本文演示了使用激光捕获显微切割技术，通过直接或间接免疫组织化学方法分离单个多巴胺能神经元或腹侧被盖区。讨论了使用红外激光从玻璃载玻片上分离组织，以及结合红外和紫外激光从膜载玻片上分离组织的参数。
本文内容
摘要
摘要
激光捕获显微切割（LCM）用于从载玻片上的组织切片中分离出特定的单个细胞群体或精确的解剖区域。当与免疫组织化学结合使用时，LCM可根据特定蛋白质标记物分离出特定类型的单个细胞。本文描述了利用LCM技术收集经特异性标记的多巴胺能神经元特定群体的方法。 酪氨酸羟化酶免疫组织化学用于分离腹侧被盖区含多巴胺能神经元区域，该方法通过在用于激光捕获显微切割（LCM）的切片相邻节段上进行间接酪氨酸羟化酶免疫组织化学实现。采用红外（IR）捕获激光将单个神经元以及腹侧被盖区从玻璃载片上切割下来，并转移至LCM收集帽中进行分析。组织必须使用100%乙醇和二甲苯进行彻底脱水，此步骤至关重要。当使用PEN膜载片时，结合使用IR捕获激光与紫外（UV）切割激光，可实现对单个多巴胺能神经元或腹侧被盖区的分离。相较于玻璃载片，PEN膜载片具有显著优势：细胞捕获与收集的一致性更好，收集大块组织的速度更快，对脱水步骤的依赖性更低，并能实现组织从载片上的完全移除。尽管从玻璃载片上移除大面积组织是可行的，但该过程耗时明显更长，且常残留部分组织。本文展示的数据表明，通过上述操作流程可获得足够数量和质量的RNA，用于定量PCR检测。尽管RNA和DNA是从LCM采集的组织和细胞中最常分离的分子，但microRNA、蛋白质以及DNA表观遗传修饰的分离与检测同样可受益于LCM所提供的更高解剖与细胞分辨率。
引言
所有组织均由异质性细胞群体构成。这一点在脑组织中尤为显著，脑组织包含多种在形态学和/或神经化学上各不相同的神经元，这些神经元被多种类型的胶质细胞（少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞）所包围。此外，脑内不同区域，如大脑皮层的各个区域或脑干核团，具有特定的功能。因此，结合分析技术，能够分离出特定的细胞群体或解剖学上极为微小且界限清晰的区域，即，定量PCR、微阵列、RNA测序和蛋白质组学），可显著增进对多种生物过程的理解。激光显微切割（LCM）是一种能够从显微镜载玻片上的组织中分离出非常微小的解剖区域或特定细胞的技术，从而为后续分析RNA、微小RNA（microRNA）、DNA和蛋白质等各类分子提供更为均一的样本来源。
自从激光显微切割（LCM）技术首次被提出以来，已有多种不同的方法用于从组织中进行细胞的显微分离1-3。早期的方法包括使用红外（IR）激光和热塑性膜将组织直接附着在载玻片上，以及采用非接触式紫外（UV）切割激光将细胞或组织分离后收集到管中。随后，LCM技术已成功应用于多种组织和细胞类型，并被证实可兼容下游多种分子的分离分析，包括RNA、microRNA、DNA和蛋白质，以及酶活性检测1,4-7。本文所展示的LCM操作使用一种配备UV切割激光和IR捕获激光的LCM系统，分别用于切割目标细胞或组织周围区域，并将其附着至LCM帽上。该LCM系统利用IR捕获激光使覆盖在帽上的塑料膜熔化，覆盖于目标细胞或组织之上，从而将细胞黏附至塑料膜，并在移除帽时将目标区域从组织中取出（图1）。此外，结合IR激光，还可使用UV激光对载玻片上带有膜的组织进行切割，分离出感兴趣的组织或细胞，再通过IR激光将目标组织黏附至LCM帽上实现分离（图2）。这些技术的简要概述见于图1和图2。
本文描述了该技术的多种改进方法，可用于通过直接荧光免疫组织化学方法分离特定细胞，或采用间接免疫组织化学引导的技术分离基于特定蛋白表达的组织区域。具体展示了从黑质中分离多巴胺能神经元、分离腹侧被盖区，以及从新鲜冷冻脑组织中后续提取RNA的方法。由于RNA是所检测分子中最为不稳定的（与DNA或蛋白质相比），文中包含了有助于保持RNA完整性的操作步骤，并展示了所获得RNA的数量与质量数据。
方案
注意：小鼠脑组织的使用遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》，研究方案已获密西西比州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 载玻片和组织的制备
- 使用硅烷预处理载玻片或聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜玻璃载玻片。
- 进行RNA提取时，将载玻片浸入RNase去污染溶液中，用无RNase水洗涤3次，然后用梯度浓度的无RNase乙醇脱水，并在真空中干燥30分钟。
- 使用冷冻切片机切割厚度为10 µm的组织切片，并将其贴附于预先处理好的无RNase载玻片上。在切片过程中保持组织处于冷冻状态，以维持RNA质量。
注意：确保组织距离载玻片边缘约4 mm，因为激光显微切割（LCM）无法切除过于靠近载玻片边缘的组织。若需从PEN膜载玻片上切除组织，请确保组织距离载玻片左侧、顶部和底部边缘4 mm，右侧边缘7 mm，此为未与载玻片粘连的膜区域的尺寸范围。 - 若通过直接免疫组织化学法分离特定细胞群体，可将组织切片贴附于硅烷预处理载玻片或PEN膜载玻片上。若采用间接免疫组织化学引导技术分离组织区域，则应将一组切片贴附于硅烷预处理载玻片用于免疫组织化学染色，而交替的切片则贴附于PEN膜载玻片和/或硅烷预处理载玻片，用于后续激光显微切割（LCM）。
2. 激光显微切割组织准备——用于直接捕获免疫反应性细胞的快速酪氨酸羟化酶免疫组织化学
- 用疏水性笔勾画组织轮廓，并使其干燥。
- 将组织在 -20 °C 的丙酮-甲醇（1:1）溶液中固定 10 分钟。
注意：我们的经验表明，与单独使用丙酮或甲醇相比，丙酮-甲醇固定可获得更稳定的免疫组织化学结果。 - 用含 1% Triton（无 RNase）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片。
- 在切片上加 100–200 µl 含 1% Triton 的 PBS，其中加入 1:100 稀释的酪氨酸羟化酶抗体和 400 U/ml RNasin。孵育 5–10 分钟。
- 用 PBS 快速冲洗两次，再用 PBS-1% Triton 冲洗一次。
- 在组织上加 100–200 µl PBS-1% Triton 溶液，其中含 1:100 稀释的 Alexa Fluor 488 标记的 goat anti-Rabbit IgG 抗体、400 U/ml RNasin 和 50 ng/ml DAPI。孵育 5 分钟。
- 用 PBS 冲洗两次，然后在无 RNase 的梯度乙醇（75%–75%–95%–95%–100%–100%）中各脱水 30 秒。
- 在二甲苯中分两次洗涤，第一次 1 分钟，第二次 5 分钟。
- 在进行激光显微切割（LCM）前，立即将载玻片从二甲苯中取出，并使其自然晾干。
3. 激光捕获组织制备——酪氨酸羟化酶免疫组织化学用于间接激光捕获免疫反应区域
- 使用与经硅烷预处理或PEN膜载玻片上相邻切片配对的切片进行免疫组织化学染色。
注：此处使用的步骤与先前报道的方法相似5。示例图像中采用二氨基联苯胺（DAB）显色反应来显示目标酪氨酸羟化酶神经元。 - 用于激光显微切割（LCM）的载玻片，在4 °C下用100%丙酮固定5分钟。
- 用梯度浓度的无RNase乙醇（75%-75%-95%-95%-100%-100%）对组织脱水，每步1分钟。
- 在二甲苯中分两次洗涤，分别持续1分钟和5分钟。
- 在进行激光显微切割（LCM）前，立即从二甲苯中取出载玻片，并使其自然晾干。
4. 使用激光显微切割系统
注意：LCM 应用程序包含 10 个工具栏和 2 个窗口，用于控制显微切割过程。工具栏：1. 显微镜，2. 捕获激光，3. 切割激光，4. 研究，5. 导航，6. 材料，7. 捕获组，8. 显微切割，9. 字体，10. 注释。窗口：1. 实时视频和 2. 路径图。
- 在 LCM 系统软件的“Materials”工具栏中选择“Open door”选项，以打开设备门。
- 将载玻片加载到三个可用的插槽中。本演示中，分别加载一张使用 DAB 显色的酪氨酸羟化酶免疫组化切片、一张 Silane-prep 载玻片和一张用于快速荧光酪氨酸羟化酶免疫组化的 PEN 膜载玻片。在典型实验中，可使用未标记的丙酮固定切片，并配以 DAB 显色标记酪氨酸羟化酶的参考切片，或直接使用荧光标记酪氨酸羟化酶的切片用于激光显微切割。
- 将 LCM 收集帽装入可用插槽。
注意：可选用 Macro 或 HS 型 LCM 收集帽。所选收集帽类型取决于待收集的细胞数量或组织量。Macro 收集帽最多可收集数千个细胞，而 HS 收集帽可收集数百个细胞。Macro 收集帽可收集更多组织，但需使用 50 µl 裂解缓冲液；HS 收集帽配合适配器使用时仅需 10 µl 裂解缓冲液，有助于提高 RNA 的相对回收率。 - 关闭设备门。
- 加载载玻片以激活“Road Map”窗口，该窗口提供载玻片的全貌视图，便于选择感兴趣区域（图 3）。通过“Live video”窗口查看 Road Map，以导航至目标区域。
- 在“Materials”工具栏中，通过勾选载玻片插槽上方的复选框来识别 PEN 膜载玻片。为设置收集帽属性，右键点击“Materials”工具栏中的收集帽，选择“Cap supply properties”，勾选指示收集帽位置的选项，并选择 Macro 或 HS 收集帽。
- 在“Microscope”工具栏中选择“Fluorescence”选项，以开启荧光灯并使其预热。使用蓝色和紫外（UV）滤光片分别观察 Alex Fluor 488 和 DAPI 荧光信号。使用“Adjust Camera”选项提高图像灵敏度，以便观察荧光标记的细胞。
- 在“Materials”工具栏中，右键点击一个收集帽并将其移动至目标载玻片。在 Road Map 中双击某一位置，以选择在 Live Video 窗口中显示的区域。通过在 Road Map 上选择区域（双左键点击），然后右键点击并选择“Place cap at center region”，可在载玻片上移动收集帽。
- 在使用红外捕获激光前，需先校准并调节其强度。将收集帽移至载玻片上无组织的区域。在“Capture Laser”工具栏中选择“Enable”，调节激光的功率（3–100 mW）、脉冲时间（100–1000000 µsec）和击发次数。当收集帽位于无组织区域时发射红外激光，并检查激光是否足以熔化 LCM 收集帽的膜。
注意：此过程称为“润湿”，即熔化收集帽上的聚合物膜，使其与玻璃载玻片接触。充分润湿的表现为在载玻片上形成一个中心透明、边缘呈深色环状的融合区域（参见 图 4 中充分与不充分熔化的示例）。若润湿不充分，需调整功率和脉冲参数，并再次测试发射，直至达到理想效果。此外，也可采用多次激光击发。 - 调节好红外激光强度后，右键点击并选择“Capture laser is here”以校准激光位置。
注意：此步骤用于告知计算机红外捕获激光在组织上的具体位置。该激光校准步骤至关重要，每次移动收集帽或更换物镜时均需重复执行。
5. 从硅烷预处理载玻片上激光捕获单个多巴胺能神经元
- 移动至目标区域以捕获细胞。
注意：此处以分离多巴胺能神经元为例。 - 若要从硅烷预处理载玻片上捕获单个细胞，请在显微切割工具栏中选择“LCM”选项卡，然后点击“单点”图标。
- 在显微镜工具栏中，使用“快门”选项卡在荧光和明场之间切换，并使用荧光滤光片选项卡选择合适的滤光片，通过物镜选项卡更改放大倍数。当目标细胞在实时视频窗口中可见后，调整用于标记目标细胞的光斑大小，使其接近细胞的实际尺寸。具体操作为：点击捕获激光工具栏中的“光斑”选项卡，然后点击染色细胞的一侧，再点击其对侧。
注意：系统将据此计算光斑直径并显示数值。 - 在选中“单点”图标的前提下，通过点击目标细胞对其进行标记，为每个细胞放置一个光斑标记。此处使用蓝色滤光片和10倍物镜观察多巴胺能神经元。按照步骤4.9和4.10所述，重新测试并将红外激光对准载玻片上无组织覆盖的帽膜区域。
- 完成细胞标记后，在显微切割工具栏中选择“开始—切割并捕获”选项卡，红外激光将自动对所有已标记的细胞进行激发。此外，如有需要，也可手动在任意目标位置触发红外激光（图5D）。
- 将帽膜从组织切片区移开，移至载玻片的空白区域，检查细胞是否已成功捕获至LCM帽膜上。确认目标细胞已从载玻片上移除（图5B, E），并附着于LCM帽膜上（图5C, F）。通过点击显微镜工具栏中的“捕获图像”选项卡记录此过程。
- 完成组织收集后，通过右键点击帽膜，选择“移动至”，然后选择“卸载”以移除帽膜。
6. 从PEN膜载玻片上激光捕获单个多巴胺能神经元
- 为了使用红外（IR）和紫外（UV）激光从PEN膜载玻片上捕获单个细胞，请在显微切割工具栏中选择“切割与捕获”选项卡。选择“单点”选项卡以标记目标细胞。使用“切割线”选项卡逐个勾勒每个细胞的轮廓。务必按照步骤4.9和4.10所述测试红外激光，并测试紫外激光，以确定能够穿透PEN膜和组织所需的最小激光强度（图4和图5）。
- 在显微切割工具栏中选择“捕获与切割”选项卡。使用该技术收集单个细胞时，务必先触发红外激光，再触发紫外激光，因为如果在细胞被固定到激光捕获显微切割（LCM）帽之前就将其切下，这些微小组织片段可能会丢失。
注意：此过程也可手动完成，即先在目标位置触发红外激光，再用紫外激光逐个勾勒细胞轮廓。 - 收集完目标细胞后，按照上述步骤5.7所述移动LCM帽，以确认细胞是否已被移除并附着在帽上（图6）。
- 完成组织收集后，通过右键点击帽并选择“移动至”，然后选择“卸载”，将帽移除。
7. 从硅烷预处理载玻片上获取腹侧被盖区
- 为确定目标区域，请使用已进行免疫组织化学处理的切片。
注意：本演示中分离的是腹侧被盖区（图7A）。 - 装载激光显微切割（LCM）帽，并按照步骤4.9和4.10测试激光器。
注意：通常使用Macro LCM帽，但也可使用HS帽（见图8）。 - 为从硅烷预处理切片中分离特定组织区域（即 腹侧被盖区），请在显微切割工具栏中选择“LCM”选项卡，然后选择“polygon-exterior”选项卡。在实时视频窗口中勾画出目标区域的轮廓。根据待收集区域的大小，可在低倍镜（2X物镜）下完成轮廓勾画。然而，仪器在实际收集时将使用10X物镜，因此在捕获前应切换至10X物镜，并调整红外激光的聚焦与瞄准。
- 在显微切割工具栏中选择“Go - capture and cut”选项卡。
注意：计算机将自动在整个选定区域内发射红外激光（图7F,I）。若LCM膜在该区域内未充分熔融，可手动再次发射激光，或重复整个过程。 - 将LCM帽移离组织，以评估组织收集的效果。
注意：采用此方法进行一次切割通常会残留部分组织在切片上（见图7G）。若出现此情况，请重复上述选择与捕获步骤。重复操作可提高所收集的组织量（图7J）。 - 完成组织收集后，通过右键单击帽体并选择“Move to”，然后选择“Unload”，卸载帽体。
8. 从PEN膜切片中捕获腹侧被盖区
- 以上述经免疫组织化学处理的切片作为参考，从 PEN 膜切片的组织上选择目标区域。
- 在显微切割工具栏中选择“Cut and Capture”选项卡，然后选择“Cut Line”选项卡，并以免疫组织化学标记的切片为参考，勾画出目标区域。
注意：程序将自动添加红外激光附着组织至帽盖的位点。可使用“single point”选项卡添加额外位点，以更牢固地将组织固定在帽盖上。 - 在 10X 物镜下，按照 4.9 和 4.10 步骤测试并校准红外和紫外激光。验证紫外激光能否穿透切片上的膜，并确认切割位置与计算机屏幕上的位置一致。使用的紫外激光强度应恰好足以切割膜和组织，但不损伤组织（图 5）。
- 在显微切割工具栏中选择“Go - capture and cut”选项卡。
注意：计算机将自动在组织内所有标记位点发射红外激光，使组织附着于帽盖，随后发射紫外激光切割切片上的 PEN 膜及组织（图 7C）。为充分将组织固定在 LCM 帽盖上，可能需要额外的红外熔融位点，也可手动添加。 - 将 LCM 帽盖移离组织，以确认组织是否已从切片上移除（图 7C）并成功附着于帽盖（图 7C）。
- 完成组织采集后，如需取下帽盖，可右键点击帽盖，选择“Move to”，然后选择“Unload”。
9. RNA 的提取
- 为从捕获的细胞或组织中收集 RNA，将 LCM 帽膜在 RNA 裂解缓冲液中于 37 °C 孵育 30 分钟。
注意：对于 HS 帽，可使用一种适配器，使帽上仅需使用 10 µl 裂解缓冲液，并可连接至 0.5 ml 微离心管。Macro 帽则需要 50 µl 裂解缓冲液，并可直接连接至 0.5 ml 微离心管。 - 孵育后，将裂解缓冲液离心至 0.5 ml 微离心管中。
- 为确保所有细胞或组织完全裂解，将 LCM 帽的膜剥离并放入裂解缓冲液中。
- 为检测 RNA 完整性，可使用 LCM 后载玻片上残留组织中分离的 RNA 来测定 RNA 完整性。
注意：由于 LCM 获得的样本 RNA 量有限，通常难以对 LCM 分离的 RNA 进行完整性检测；然而，残留组织中的 RNA 可有效反映因固定、免疫组织化学染色及 LCM 操作过程耗时所导致的 RNA 降解情况。
结果
显微照片中的 图6 和 7 展示分离单个多巴胺能神经元的能力。目前的解剖学分辨率约为 5-10 µm LCM帽上可稳定产生的最小斑点尺寸用于分离细胞，而分离特定细胞类型的唯一限制在于能否对细胞进行可视化识别。尽管LCM能够分离单个多巴胺能神经元，但很可能会混入邻近未标记细胞的部分污染。因此，最终样品为富集的多巴胺能神经元群体，而非完全纯化的多巴胺能神经元群体。该技术还可用于分离脑内特定的小范围组织区域，例如分离腹侧被盖区所示的离散核团或脑区。已有文献报道证实了该技术在脑组织中的应用，以及用于从正常组织中分离病理组织。5,11.
由于使用激光显微切割（LCM）分离的细胞和组织最常见的用途是进行RNA分析，因此所介绍的实验步骤已优化以保持RNA的完整性。为了确定LCM后残留RNA的质量，采用基于二氧化硅的离心柱法从载玻片上的组织中提取RNA，这些组织经过快速酪氨酸羟化酶荧光免疫组织化学染色或丙酮固定处理。通过检测RNA质量，并与商业来源的全脑RNA质量数值进行比较（图9），发现用于LCM的组织样本中，经免疫组织化学染色（RIN值不可用）后再行丙酮固定的样本RNA质量下降（RIN为2.6），相较于全脑RNA（RIN为8.2），其28S rRNA峰相对于18S rRNA峰的高度明显降低。然而，这些RNA样本仍保留了18S和28S条带，并可通过定量PCR（Q-PCR）检测基因表达。
为了测定通过激光显微切割（LCM）获取的神经元中RNA的得率，从经硅烷预处理的载玻片上分离了腹侧被盖区的多巴胺能神经元（分别为50、100和200个多巴胺能神经元）。采用基于二氧化硅的离心柱法提取RNA，并测定RNA含量。根据标准曲线计算，从50、100和200个多巴胺能神经元中分别获得17.3、24.8 pg和50.9 pg/µl的RNA（图10A）。为通过定量PCR（Q-PCR）测定RNA含量，将不同浓度的全脑RNA及多巴胺能神经元来源的RNA进行逆转录，并按先前所述方法5检测β-actin基因的表达水平。根据这些测定结果，从50、100和200个多巴胺能神经元中分别计算出3.55、6.82和20.58 pg/µl的RNA浓度（图10B）。
为了比较多巴胺能神经元的分离与通过激光显微切割技术（LCM）分离整个腹侧被盖区的效果，采用定量PCR（Q-PCR）检测了这两类样本中多巴胺能神经元特异性基因（Nurr1、酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体）的表达水平，并与β-actin的表达进行比较（图11）。由于目标基因浓度越高，产生的Ct值越低，因此ΔCt值的降低表明相对于β-actin，多巴胺能神经元特异性基因的表达水平升高。这说明分离单个多巴胺能神经元可富集其特异性基因的表达。而在腹侧被盖区的整体样本中，由于同时收集了其他细胞（如非多巴胺能神经元和胶质细胞），这些细胞表达β-actin但不表达多巴胺能神经元基因，从而稀释了多巴胺能神经元特异性基因的信号。
图1. 使用红外（IR）捕获激光进行激光捕获。 微小的塑料LCM帽底部带有一层膜，将其置于固定在玻片上的组织上方（步骤1）。当确定目标组织或细胞后，红外捕获激光穿过LCM帽，在膜上熔融出一个小凹坑，使其与下方的组织/细胞粘附（步骤2）。当移除LCM帽时，组织便从显微镜玻片上被分离，并仍附着在LCM帽上。
图 2. 使用红外（IR）捕获激光和紫外（UV）切割激光进行激光捕获。 为了获取更大面积的组织或利用紫外激光更便捷地回收细胞，组织样本被固定在带有膜的载玻片上，该膜通过载玻片外侧边缘与之连接（PEN 膜载玻片）。将 LCM 帽置于组织上方，使用 IR 捕获激光熔化帽膜，使组织附着于 LCM 帽上（步骤 1 和 2）。随后使用 UV 切割激光穿透载玻片膜和组织（步骤 3 和 4），当移除帽时，组织便从载玻片上分离并保留在 LCM 帽上（步骤 5）。
图3. 激光显微切割系统路线图。 该激光显微切割系统可同时容纳3张载玻片。当载玻片装入显微镜后，会为每张载玻片生成低倍率的路线图图像。在路线图图像上选择某一区域，即可将实时图像窗口移至该区域。为演示目的，将小鼠中脑以10 µm厚度切片并贴附于3张载玻片上。第一张载玻片使用二氨基联苯胺作为显色剂，进行酪氨酸羟化酶免疫反应标记（A）。切片可贴附于硅烷预处理载玻片（B）或PEN膜载玻片（C）上。这两类载玻片均采用快速荧光酪氨酸羟化酶免疫组织化学法进行标记。C图中的箭头指示PEN膜与玻璃载玻片的粘附边界。在此边界之外的组织无法通过激光显微切割获取。
图 4. 使用红外捕获激光。 红外捕获激光用于熔化激光显微切割（LCM）帽膜，使组织附着于LCM帽上，并将其从其余组织中分离。红外捕获激光必须具备足够的强度，以充分熔化LCM帽膜，使其与下方的组织和玻片接触。上图显示了激光强度不足以将膜熔接到玻片的情况（左侧两个斑点）。当熔化的膜接触到玻片时，可观察到较粗的黑色轮廓（右侧斑点）。可通过调节激光的功率（3–100 mW）、脉冲时间（100–1,000,000 µsec）以及击发次数（# Hits）来调整激光强度。此外，在同一位置重复发射红外激光也可进一步熔化膜。每次移动LCM帽或更换物镜时，均需重新调整红外激光的瞄准。比例尺 = 100 µm。
图 5. 使用紫外切割激光。 紫外切割激光用于切穿 PEN 膜和组织。在使用前需确定能够切穿膜和组织的最低激光强度，因为紫外激光可能对组织造成损伤。上方显示了三个不同紫外激光强度的照射点（箭头所示），左侧光斑大小适用于 10 µm 的切片，中间光斑适用于较厚切片，右侧光斑则显示了过高的紫外激光强度。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6. 利用红外激光直接分离酪氨酸羟化酶免疫反应性神经元。 快速荧光标记酪氨酸羟化酶后显示多巴胺能神经元（A）。当红外激光发射，使显微切割帽膜在这些神经元上方熔化（D），移除帽膜即可将这些细胞从载玻片上剥离（B, E）。这些神经元随后可被观察到附着在显微切割帽上（C, F）。比例尺 = 250 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7. 利用红外和紫外激光直接从PEN膜载玻片中分离酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元。 上图显示酪氨酸羟化酶标记的神经元（A）。这些神经元可通过红外激光附着至激光捕获显微切割（LCM）帽上，并利用紫外激光从PEN膜载玻片上切割下来（B）。比例尺 = 250 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8. 利用酪氨酸羟化酶免疫反应性间接分离腹侧被盖区。 使用标准免疫组织化学技术在切片中可视化腹侧被盖区中多巴胺能神经元的位置（A 和 E）。该免疫组织化学染色切片被用作模板，以在未染色的相邻切片中定位腹侧被盖区（B 和 F）。利用紫外激光，通过红外激光将腹侧被盖区黏附至激光显微切割（LCM）帽上，并用紫外激光从载玻片上切割下来（C 和 D），图中显示其已附着于HS LCM帽上（D）。还展示了仅使用红外激光从硅烷预处理载玻片上分离出的腹侧被盖区组织附着于Macro帽上的情况（F-K）。请注意，采集该区域大部分组织通常需要多次操作（比较 G 和 J）。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图9. RNA质量。 商业来源的全脑RNA（A）、经丙酮固定并进行激光显微切割（LCM）后提取的切片RNA（B），以及经快速荧光酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色后进行LCM提取的RNA（C）的代表性电泳图谱及其对应的凝胶图像。尽管经过免疫组织化学处理的切片RNA质量较全脑RNA有所下降，但电泳图谱显示rRNA的S18和S28峰仍清晰可见，表明RNA大部分保持完整。全脑RNA浓度为6.487 pg/µl，RIN值为8.2；丙酮固定组织RNA浓度为5.036 pg/µl，RIN值为2.6；免疫组织化学处理后获得的RNA浓度为4.474 pg/µl，RIN值不可用。
图10. RNA含量。 为确定通过激光显微切割（LCM）获得的神经元中RNA的含量，使用荧光分光光度计和定量PCR（Q-PCR）建立了RNA浓度的标准曲线。在荧光分光光度计测量结果（A）中，大图显示了较高范围的RNA含量，小图则显示该检测方法的灵敏度可低至10 pg/µl。从50、100和200个多巴胺能神经元中提取的RNA浓度分别为17.3、24.8和50.9 pg/µl。使用Q-PCR测量RNA含量（B）时，从50、100和200个多巴胺能神经元中提取的RNA浓度分别为3.55、6.82和20.58 pg/µl。
图11. 通过分离单个多巴胺能神经元获得的多巴胺能神经元特异性基因的表达浓度。 图中显示了使用激光显微切割技术（LCM）分离的腹侧被盖区（ventral tegmental area）单个多巴胺能神经元样本中，多巴胺能神经元特异性基因（Nurr1、酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体）与β-actin之间的Ct值差异（ΔCt），并与整个腹侧被盖区组织切片样本中的表达水平进行比较。由于目标基因浓度越高，所得Ct值越低，因此ΔCt值的降低表明相对于β-actin而言，多巴胺能神经元基因的表达增加。这是因为在整个腹侧被盖区组织样本中会同时收集到其他细胞（非多巴胺能神经元和胶质细胞），这些细胞表达β-actin但不表达多巴胺能神经元特异性基因，从而稀释了信号。
讨论
激光显微切割（LCM）是一种强大的技术，可用于从载玻片上的组织切片中分离特定的细胞群体或组织区域，并进一步提取RNA、microRNA、DNA和蛋白质。随着高通量技术（如微阵列、下一代RNA测序、DNA表观遗传分析和蛋白质组学）的灵敏度不断提高以及所需起始材料量的减少，LCM与这些分析方法的联合应用正变得越来越普遍8-12。通过LCM可获得更高的解剖学分辨率，从而显著增强对样本下游检测结果的理解。LCM的一个局限性在于，它能够富集目标细胞，但未必能得到完全均一的细胞群体。由于精度的限制，样本中难免会混入少量邻近组织的污染。然而，该技术确实能显著富集目标细胞，以最大限度地减少周围组织和细胞带来的影响，并增强针对目标细胞的实验效应。
直接与间接免疫组织化学的比较
由于激光显微切割（LCM）目前主要用于RNA的分离与检测，保持RNA的完整性是一个非常重要的标准。正是为了维持RNA的完整性，才采用间接免疫组织化学法来引导组织切割，从而避免直接对组织染色，因为直接染色可能降解RNA（图10）。然而，当实验问题需要分离特定细胞群体（例如多巴胺能神经元）时，则必须使用直接荧光免疫组织化学法。采用快速免疫组织化学标记方案可最大限度地减少操作过程中RNA的降解。较短的孵育时间是由于使用了高浓度的一抗和二抗，其浓度约为常规免疫组织化学（2小时孵育）所需浓度的10至20倍。然而，如果需要较长的孵育时间，Brown和Smith曾使用高盐缓冲液以抑制RNA降解，并在长达20小时的孵育后仍获得了高质量的RNA13。当组织标记后到使用LCM系统之间存在较长时间间隔时，也可采用该方法。
载玻片的选择——PEN膜载玻片、硅烷预处理载玻片和未涂层玻璃载玻片
已有文献报道使用未涂层的玻璃载玻片进行激光显微切割（LCM）14。在我们的实验室中，发现Silane-prep载玻片是更优的选择，因为这种涂层能够将组织充分固定在载玻片上以进行免疫组织化学染色，避免组织丢失，同时仍允许组织附着到LCM收集帽上并从载玻片上脱离。未涂层的玻璃载玻片在免疫组织化学过程中显示出一定程度的组织丢失。然而，如果采用间接免疫组织化学法，则组织保留问题会减轻。只要脱水充分，在Silane-prep载玻片上捕获细胞或组织不会出现问题。本文所述的分离神经元或脑区的各种方法各有优缺点。对于分离单个多巴胺能神经元而言，使用Silane-prep载玻片的优势在于光学性能更好，且比PEN膜载玻片更经济。其缺点是，如果脱水不充分（见下文），有时难以捕获细胞，并可能有部分组织残留在载玻片上。PEN膜载玻片的优点在于，结合使用红外（IR）激光和紫外（UV）激光可确保多巴胺能神经元被有效收集。从PEN膜载玻片上无法收集到细胞的情况几乎不会发生，因其对脱水程度的依赖性低于玻璃载玻片。另一个优势是，相比在玻璃载玻片上使用IR激光以圆形方式捕获神经元，UV激光可更精确地贴近目标神经元的实际形状进行切割。对于组织区域的分离，PEN膜载玻片则明显更优越，其额外成本是合理的。该方法可实现膜上切割区域组织的完全移除，比仅使用IR激光捕获大面积组织更快，且可收集较厚的组织切片。仅使用IR激光时，要求LCM收集帽的膜在整个组织区域完全熔化。此外，组织收集不完全的情况较为常见，通常需要多次尝试。尽管该方法比从PEN膜载玻片上分离组织耗时更长，但如果现有组织已置于玻璃载玻片上，或缺乏UV激光设备，此方法仍是一种可行的选择，因为大部分组织仍可被收集（图8J）。
关键步骤
使用100%乙醇孵育是其中最关键的步骤之一。为了从硅烷预处理载玻片上有效收集细胞，必须对组织进行彻底脱水。因此，任何残留的水分（主要与100%乙醇孵育步骤相关）都会影响从载玻片上拾取细胞的能力。为解决这一问题，应频繁更换100%乙醇溶液，因为乙醇可能从空气中吸收水分，或从前一步洗涤过程中带入水分，从而影响脱水效果。此外，可使用分子筛来吸收可能存在的水分污染。理想情况下，激光显微切割（LCM）系统应放置在配备除湿机的小型房间内，以维持低湿度环境。
良好的冷冻切片对于正确的激光显微切割（LCM）至关重要。切片应平整，尽量减少组织褶皱。组织中的褶皱会增加LCM帽与组织之间的距离，阻碍其与组织接触，从而难以将膜帽充分熔接到组织上。对于玻璃载玻片，切片厚度通常应在6至12 µm之间。较厚的切片可使用聚乙烯萘膜（PEN膜）载玻片进行捕获。
激光显微切割（LCM）提供了一种从显微镜载玻片上对组织和细胞进行高度精确分离的技术能力。与粗略切割组织样本相比，这种方法显著提高了后续分析的分辨率。尽管LCM可能耗时且劳动强度较大，但它不需要 extensive 的培训或专业技术，当与其它高通量技术相结合时，使用特定细胞或解剖区域可极大增强对生物过程的理解。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由美国国家心理健康研究所（1R15MH084209 - 01A1）、国家神经疾病与中风研究所（R21NS058375-01A2）和美国国家科学基金会（DBI0723080 07070646）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Veritas 激光捕获显微切割系统 | Life Technologies, Grand Island, NY | 现售更新型号 | |
| CapSure 宏激光捕获显微切割帽 | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
| CapSure HS 激光捕获显微切割帽 | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
| PEN 膜载玻片 | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
| 硅烷预处理载玻片 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
| 95% 无 RNase 乙醇 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
| 100% 无 RNase 乙醇 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| 无 RNase 曲通 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
| 分子筛 | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
| Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
| Nanodrop 3300 荧光分光光度计 | Thermo Scientific | ||
| Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
| RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |
参考文献
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