的累积量结果，SDF-1α-DS-CS颗粒的平均流体动力学直径为661 ± 8.2（nm），多分散系数为0.23 ± 0.02。Zeta电位的测定结果如图2所示。根据五次重复测量，SDF-1α-DS-CS颗粒的Zeta电位为-24.8 ± 0.5 mV。如上所述，在SDF-1α-DS-CS颗粒悬液中添加5%甘露醇对于防止冻融过程中颗粒聚集至关重要。图3展示了将颗粒悬浮于水中并在-80 °C冷冻后的粒径测定结果。解冻后可观察到明显的聚集峰。

通过SDS凝胶电泳估算SDF-1α-DS-CS颗粒中SDF-1α的含量。图4A显示了一张考马斯亮蓝染色的SDS凝胶，其中加样包括SDF-1α标准品、DS-CS纳米颗粒（未包载SDF-1α的对照颗粒，Ctrl NP）以及SDF-1α-DS-CS纳米颗粒（SDF-1α NP）样品。根据SDF-...

讨论

如上所述，DS-CS 纳米颗粒是通过聚阴离子（DS）与聚阳离子（CS）分子之间的电荷中和形成的。由于在分子碰撞过程中电荷相互作用易于发生，聚合物溶液的浓度以及混合过程中的搅拌速度对最终颗粒的大小至关重要。通常趋势是，DS 和 CS 溶液浓度越低¹⁵，搅拌速度越高，所得颗粒越小。

SDF-1α 糖蛋白纳米颗粒的配方可进行调整。例如，本方案中使用的 SDF-1α/DS/CS 的用量及比例分别为 0.08/0.33/1（mg/mg/mg）。根据 SDF-1α 纳米颗粒的预期用途，这些比例可作相应改变。若加入混合物中的 SDF-1α 量为 0.04 mg（0.04/0.33/1，mg/mg/mg）而非 0.08 mg，则所形成颗粒尺寸更小，约为 650 nm，且 SDF-1α 的包封效率略高，为 70–80% ⁹。然而，当递送时 体内，每单位SDF-1α所含的糖类基质将更多。若希望获得更小的粒径，可进一步调整SDF-1α糖类纳米颗粒的配方。一种替代方案是使用较低分子量的壳聚糖，如参考文献所示 ¹⁵需要注意的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
葡聚糖硫酸盐	费舍尔	BP1585-100
壳聚糖，低分子量	西格玛	448869
七水硫酸锌	西格玛	204986
D-甘露醇	西格玛	M9546
超纯水	英韦特罗根	10977-023
SDF-1α	根据参考文献8制备
针式过滤器，PES膜，0.22 μm	密理博	SLGP033RS
磁力搅拌子（2 × 7 mm）	费舍尔	14-513-63
玻璃小瓶套装；SUN-SRi	费舍尔	14-823-182
Delsa Nano C 粒子分析仪	贝克曼库尔特
艾本德UV比色皿	艾本德	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX 凝胶	伯乐	456-1096
GelCode Blue Safe 蛋白染色液	费舍尔	PI-24592
分子成像仪 VersaDoc MP 4000 系统	伯乐	170-8640
康宁Transwell可穿透支持膜	康宁	3421
Accuri C6 流式细胞仪	BD生物科学
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	西格玛	D8537
Pyrogent plus 试剂盒	费舍尔	NC9753738