肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。
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摘要
摘要
坚硬的肿瘤组织已被证实对癌细胞的迁移和侵袭具有重要调控作用。癌细胞通过交联的组织进行侵袭性迁移时，依赖富含肌动蛋白的突起结构——侵袭体（invadopodia），该结构可通过蛋白水解作用降解细胞外基质（ECM）。研究表明，侵袭体的活性依赖于ECM的刚度以及癌细胞的收缩力，提示刚度信号可能通过肌动球蛋白收缩性来调控这些亚细胞结构。癌细胞的侵袭性和收缩性特征之间存在相关性 体外 利用基于不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的侵袭性伪足和牵引力测定实验。通过基于不同刚度聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的侵袭性伪足和牵引力测定实验，可在体外关联癌细胞的侵袭性和收缩性特征。尽管这两种实验之间存在某些差异，但本文所述方案提供了一种制备适用于两种实验的PAAs的方法，并可根据使用者特定的生物学和实验需求进行便捷调整。
引言
肿瘤相关细胞外基质（ECM）的刚性已被确认为通过增强肌动球蛋白收缩性来驱动恶性行为的重要因素1-3。尽管这一效应主要在乳腺癌细胞中得到证实，但基质刚性已被发现可改变来源于多种癌症的细胞的侵袭特性4-8，提示肿瘤刚性可能在其他类型癌症中也发挥作用。在侵袭性迁移过程中，为了穿透交联的组织，癌细胞利用富含肌动蛋白的黏附性突起，称为侵袭足（invadopodia），将蛋白酶定位于局部以降解细胞外基质9。侵袭足被认为是侵袭性细胞的标志性结构，并已被证实参与肿瘤细胞的侵袭和转移过程10,11。先前的研究表明，基质刚性可通过肌球蛋白II活性及机械敏感蛋白12来调控侵袭足的数量及其相关的细胞外基质降解能力4,12。鉴于肿瘤密度与癌症侵袭性之间的相关性13,14，这些结果提示了一种机制，即癌细胞可能通过肌动球蛋白收缩性响应刚性肿瘤组织，从而促进侵袭和转移。
体外 细胞外基质刚度与 体内 组织密度已被证明可调控癌细胞的侵袭行为1,15-17尽管肌动球蛋白收缩力在此过程中似乎具有重要作用，但目前的研究对于转移能力是否与收缩力的增强或减弱相关仍存在争议。6,18-20此外，目前尚不清楚这些力是否直接介导了侵袭伪足的活性。21我们最近发现，癌细胞的收....
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方案
1. PAA的玻璃盖玻片制备
- 使用无尘擦拭布清洁 12 mm 盖玻片。
- 用镊子夹住 12 mm 盖玻片和 14 mm 盖玻片，在 35 mm 玻底培养皿的微孔中通过本生灯火焰进行灼烧处理。
- 在室温下，用 200 µl 的 0.1 N NaOH 处理微孔 5 分钟。
- 吸除液体，并将微孔在空气中干燥 30 分钟。
- 在通风橱中，于室温下用 50–100 µl 的 3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理微孔 10 分钟。该化学试剂会与塑料发生反应，因此应使用玻璃移液管，且不要将微孔完全充满，以避免接触培养皿的塑料部分。
- 用超纯水清洗微孔约 10 分钟，直至 3-氨基丙基三甲氧基硅烷变得透明。
- 使用挤压瓶用超纯水冲洗微孔两次。
- 在室温下，将 2 ml 超纯水加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡清洗 10 分钟。
- 吸除液体，并将微孔在空气中干燥 30 分钟。
- 在室温下，将 2 ml 0.5% 戊二醛溶液加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡处理 30 分钟。
- 在室温下，将 2 ml 超纯水加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡清洗 10 分钟，重复此步骤两次，总共清洗 30 分钟。
- 将微孔以较陡的角度（60º 或更大）干燥 30 分钟。
注意：培养皿可在干....
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结果
在侵袭伪足实验中，通常通过细胞体内点状结构处肌动蛋白和皮质肌动蛋白等标志物的共定位来鉴定侵袭伪足（图1）。可对正在降解基质和非降解性的侵袭伪足进行计数，并根据这些结构是否与FITC标记的纤连蛋白中缺乏荧光信号的黑色区域共定位加以区分（图1）。侵袭伪足通过人工计数，每个细胞的细胞外基质降解程度则通过在细胞轮廓内对这些黑色区域进行人工设定阈值来确定。
在牵引力测定实验中，会在由载物台位置标记的每个细胞位置处采集四幅图像图2首先，对所有目标细胞分别采集“相位”和“受力”图像。同时，在每个位置采集聚丙烯酰胺凝胶（PAA）的“底部”图像，用于计算水凝胶的厚度。去除细胞后，在每个标记的载物台位置采集“零点”图像。通过比较“受力”图像与“零点”图像中微球位置的变化，计算PAA中的形变。然后结合这些位移数据以及PAA的力学性质（弹性模量E和泊松比，后者假设为0.5），计算牵引力图2). 计算牵引力存在多种不同的方法24 基于无限弹性半空间的布.......
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讨论
我们介绍了一种制备聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的方法，该凝胶可作为侵袭性伪足和牵引力测定实验的基础，用于关联细胞的侵袭性和收缩性行为。尽管PAAs长期以来已被用于研究基质刚度对细胞的影响并计算牵引力18,24,27，但本实验方案是首个基于相同刚度的PAAs建立平行测定方法，以关联细胞对基质力学性质响应中的侵袭性和收缩性行为。正确活化玻璃底培养皿的盖玻片可确保PAAs牢固结合于其表面而不脱落。过去，我们及其他研究者曾依赖如磺基-SANPAH和丙烯酸NHS酯等试剂将明胶结合至PAAs表面4,12,28，但我们发现这些方法无法在表面形成稳定且均匀的纤连蛋白层。因此，我们采用其他研究组所使用的方法，通过丙烯酸NHS酯将纤连蛋白整体嵌入并交联至PAAs中29,30。然而，为了在软、硬和刚性PAAs表面获得相同的配体密度，需要逐步提高纤连蛋白的浓度5。此外，加入纤连蛋白（而非微球）使软、硬和刚性PAAs的力学性能分别从1,071、9,299和28,283 Pa4降低至1,023、7,307和22,692 Pa5。尽管如此.......
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披露
本研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助（资助号 K25CA143412，Parekh）。我们谨此致谢耳鼻喉科提供的额外支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
致谢
作者无任何利益冲突需要披露。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 丙烯酰胺（40%） | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 丙烯酸NHS酯 | Sigma-Aldrich | A8060 | 在通风橱中新鲜配制，用DMSO配成10 mg/ml溶液 |
| Alexa Fluor 546鬼笔环肽 | Life Technologies | A22283 | 也可使用罗丹明标记的鬼笔环肽 |
| 过硫酸铵 | Bio-Rad | 161-0700 | 新鲜配制10%的1×PBS溶液 |
| Aqua Poly/Mount封片剂 | Polysciences | 18606 | 每孔使用6滴填充微孔 |
| BIS（2%） | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 牛血清白蛋白 | RPI | A30075 | 用1×PBS配制成3%的封闭液，4 °C保存 |
| 盖玻片（12 mm） | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| 透析袋 | Sigma-Aldrich | D9777 | 在硼酸盐缓冲液中预平衡15–30分钟 |
| DMEM培养基 | Cellgro | 10-013-CV | 用于配制侵袭伪足培养基 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 用于配制丙烯酸NHS酯溶液 |
| 表皮生长因子 | Life Technologies | PHG0311 | 用于配制侵袭伪足培养基 |
| 乙醇 | PHARMCO-AAPER | E200 | 用超纯水稀释至70% |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | SH30070.03 | 用于配制侵袭伪足培养基 |
| 异硫氰酸荧光素 | Sigma-Aldrich | F7250 | 避光保存 |
| 明胶 | Polysciences | 00639 | 通常在PBS中配制10 ml含1%蔗糖/1%明胶的溶液，4 °C保存（预热PBS以利于明胶溶解） |
| 玻璃底培养皿（35 mm盖玻片） | MatTek | P35G-0-14-C | 盖玻片未包被 |
| 戊二醛（25%） | Polysciences | 01909 | 用1×PBS稀释至0.5% |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 633抗体 | Life Technologies | A21050 | |
| 人血浆纤维连接蛋白 | Life Technologies | 33016-015 | 加入5 ml超纯水配制成1 mg/ml溶液；根据使用量分装，避免反复冻融 |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | 用于配制10×PBS储备液 |
| 小鼠抗cortactin 4F11抗体 | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | 用于配制10×PBS储备液 |
| NaCl | RPI | S23020 | 用于配制10×PBS储备液和硼酸盐缓冲液 |
| NaOH（1 N） | Sigma-Aldrich | S2770 | 用超纯水稀释至0.1 N |
| Nu-Serum（低蛋白血清） | BD Biosciences | 355500 | 用于配制侵袭伪足培养基 |
| 多聚甲醛 | Acros | 416785000 | 通常在1×PBS中配制10%储备液，在通风橱中操作，加入数毫升浓NaOH以助溶解，随后用浓HCl调回pH至7.4 |
| PBS（无菌） | Cellgro | 21-040-CV | 用于细胞培养 |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | 用于配制侵袭伪足培养基 |
| 硼氢化钠 | Sigma-Aldrich | 452882 | 在通风橱中新鲜配制，用1×PBS配成1 mg/ml溶液 |
| 四水合偏硼酸钠 | Sigma-Aldrich | S0251 | 用于配制硼酸盐缓冲液 |
| 蔗糖 | RPI | S24060 | 通常在PBS中配制10 ml含1%蔗糖/1%明胶的溶液，4 °C保存（预热PBS以利于明胶溶解） |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| 吐温X-100 | Alfa Aesar | A16046 | 用1×PBS配制成10%储备液，用于牵引力测定中的细胞去除，或用1×PBS稀释后用于染色 |
参考文献
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
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