人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

摘要

利用磁共振成像（人类）、3D成像软件以及免疫组织化学分析，我们记录了大脑侧脑室的变化。随后在小鼠模型中模拟人类大脑因衰老或疾病引起的侧脑室体积的纵向3D图谱变化，以及脑室周围细胞变化的特征。

摘要

脑室系统负责携带和循环脑脊液（CSF），并促进脑内溶质和毒素的清除。脑室的功能单位是称为室管膜细胞的纤毛上皮细胞，这些细胞排列在脑室壁上，通过纤毛运动可在脑室表面产生脑脊液的层流。这层室管膜细胞单层还具有屏障和过滤功能，促进脑组织间液（ISF）与循环脑脊液之间的物质交换。因此，脑内的生化变化会反映在脑脊液的成分中，而室管膜的破坏可能扰乱脑脊液与组织间液交换的精细平衡。在人类中，侧脑室扩张与衰老之间存在显著相关性。即使在无痴呆或脑脊液流动阻塞的情况下，也可能出现与年龄相关的脑室扩大。脑室扩大的确切原因和进展过程通常尚不明确；然而，扩大的脑室常表现出区域性甚至广泛性的室管膜细胞覆盖缺失，脑室表面被星形胶质细胞增生及伴随的脑室周围水肿所取代，从而破坏功能性室管膜细胞单层。本文结合磁共振成像（MRI）扫描与死后人脑组织，描述如何制备、成像并整合侧脑室容积的三维重建图像，计算侧脑室容积，并通过对侧脑室壁组织“面朝上”（en face）制备样本进行免疫组织化学分析，以表征脑室周围组织。同时，也展示了小鼠脑组织的相应分析，支持利用小鼠模型评估人类衰老和疾病中侧脑室及脑室周围组织的变化。这些实验方案共同为研究脑室扩大的因果关系提供了方法，并突出了评估脑室系统健康及其在脑内重要屏障和过滤功能的技术手段。

引言

室管膜细胞单层覆盖于脑室系统内表面，在脑脊液（CSF）与组织间液（ISF）之间发挥双向屏障和物质转运功能^1-3。这些功能有助于维持脑组织无毒性物质侵害并保持生理平衡^2,3。在人类中，由于损伤或疾病导致该内衬部分缺失后，似乎不会像其他上皮内衬那样发生再生性替代；相反，室管膜细胞覆盖的缺失往往导致室管膜周围星形胶质细胞增生，形成由星形胶质细胞构成的网状结构，覆盖在室管膜表面失去室管膜细胞的区域。可以预见，这种上皮层的缺失将对重要的脑脊液/组织间液交换与清除机制造成严重后果^1,2,4-7。

人类衰老的一个常见特征是侧脑室扩大（脑室扩大症）以及伴随的脑室周围水肿，这可通过磁共振成像（MRI）和液体衰减反转恢复MRI（MRI/FLAIR）观察到^8-14。为了研究脑室扩大与脑室衬层细胞结构之间的关系，研究人员将死后人脑的MRI序列与侧脑室周围组织的组织学切片进行了匹配分析。在出现脑室扩大的病例中，侧脑室壁上的大部分区域原本由室管膜细胞覆盖的结构已被胶质增生所取代。当基于MRI的体积分析未检测到脑室扩张时，室管膜细胞层保持完整，且在脑室衬层未观察到胶质增生现象⁶。这种联合分析方法首次全面记录了侧脑室衬层细胞完整性变化的情况，采用了部分或完整侧脑室壁的整体装片制备技术以及脑室体积的三维建模分析⁶。多种疾病（如阿尔茨海默病、精神分裂症）和损伤（如创伤性脑损伤）均以脑室扩大作为早期神经病理学特征之一。因此，室管膜细胞层的局部剥脱可预测会干扰室管膜细胞的正常功能，并破坏脑脊液（CSF）与组织间液（ISF）之间液体和溶质交换的稳态平衡。因此，对脑室系统的变化、其细胞组成及其对下方或邻近脑结构影响的更深入研究，将最终有助于揭示与脑室扩大相关的神经病理机制。

缺乏多模态成像数据，尤其是纵向数据序列，以及难以获取相应的组织学样本，使得对人类脑部病理的分析变得困难。通过小鼠模型或其他动物模型来模拟人类衰老或疾病中出现的表型，常常是可行的，动物模型也因此成为我们探索人类疾病发生与进展问题的最佳手段之一。已有多个针对健康年轻小鼠的研究描述了侧脑室壁及其下方干细胞微环境的细胞结构^4,7-15。这些研究进一步扩展到通过三维建模和细胞分析，研究侧脑室壁在衰老过程中的变化^6,15。在老年小鼠中并未观察到室周胶质增生或脑室扩大现象，相反，小鼠表现出相对完整的脑室下区（SVZ）干细胞微环境，其上方为完整的室管膜细胞层^6,15。因此，在衰老过程中，人类与小鼠在侧脑室壁的整体维持和结构完整性方面存在显著的物种特异性差异^6,15。因此，为了更有效地利用小鼠模型来研究人类疾病状态，必须明确并充分考虑两物种之间的差异，并在任何建模范式中予以恰当对待。本文中，我们介绍了一套用于评估人类与小鼠侧脑室及其周围室周组织纵向变化的实验流程。本方案包括对小鼠和人类脑室进行三维重建与容积测量，并利用室周组织整体装片的免疫组织化学分析，以表征细胞排列与组织结构。综合这些方法，可为研究脑室系统及其相关室周组织的变化提供有效手段。

方案

注意：动物实验程序已获得康涅狄格大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。人体组织与数据分析及相关操作均经康涅狄格大学机构审查委员会（IRB）批准并符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。

1. 小鼠：脑室周围细胞完整性的分析及侧脑室的三维建模

1.1）小鼠侧脑室壁全层组织制备

1. 按照先前所述方法制备小鼠侧脑室全 mount 样本用于免疫组织化学（IHC）^16,17。

1.2）侧脑室分析的免疫组织化学

1. 按照先前所述方法固定并切片小鼠脑组织^18,19。
   1. 简言之，通过心脏灌注生理盐水（常温）冲洗小鼠，直至器官变白（颜色变浅表明已清除），随后用常温的含4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，直至组织变硬。
   2. 从颅骨中取出脑组织。使用虹膜剪刀沿颅骨基底部的矢状缝剪开。
   3. 暴露颅骨并用镊子取出脑组织。将脑组织浸入4% PFA固定液中，在4 °C下过夜固定。然后用PBS洗涤3 次，每次20 分钟。
2. 制备连续切片用于免疫组织化学染色和体积分析。
   1. 使用显微手术刀片，在左半球皮层纵向做一小切口，以便在漂浮切片进行免疫染色时区分左、右半球。
   2. 将固定后的脑组织包埋于3%琼脂糖中，以在振动切片过程中提供额外的结构支撑。将3%琼脂糖（w/v）溶于蒸馏水中，使用微波炉或加热板加热至完全溶解。
   3. 用剃刀片在小脑处做冠状切面，切除脑组织尾部，形成一个平整均匀的表面。在组织台上涂抹超级胶水，将脑组织放置于新切面上，嗅球朝上。
   4. 当液态琼脂糖溶液冷却至仅微温时，均匀覆盖整个脑组织，确保完全包埋。待琼脂糖完全凝固。
   5. 在振动切片机上将包埋于琼脂糖中的脑组织进行冠状切片，切片厚度为50 µm，并将切片按顺序依次放入含有PBS的24孔板中，以保持切片顺序。
      注：通常使用12 个孔处理一个脑组织，从侧脑室首次出现前5个切片开始收集组织，起始于A1孔，按数字顺序至B6孔，再循环回到A1孔。此方法可使来自同一脑组织的多个可区分切片在同一孔中处理。对于侧脑室体积分析，当侧脑室与第三脑室融合时停止收集组织，每孔约含3个切片，共约36个切片。
   6. 使用连接20–200 µl微量移液器吸头的移液器吸取PBS，注意避免误吸漂浮切片。在含10% 血清、0.1% Triton X-100（TX）的PBS（PBS-TX）中对漂浮切片进行封闭和通透处理，室温孵育1 小时。每孔加入300 µl溶液以覆盖24孔板中的自由漂浮切片，所有切片孵育步骤均在摇床上进行。
   7. 吸除封闭液，加入一抗，在PBS-TX中4 °C孵育过夜（至少12小时）。若使用冠状切片进行脑室体积描记，可采用抗S100β抗体标记室管膜细胞。
   8. 吸除一抗溶液，用PBS-TX洗涤切片3 次，每次10 分钟。
   9. 在避光条件下，室温孵育1 小时，加入荧光二抗（稀释比例1:1,000），溶于含10%血清的PBS-TX中。后续所有孵育步骤均需保持切片避光。
   10. 吸除二抗溶液，加入含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，10 µg/ml）的PBS溶液，孵育5分钟以复染细胞核。吸除DAPI溶液，用PBS洗涤切片3 次，每次10分钟。
   11. 将切片按顺序贴附于载玻片上，利用皮层标记保持左、右半球的方向性。在避光条件下自然晾干，然后封片：在载玻片上涂抹一层薄的封片介质，轻轻盖上盖玻片。将封片后的载玻片在室温下静置过夜干燥。

1.3）三维侧脑室分割 重建

注意：使用 upright 荧光显微镜结合自动载物台和用于荧光检测的数字 CCD 相机，通过成像软件对侧脑室进行示踪。

1. 打开荧光显微镜设备，并在荧光模式下启动成像软件。打开“显示选项”以加载用于追踪所需的正确工具栏和停靠工具面板。选项>显示选项>配件，选择“Main”和“Marker”工具栏。在同一菜单中，于“Docking Tool Panels”下选择“Camera Histogram”、“Multichannel Control”、“Camera Settings”和“Image Acquisition”。
2. 根据标记侧脑室壁的室管膜细胞的强S-100β荧光，观察脑室的起始位置。确定包含侧脑室的第一块组织。
3. 创建一个新的数据文件，通过在图像窗口中侧脑室左侧上方点击来设定舞台移动的参考点。寻找小切口以区分左半球和右半球。在不同追踪文件中，应将参考点保持在相对于侧脑室一致的位置，以便在导入轮廓进行连续重建时保持对齐。
4. 从轮廓下拉菜单中选择合适的预设轮廓类型， 例如，“左侧侧脑室”。为左侧和右侧侧脑室的轮廓描记分别使用独特的颜色。如果需要更改轮廓名称和颜色，请进入“选项”>显示偏好>轮廓，然后修改轮廓颜色的名称，或选择“添加轮廓类型”。
5. 选择“左侧侧脑室”轮廓后，沿室管膜衬层的顶面点击以开始绘制轮廓。通过持续沿顶面依次点击，完成脑室的轮廓追踪。
   1. 对于需要更精细处理的不规则区域，可单击并按住鼠标左键进行手绘描边。按 Ctrl+Z，或进入选项>撤销以取消上一个轮廓点。使用箭头键移动描迹窗口，或在屏幕外创建一个轮廓点，使窗口自动居中。完成心室描迹后，右键单击并选择“闭合轮廓”。
6. 使用下拉菜单为右侧脑室选择新的轮廓颜色（轮廓类型）。参照左侧脑室的步骤1.3.4，描记右侧脑室。
7. 如果需要更改轮廓名称和颜色，右键单击轮廓并选择“更改轮廓类型”以选择合适的颜色。
8. 沿中线添加标记，以辅助进行三维重建时的连续轮廓对齐。添加标记时，从左侧的“标记工具栏”中选择合适的标记（使用“X”），然后点击 tracing 屏幕以放置标记。在导入每个组织切片轮廓的同时，一并导入标记。
9. 为保存组织痕迹，请选择文件>保存数据文件并创建新文件夹及文件名。为连续切片的轨迹编号，格式为[切片编号]-[组织编号]，以便于识别各轨迹。例如，第二张切片上的第三张组织切片，在每只小鼠大脑的目录中对应的文件名为“2-3”。
10. 对每张脑组织连续切片重复步骤 1.3.4 至 1.3.9，以追踪整个脑内脑室的走行，但需排除脑室壁粘连区域。
11. 如果心室存在粘连区域，则将粘连部位前方的区域与背侧和腹侧区域进行亚区划分。为每个心室创建两种新的轮廓类型例如，“背侧左脑室”和“腹侧左脑室”）。在出现粘连的第一张组织切片上，需同时沿原始侧脑室轮廓以及新的背侧和腹侧轮廓描记侧脑室，以确保能够完成完整的脑室重建。
12. 在室壁粘连的后部切片中，为每个脑室的后部创建一组新的轮廓颜色例如，“左心室后壁”）。使用当前的粘连类型和新的后壁轮廓类型，对该首次重新连接的部分进行双线追踪。

1.4）侧脑室三维重建

1. 对小鼠侧脑室的连续轮廓描记图进行对齐和整合，以生成三维重建图像及体积数据。
2. 打开三维重建程序。点击文件>打开，并选择第一个已描记连续切片的轮廓文件。导入左侧和右侧脑室的轮廓描记图，以及任何添加的标记。
3. 要选择轮廓，请点击“选择对象”按钮（光标图标），按住“Ctrl”键并选中两个脑室及标记。为设定轮廓的Z轴位置，右键点击并选择“修改Z轴位置”。将第一个组织切片设置为0 µm。
4. 为保存重建结果，选择文件>另存数据文件为。每次导入文件后均应保存，以便在出现错误时可轻松恢复至前一个文件。
5. 为将下一个组织切片添加至重建中，点击文件>追加至显示。选择要追加的.DAT文件，并勾选“合并”选项框。
6. 参照步骤1.4.3，再次调整新导入描记文件的Z轴位置。在主窗口中仅选择新添加的左右轮廓，以避免移动其他已有的轮廓。对于50 µm厚的切片，将每个后续描记文件的Z轴位置设置为比前一个轮廓高50 µm。（第一个轮廓：z = 0，第二个轮廓：z = 50，第三个轮廓：z = 100，依此类推）
7. 为调整所选轮廓和标记的X、Y轴位置，请点击“启用鼠标平移”按钮，并拖动轮廓使其与前一片组织轮廓对齐。保持当前描记图中左右轮廓同时被选中，以实现同步移动。
8. 为顺时针或逆时针旋转轮廓以对齐中线标记，请选择“Z轴旋转”按钮。若需沿Y轴翻转轮廓（例如左侧轮廓位于右侧时），请同时选中导入的两个轮廓及标记，右键点击后选择“设置旋转角度”，并在“Y轴旋转”栏中输入“180”。
9. 在保存重建文件前，应确保脑室和中线标记已达到最佳对齐状态，如步骤1.4.4所述。
10. 对每个后续组织切片重复执行步骤1.4.5至1.4.9，直至所有切片均已导入并正确对齐。
11. 要查看序列重建的体积数据，请点击分析>“标记与区域分析”，并选择“3D轮廓汇总”。在左侧面板中选择所有轮廓，然后点击“3D可视化”按钮，以显示最终的三维重建图像。

2. 人类：脑室周围细胞完整性的分析及侧脑室的三维建模

2.1）人类 MRI 数据分析

注意：以下方案旨在创建侧脑室的三维图像重建和容积定量，并通过纵向叠加分析评估随时间推移的容积变化。需特别指出，磁共振数据采集的一致性（例如，设备型号、磁场强度、层厚、方位和分辨率）以及采集后处理的一致性，是数据集纳入分析的极为重要的标准²⁰。

1. 心室分割
   注意：使用 ITK/Snap 对高分辨率 T1 加权磁共振图像中的脑室进行分割。或者，也可使用其他免费软件，如 Freesurfer。
   1. 打开 ITK/Snap，文件 > 打开灰度图像。选择所需文件，并以.nii文件（NITFI文件）格式打开。
   2. 逐个浏览每个解剖平面，注意心室异常（狭窄区域、扩大或缩小的颞角）， 等等。）。在主工具栏中点击“Snake ROI 工具”，点击“分割 3D”，选择“强度区域”选项。
   3. 点击“预处理图像”。选择“高于”，以包含低于特定强度阈值的区域，从而以白色突出显示感兴趣区域（ROI）。使用滑动条记录最大强度值。将阈值设为最大强度的15%（记录该数值）。将平滑度参数设为10。点击“确定”，然后点击“下一步”。
   4. 向每个脑室添加10–12个小型（2号）“气泡”：前额角2个，侧脑室体部上表面均匀分布7个，枕角1个，侧脑室颞角1个。“选择参数”并将曲率力设置为0.4。点击播放符号以开始主动轮廓演化。
   5. 单击“更新网格”以显示表面；勾选“自动更新”。当侧脑室的所有区域均已被包含在感兴趣区域（ROI）内时，停止分割。注意避免将第三脑室纳入。单击“完成”。
   6. 如有必要，通过以下方法手动编辑图像以去除不需要的区域（通常需要擦除第三脑室的泄漏）。手动使用“3D 刀具”去除多余区域，或手动使用“画笔”工具，并将“清除标签”设为活动绘制标签，以擦除感兴趣区域以外的任何包含部分。
   7. 将分割结果保存为 .nii 图像（“NIFTI” 文件格式）。
   8. 为获得总体积室容积，选择“分割”>体积与统计；使用设定的颜色标签获取脑室的总体积。
2. 基于MRI扫描的侧脑室纵向表征
   注意：使用 Mango 软件，通过叠加纵向 ROI，可对受试者随时间推移的脑室体积变化进行定性和定量展示。
   1. 打开 Mango。点击 文件>将第一个 ROI 时间点（基线）的 ROI 加载为绿色。文件>将第二个 ROI 时间点的 ROI 加载为红色。通过选择文件保存纵向叠加图像>另存为；将每张图像命名为“文件名_[第一个时间点年龄]-[第二个时间点年龄].nii”。
   2. 打开 ITK-SNAP。通过选择“分割”将合并的 ROI 重新作为“灰度图像”打开>从图像加载>合并的 ROI 文件。要获取纵向体积数据，请运行以下操作：分割>体积与统计学>标签1（红色）= 扩张体积；标签2（绿色）= 狭窄体积；标签3（蓝色）= 基础体积

2.2）人脑室周围组织制备与分析

1. 使用人体组织的安全操作指南
   1. 获得适当的安全培训（例如血液传播病原体课程
   2. 遵守标准（通用）安全预防措施。佩戴手套。在接触任何非一次性共用设备或表面之前更换手套。对在处理人体组织时常规接触的物品，应标注“仅用于人体组织”标识。
   3. 所有接触人体组织的物品均须遵循去污规范。废弃前，受污染液体须用漂白剂处理至少24小时；受污染的表面须用浸透漂白剂的毛巾擦拭处理，例如，台面）或通过将物体直接放入漂白剂中（例如 镊子）
   4. 制定与人体组织直接接触皮肤时的应急预案，可包括用漂白剂浸泡纸巾并敷于受污染区域（5-10 分钟）。
   5. 所有接触人体组织的物品均应按照适当的废弃物处理规定进行处置。
2. 侧脑室整体封片制备
   1. 从一个完整的半脑开始（固定于10%甲醛中） 用大刀将整个半球切成1.5 cm厚的冠状切片，并用0.1 M PBS充分冲洗。
      注意：所有固定方案均需预先验证抗体。
   2. 从包含侧脑室的第一张切片开始，由前至后标记各切片。采用字母数字标记系统，按前后顺序用字母标记切片（从前到后），并 自上而下按编号进行亚区划分。避免损伤室管膜表面。
   3. 使用显微外科手术刀解剖心室壁，深度达1 cm，保持侧壁完整连续。根据需要将心室壁分割成适合染色孔大小的组织片段。在心室壁对侧做切口标记，以识别上下方位。
   4. 使用双层锅在100 °C下将组织切片于10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中孵育10–20分钟以进行抗原修复（最佳孵育时间需通过实验确定）。用PBS/0.1%Triton X-100（PBS-TX）冲洗3次。
   5. 用含10%马血清的PBS或PBS-TX溶液在室温下封闭1小时。
   6. 在 4 °C 下用一抗孵育 48 小时。为观察脑室壁衬里，对整体样本进行免疫染色，使用以下抗体组合：小鼠抗 β-catenin 抗体（1:250）；山羊抗 GFAP 抗体（1:250）；兔抗 AQP4 抗体（1:400）。
   7. 所有后续步骤均需在避光条件下进行。用 PBS 清洗组织 3 次，加入二抗（1:500）于 4 °C 孵育 24 小时或室温孵育 2 小时，再用 PBS 清洗 3 次。室温下用 DAPI 孵育组织 7 分钟，随后再用 PBS 清洗 3 次。
   8. 用石蜡包埋底皿，表面覆盖一层Parafilm。向皿中加入PBS，用精细镊子将组织放入皿中，注意避免接触室管膜壁，以备最终解剖。
   9. 在解剖显微镜下，用固定针将组织侧向牢固固定。使用22.5°显微外科刺刀式刀片，切取侧脑室壁均匀的薄片（厚度约300 µm）。对于较大组织块或弯曲度较大的组织，应先切成较小的立方体，再进一步切为最终用于封片的切片，并记录其位置。
   10. 用精细镊子将解剖好的脑室膜组织腹侧朝上小心放置于载玻片上，注意记录组织在载玻片上的区域位置和方向。在组织上覆盖一层薄薄的Aquapolymount，注意避免产生气泡。将盖玻片盖在组织上，必要时添加适量Aquapolymount，以填充盖玻片下的任何空隙。
   11. 将贴片样本置于避光干燥处，在室温下放置2-3天。随后存放在载玻片盒中，于4 °C保存。
3. 免疫组织化学与组织学分析
   1. 使用共聚焦显微镜观察荧光免疫组织化学结果时，根据β-catenin（室管膜细胞顶端黏附连接蛋白的标记物）的定位，将成像焦平面设定在脑室表面。勾画室管膜细胞覆盖区域以及表面星形胶质细胞增生区域（脑室表面GFAP染色）。
   2. 为记录并拼接整个心室表面，需使用重叠的图像覆盖全部表面。要创建连续图像的拼接图，打开 Adobe Photoshop，选择“文件”>自动化>合并图像>交互式布局用于选择要叠加的图像，并在必要时进行手动调整。
   3. 新建图层以追踪拼接图像，生成完整室管膜细胞覆盖或脑室表面胶质增生的卡通示意图。对每张切片或感兴趣区域（ROI）重复此步骤。整合所有切片，重建脑室壁图谱，并与MRI重建图像上的相应区域进行关联。

结果

基于免疫染色的50 µm冠状切片及三维重建结果对小鼠侧脑室进行轮廓追踪（图3），可在以小鼠为疾病或损伤模型的不同实验范式中获取体积数据。该操作的关键在于排除侧脑室壁相互贴附的区域。通过对脑室区域进行分段，并为每个区域指定不同颜色（图3C），可整合连续切片，进而根据整合后的分段计算各区域及总体积。

可结合脑部 MRI 扫描与侧脑室的半自动分割（ITK-SNAP）进行三维重建，开展类似的研究。为了直接配对脑室体积与脑室周围组织分析，需对生前或死后 MRI 扫描图像进行分割并配准，以生成三维重建图像（图 4）。若具备纵向 MRI 扫描数据，可将多个时间点的三维重建图像进行配准与叠加，以分析脑室随时间的扩张情况（图 5）。纵向分析可提供未来免疫组织化学分析中特别关注的区域信息。对相应组织进行免疫组织化学分析，以揭示脑室表面星形胶质细胞增生区域与完整室管膜细胞单层的分布情况（图 6A）。采集组织图像后拼接成全景图，以覆盖大面...

讨论

我们提供可用于评估小鼠和人类大脑室系统完整性的工具和方案。然而，这些工具也可应用于其他因损伤、疾病或衰老过程而发生变化的脑结构或器官系统。 ^14,21,22. 所介绍的策略利用了能够对横断面和纵向 MRI 序列进行配准的软件，以生成特定区域或感兴趣结构的三维体积图像。纵向 MRI 序列可整合随时间变化的三维体积改变，还可进一步扩展用于分析全脑体积、侧脑室与全脑体积的比值，和/或其它脑部结构例如,丘脑下核 ²³ 或使用扩散加权张量成像技术分析胼胝体白质纤维束。结合多种方法，可对脑结构变化进行系统性分析。最终，为评估与年龄及疾病相关的脑结构改变，需整合多种多模态成像技术，以全面准确地反映脑健康状况 ²⁴对关键结构数据的记录与汇总，以及受试者间变异性和跨受试者变异范围的分析，理想情况下可用于构建超高场磁共振成像图谱，以最优地指导临床对健康或疾病状态下组织的诊断。

为了降低受试者间和受试者内数据集在采集和处理过程中的变异性，有几个关键步骤需要注意。理想情况下，为了获得匹配的数据序列，整个研究过程中应使用相同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	21600-069
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	19210	使用浓度为 PBS 中 4%，4 °C
正常马血清	Life Technologies	16050	PBS-TX 中 10%（v/v）
正常山羊血清	Life Technologies	16210	PBS-TX 中 10%（v/v）
吐温-100（TX）	Sigma-Aldrich	T8787	PBS 中 0.1%（v/v）
振动切片机	Leica	VT1000S
荧光显微镜	Zeiss	Imager.M2
相机	Hamamatsu	ORCA R2
显微镜载物台控制器	Ludl Electronic Products	MAC 6000
体视学软件	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
体视学软件	ImageJ/NIH	NIH 免费软件
三维重建软件	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP2
MRI 软件
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	分割与体积分析
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		分割与体积分析
多图像分析图形用户界面（Mango）	http://ric.uthscsa.edu/mango/		纵向叠加
整体封片设备
22.5° 微型外科直刺刀	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
蜡底解剖皿
解剖针
精细镊子
水性封片剂（aquapolymount）
解剖显微镜	Leica	MZ95
整体封片抗体
小鼠抗 β-catenin 抗体	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
山羊抗 GFAP 抗体	Santa Cruz Biotechnology		1:250
兔抗 AQP4（水通道蛋白-4）抗体	Sigma-Aldrich		1:400
冠状切片抗体
抗 S100β 抗体	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Life Technologies	D-1306	10 µg/ml PBS 溶液