人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

摘要

利用磁共振成像（人类）、3D成像软件以及免疫组织化学分析，我们记录了大脑侧脑室的变化。随后在小鼠模型中模拟人类大脑因衰老或疾病引起的侧脑室体积的纵向3D图谱变化，以及脑室周围细胞变化的特征。

摘要

脑室系统负责携带和循环脑脊液（CSF），并促进脑内溶质和毒素的清除。脑室的功能单位是称为室管膜细胞的纤毛上皮细胞，这些细胞排列在脑室壁上，通过纤毛运动可在脑室表面产生脑脊液的层流。这层室管膜细胞单层还具有屏障和过滤功能，促进脑组织间液（ISF）与循环脑脊液之间的物质交换。因此，脑内的生化变化会反映在脑脊液的成分中，而室管膜的破坏可能扰乱脑脊液与组织间液交换的精细平衡。在人类中，侧脑室扩张与衰老之间存在显著相关性。即使在无痴呆或脑脊液流动阻塞的情况下，也可能出现与年龄相关的脑室扩大。脑室扩大的确切原因和进展过程通常尚不明确；然而，扩大的脑室常表现出区域性甚至广泛性的室管膜细胞覆盖缺失，脑室表面被星形胶质细胞增生及伴随的脑室周围水肿所取代，从而破坏功能性室管膜细胞单层。本文结合磁共振成像（MRI）扫描与死后人脑组织，描述如何制备、成像并整合侧脑室容积的三维重建图像，计算侧脑室容积，并通过对侧脑室壁组织“面朝上”（en face）制备样本进行免疫组织化学分析，以表征脑室周围组织。同时，也展示了小鼠脑组织的相应分析，支持利用小鼠模型评估人类衰老和疾病中侧脑室及脑室周围组织的变化。这些实验方案共同为研究脑室扩大的因果关系提供了方法，并突出了评估脑室系统健康及其在脑内重要屏障和过滤功能的技术手段。

引言

室管膜细胞单层覆盖于脑室系统内表面，在脑脊液（CSF）与组织间液（ISF）之间发挥双向屏障和物质转运功能^1-3。这些功能有助于维持脑组织无毒性物质侵害并保持生理平衡^2,3。在人类中，由于损伤或疾病导致该内衬部分缺失后，似乎不会像其他上皮内衬那样发生再生性替代；相反，室管膜细胞覆盖的缺失往往导致室管膜周围星形胶质细胞增生，形成由星形胶质细胞构成的网状结构，覆盖在室管膜表面失去室管膜细胞的区域。可以预见，这种上皮层的缺失将对重要的脑脊液/组织间液交换与清除机制造成严重后果^1,2,4-7。

人类衰老的一个常见特征是侧脑室扩大（脑室扩大症）以及伴随的脑室周围水肿，这可通过磁共振成像（MRI）和液体衰减反转恢复MRI（MRI/FLAIR）观察到^8-14。为了研究脑室扩大与脑室衬层细胞结构之间的关系，研究人员将死后人脑的MRI序列与侧脑室周围组织的组织学切片进行了匹配分析。在出现脑室扩大的病例中，侧脑室壁上的大部分区域原本由室管膜细胞覆盖的结构已被胶质增生所取代。当基于MRI的体积分析未检测到脑室扩张时，室管膜细胞层保持完整，且在脑室衬层未观察到胶质增生现象⁶。这种联合分析方法首次全面记录了侧脑室衬层细胞完整性变化的情况，采用了部分或完整侧脑室壁的整体装片制备技术以及脑室体积的三维建模分析⁶。多种疾病（如阿尔茨海默病、精神分裂症）和损伤（如创伤性脑损伤）均以....

方案

注意：动物实验程序已获得康涅狄格大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。人体组织与数据分析及相关操作均经康涅狄格大学机构审查委员会（IRB）批准并符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。

1. 小鼠：脑室周围细胞完整性的分析及侧脑室的三维建模

1.1）小鼠侧脑室壁全层组织制备

1. 按照先前所述方法制备小鼠侧脑室全 mount 样本用于免疫组织化学（IHC）^16,17。

1.2）侧脑室分析的免疫组织化学

1. 按照先前所述方法固定并切片小鼠脑组织^18,19。
   1. 简言之，通过心脏灌注生理盐水（常温）冲洗小鼠，直至器官变白（颜色变浅表明已清除），随后用常温的含4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，直至组织变硬。
   2. 从颅骨中取出脑组织。使用虹膜剪刀沿颅骨基底部的矢状缝剪开。
   3. 暴露颅骨并用镊子取出脑组织。将脑组织浸入4% PFA固定液中，在4 °C下过夜固定。然后用PBS洗涤3 次，每次20 分钟。
2. 制备连续切片用于免疫组织化学染色和体积分析。
   1. 使用显微手术刀片，在左半球....

结果

基于免疫染色的50 µm冠状切片及三维重建（图3），对小鼠侧脑室进行轮廓追踪，可在以小鼠为疾病或损伤模型的不同实验范式中采集体积数据。该操作的关键在于排除侧脑室壁相互贴附的区域。通过对脑室区域进行分段，并为每个区域指定不同颜色（图3C），可整合连续切片，进而基于整合后的分段计算各区域及总体积。

可结合脑部 MRI 扫描与侧脑室的半自动分割（ITK-SNAP）进行三维重建，开展类似的研究。为了实现脑室体积与室周组织分析的直接配对，需对生前或死后获取的 MRI 扫描图像进行分割与配准，以构建三维重建模型（图 4）。若具备纵向 MRI 扫描数据，可将不同时期的三维重建图像进行配准与叠加，用于分析脑室随时间的扩张情况（图 5）。纵向分析可提供未来免疫组织化学分析中特别关注的区域信息。随后对相应组织进行免疫组织化学分析，以揭示脑室表面星形胶质细胞增生区域与完整室管膜细胞单层的分布情况（图 6A）。采集组织图像并拼接成大范围脑.......

讨论

我们提供可用于评估小鼠和人类大脑室系统完整性的工具和方案。然而，这些工具也可应用于其他因损伤、疾病或衰老过程而发生变化的脑结构或器官系统。 ^14,21,22. 所介绍的策略利用了能够对横断面和纵向 MRI 序列进行配准的软件，以生成特定区域或感兴趣结构的三维体积图像。纵向 MRI 序列可整合随时间变化的三维体积改变，还可进一步扩展用于分析全脑体积、侧脑室与全脑体积的比值，和/或其它脑部结构例如,丘脑下核 ²³ 或使用扩散加权张量成像技术分析胼胝体白质纤维束。结合多种方法，可对脑结构变化进行系统性分析。最终，为评估与年龄及疾病相关的脑结构改变，需整合多种多模态成像技术，以全面准确地反映脑健康状况 ²⁴对关键结构数据的记录与汇总，以及受试者间变异性和跨受试者变异范围的分析，理想情况下可用于构建超高场磁共振成像图谱，以最优地指导临床对健康或疾病状态下组织的诊断。

为了降低受试者间和受试者内数据集在采集和处理过程中的变异性，有几个关键步骤需要注意。理想情况下，为了获得匹配的数据序列，整个研究过程中应使用相同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	21600-069
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	19210	使用浓度为 PBS 中 4%，4 °C
正常马血清	Life Technologies	16050	PBS-TX 中 10%（v/v）
正常山羊血清	Life Technologies	16210	PBS-TX 中 10%（v/v）
吐温-100（TX）	Sigma-Aldrich	T8787	PBS 中 0.1%（v/v）
振动切片机	Leica	VT1000S
荧光显微镜	Zeiss	Imager.M2
相机	Hamamatsu	ORCA R2
显微镜载物台控制器	Ludl Electronic Products	MAC 6000
体视学软件	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
体视学软件	ImageJ/NIH	NIH 免费软件
三维重建软件	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP2
MRI 软件
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	分割与体积分析
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		分割与体积分析
多图像分析图形用户界面（Mango）	http://ric.uthscsa.edu/mango/		纵向叠加
整体封片设备
22.5° 微型外科直刺刀	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
蜡底解剖皿
解剖针
精细镊子
水性封片剂（aquapolymount）
解剖显微镜	Leica	MZ95
整体封片抗体
小鼠抗 β-catenin 抗体	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
山羊抗 GFAP 抗体	Santa Cruz Biotechnology		1:250
兔抗 AQP4（水通道蛋白-4）抗体	Sigma-Aldrich		1:400
冠状切片抗体
抗 S100β 抗体	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Life Technologies	D-1306	10 µg/ml PBS 溶液