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方法文章

用于癌细胞侵袭足和牵引力测定的聚丙烯酰胺凝胶

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DOI：

10.3791/52343

⸱

2015年1月4日

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

肿瘤微环境中的机械刚度通过增强侵袭伪足活性和肌动球蛋白收缩力，在驱动恶性行为中起着关键作用。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAAs），可通过侵袭伪足和牵引力测定方法研究癌细胞对基质刚度响应的侵袭性和收缩性特征。

摘要

坚硬的肿瘤组织已被证实对癌细胞的迁移和侵袭具有重要调控作用。癌细胞通过交联的组织进行侵袭性迁移时，依赖富含肌动蛋白的突起结构——侵袭体（invadopodia），该结构可通过蛋白水解作用降解细胞外基质（ECM）。研究表明，侵袭体的活性依赖于ECM的刚度以及癌细胞的收缩力，提示刚度信号可能通过肌动球蛋白收缩性来调控这些亚细胞结构。癌细胞的侵袭性和收缩性特征之间存在相关性 体外 利用基于不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的侵袭性伪足和牵引力测定实验。通过基于不同刚度聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的侵袭性伪足和牵引力测定实验，可在体外关联癌细胞的侵袭性和收缩性特征。尽管这两种实验之间存在某些差异，但本文所述方案提供了一种制备适用于两种实验的PAAs的方法，并可根据使用者特定的生物学和实验需求进行便捷调整。

引言

肿瘤相关细胞外基质（ECM）的刚性已被确认为通过增强肌动球蛋白收缩性来驱动恶性行为的重要因素1-3。尽管这一效应主要在乳腺癌细胞中得到证实，但基质刚性已被发现可改变来源于多种癌症的细胞的侵袭特性4-8，提示肿瘤刚性可能在其他类型癌症中也发挥作用。在侵袭性迁移过程中，为了穿透交联的组织，癌细胞利用富含肌动蛋白的黏附性突起，称为侵袭足（invadopodia），将蛋白酶定位于局部以降解细胞外基质9。侵袭足被认为是侵袭性细胞的标志性结构，并已被证实参与肿瘤细胞的侵袭和转移过程10,11。先前的研究表明，基质刚性可通过肌球蛋白II活性及机械敏感蛋白12来调控侵袭足的数量及其相关的细胞外基质降解能力4,12。鉴于肿瘤密度与癌症侵袭性之间的相关性13,14，这些结果提示了一种机制，即癌细胞可能通过肌动球蛋白收缩性响应刚性肿瘤组织，从而促进侵袭和转移。

体外 细胞外基质刚度与 体内 组织密度已被证明可调控癌细胞的侵袭行为1,15-17尽管肌动球蛋白收缩力在此过程中似乎具有重要作用，但目前的研究对于转移能力是否与收缩力的增强或减弱相关仍存在争议。6,18-20此外，目前尚不清楚这些力是否直接介导了侵袭伪足的活性。21我们最近发现，癌细胞的收缩力依赖于基质刚度，并可预测侵袭伪足对细胞外基质的降解能力。5这些结果表明，细胞力可能通过介导侵袭性伪足活性以响应肿瘤微环境的力学特性，在癌症进展中发挥重要作用。

为了关联癌细胞的侵袭性和收缩性特征5，我们改进了一种制备具有不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的方案，该方案此前曾用于研究刚度依赖性的侵袭伪足活性4,12,22。通过在PAAs中化学交联人血浆纤连蛋白，这些改良后的水凝胶可同时作为侵袭伪足和牵引力检测实验的基础，从而确保细胞在两种实验中所经历的基质刚度一致5。在侵袭伪足实验中，纤连蛋白为明胶提供了天然结合域，使覆盖其上的细胞外基质（ECM）与PAAs连接，以便检测基质降解情况。在牵引力实验中，纤连蛋白则作为细胞直接黏附的配体，用于检测微球位移，进而计算细胞牵引力。该方法制备出我们称之为软性、硬性和刚性PAAs，这些凝胶固定于玻璃底培养皿上，其弹性模量（E）分别为1,023、7,307和22,692 Pa5，覆盖了正常组织与癌组织所报道的力学特性范围23。

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方案

1. PAA的玻璃盖玻片制备

  1. 使用无尘擦拭布清洁 12 mm 盖玻片。
  2. 用镊子夹住 12 mm 盖玻片和 14 mm 盖玻片，在 35 mm 玻底培养皿的微孔中通过本生灯火焰进行灼烧处理。
  3. 在室温下，用 200 µl 的 0.1 N NaOH 处理微孔 5 分钟。
  4. 吸除液体，并将微孔在空气中干燥 30 分钟。
  5. 在通风橱中，于室温下用 50–100 µl 的 3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理微孔 10 分钟。该化学试剂会与塑料发生反应，因此应使用玻璃移液管，且不要将微孔完全充满，以避免接触培养皿的塑料部分。
  6. 用超纯水清洗微孔约 10 分钟，直至 3-氨基丙基三甲氧基硅烷变得透明。
  7. 使用挤压瓶用超纯水冲洗微孔两次。
  8. 在室温下，将 2 ml 超纯水加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡清洗 10 分钟。
  9. 吸除液体，并将微孔在空气中干燥 30 分钟。
  10. 在室温下，将 2 ml 0.5% 戊二醛溶液加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡处理 30 分钟。
  11. 在室温下，将 2 ml 超纯水加入微孔中，置于摇床上以中等速度（约 1 Hz）振荡清洗 10 分钟，重复此步骤两次，总共清洗 30 分钟。
  12. 将微孔以较陡的角度（60º 或更大）干燥 30 分钟。
    注意：培养皿可在干燥器中保存长达 2 个月。

2. 侵袭伪足实验用PAAs的制备

  1. 配制1 ml软质PAA溶液（8%丙烯酰胺和0.05% BIS），混合200 µl的40%丙烯酰胺、25 µl的2% BIS以及574 µl的超纯水（表1）。
  2. 配制1 ml硬质PAA溶液（8%丙烯酰胺和0.35% BIS），混合200 µl的40%丙烯酰胺、175 µl的2% BIS以及409 µl的超纯水（表1）。
  3. 配制1 ml刚性PAA溶液（12%丙烯酰胺和0.60% BIS），混合300 µl的40%丙烯酰胺、300 µl的2% BIS以及169 µl的超纯水（表1）。
  4. 将上述溶液脱气15分钟。分别向软质、硬质和刚性PAA溶液中加入200、215和230 µl含1 mg/ml人血浆纤连蛋白的超纯水溶液。对于所有溶液，均加入1 µl的10 mg/ml丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯、5 µl的100 mg/ml过硫酸铵以及2 µl的N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED；表1）。轻轻吹打混匀，避免在溶液中产生气泡。
 
聚丙烯酸
(1 ml)		40%
AA
(μl)		2%
BIS
(μl)		超纯
水
(μl)		1 mg/ml
FN
(μl)		10 mg/ml
NHS 酯
(μl)		100 mg/ml
APS
(μl)		 
TEMED
(μl)		弹性
模量
(Pa)
柔软200255742001521023
硬2001754092151527307
刚性30030016923015222692

表1：在侵袭突起实验中使用的软性、硬性和刚性聚丙烯酰胺凝胶（PAA）的组分体积及其相应的弹性模量。 AA = 丙烯酰胺，FN = 纤连蛋白，APS = 过硫酸铵。

  1. 用移液器将 8.48 µl 的 PAA 溶液滴加到每个微孔的中心。
    注意：此体积理论上可形成厚度为 75 µm 的 PAA。
  2. 使用镊子将 12 mm 盖玻片经火焰处理的一面轻轻放至微孔中的液滴上。
  3. 让夹层中的 PAA 溶液聚合 15–30 分钟。通过检查剩余溶液确认是否已完成聚合。
  4. 向每个培养皿中加入 2 ml 的 1× PBS，并用镊子取出 12 mm 盖玻片。
    注意：10× PBS 在实验室中配制，成分为 0.011 M KH2PO4、1.54 M NaCl 和 0.056 M Na2HPO4。
  5. 用 2 ml 的 1× PBS 在室温下洗涤微孔，每次 5 分钟，重复两次，共洗涤 15 分钟。

3. 牵引力测定实验用聚丙烯酰胺凝胶的制备

  1. 配制1 ml软性PAA溶液（8%丙烯酰胺和0.05% BIS），需混合200 µl的40%丙烯酰胺、25 µl的2% BIS以及566 µl超纯水（表2）。
  2. 配制1 ml硬性PAA溶液（8%丙烯酰胺和0.35% BIS），需混合200 µl的40%丙烯酰胺、175 µl的2% BIS以及401 µl超纯水（表2）。
  3. 配制1 ml刚性PAA溶液（12%丙烯酰胺和0.60% BIS），需混合300 µl的40%丙烯酰胺、300 µl的2% BIS以及161 µl超纯水（表2）。
  4. 将上述溶液脱气15分钟。分别向软性、硬性和刚性PAA溶液中加入200、215和230 µl的1 mg/ml人血浆纤连蛋白。将8 µl的200 nm红色荧光微球（激发/发射波长为580/605 nm）超声处理30秒。每种溶液中均加入8 µl的200 nm红色荧光微球、1 µl的10 mg/ml丙烯酸NHS酯、5 µl的100 mg/ml过硫酸铵以及2 µl的TEMED（表2）。轻轻吹打混匀，避免在溶液中产生气泡。
 
PAA
(1 ml)		40%
AA
(μl)		2%
BIS
(μl)		超纯
水
(μl)		1 mg/ml
FN
(μl)		 
微球
(μl)		10 mg/ml
NHS 酯
(μl)		100 mg/ml
APS
(μl)		 
TEMED
(μl)		弹性
模量
(Pa)
柔软2002556620081521023
硬20017540121581527307
刚性300300161230815222692

表2：牵引力测定实验中使用的软性、硬性和刚性聚丙烯酰胺凝胶（PAA）的组分体积及相应的弹性模量。 AA = 丙烯酰胺，FN = 纤连蛋白，APS = 过硫酸铵。

  1. 用移液器将 8.48 µl 的 PAA 溶液滴加到每个微孔的中心。
    注意：此体积理论上可形成厚度为 75 µm 的 PAA 凝胶。
  2. 使用镊子将 12 mm 盖玻片经火焰处理的一面轻轻放至微孔中的液滴上。
  3. 让夹层中的 PAA 溶液聚合 15–30 分钟。通过检查剩余溶液确认是否已完成聚合。
  4. 向每个培养皿中加入 2 ml 的 1× PBS，并用镊子取出 12 mm 盖玻片。
  5. 用 2 ml 的 1× PBS 在室温下洗涤微孔，每次 5 分钟，重复洗涤两次，共洗涤 15 分钟。

4. 侵袭伪足实验用细胞外基质的制备

  1. 将明胶溶液（1% 明胶和 1% 蔗糖）加热至 37 °C。
  2. 用 150 µl 明胶溶液处理 PAAs，持续 1 分钟，然后在将玻璃底培养皿倾斜至 45° 角时，从微孔底部小心吸除溶液。
  3. 将微孔中 PAAs 上残留的薄层明胶在较陡角度（60° 或更大）下干燥 60 分钟，以优化干燥效果。
  4. 在冰上用 2 ml 冷却的 0.5% 戊二醛溶液处理微孔 15 分钟，随后在室温下继续处理 30 分钟。
  5. 用 2 ml 1x PBS 洗涤微孔 5 分钟，重复两次，共计洗涤 15 分钟。
  6. 用 2 ml 硼氢化钠溶液处理微孔 1 分钟。轻轻敲击培养皿以去除明胶表面形成的气泡。
  7. 吸除溶液，并用 2 ml 1x PBS 洗涤微孔 5 分钟，重复两次，共计洗涤 15 分钟。
  8. 用 1x PBS 将 FITC 标记的人血浆纤连蛋白溶液稀释至 50 µg/ml，并在 4 °C 条件下以 175,000 × g 离心 15 分钟。可直接购买商业化的标记纤连蛋白，或按以下步骤自行标记：
    1. 将 5 mg 纤连蛋白溶解于 10 ml 硼酸盐缓冲液（170 mM 四水合偏硼酸钠和 40 mM NaCl）中，并置于透析袋内。
    2. 将透析袋置于含有 6 mg 溶解态 FITC 的 200 ml 硼酸盐缓冲液中，在避光条件下，于室温下以磁力搅拌器最低转速搅拌标记 1.5 小时。
    3. 在避光冷藏环境（4 °C）中，用磁力搅拌器最低转速持续搅拌，以 500 ml 1x PBS 透析 3 天，每天更换两次溶液。
    4. 根据稀释样品（1:200）在 280 nm 和 493 nm 处的光密度值计算 FITC 标记纤连蛋白浓度，公式为 [OD280 – (0.36 × OD493)] / 1.4 × 稀释倍数 200 × 2（该系数用于校正下一步中甘油对纤连蛋白的浓缩效应），结果单位为 mg/ml。
    5. 在避光冷藏环境（4 °C）中，用磁力搅拌器最低转速在 50% 甘油溶液中透析过夜。）
  9. 在避光条件下，于室温下用 150 µl FITC 标记的纤连蛋白溶液处理微孔 60 分钟。
  10. 在将玻璃底培养皿倾斜至 45° 角时，从微孔底部小心吸除 FITC 标记的纤连蛋白溶液，然后在避光的细胞培养超净台中，向玻璃底培养皿中加入室温的 70% 乙醇溶液，静置 10 分钟以进行灭菌。同时，将玻璃底培养皿盖子浸入 70% 乙醇溶液中，或用蘸有 70% 乙醇的低絮擦布擦拭干净。
  11. 用 1x PBS 填充玻璃底培养皿，洗涤 5 分钟，再用 2 ml 1x PBS 重复洗涤两次，共计洗涤 15 分钟。

5. 侵袭伪足实验的制备与成像

  1. 在2 ml侵袭伪足培养基（1:1 DMEM与RPMI 1640混合液，含5%低蛋白血清、10%胎牛血清及20 ng/ml新鲜添加的表皮生长因子）中加入25,000个癌细胞，接种于玻璃底培养皿中，37°C孵育过夜。
  2. 吸除培养基，向微孔中加入2 ml 3.7%多聚甲醛溶液，室温避光固定细胞20分钟。
  3. 用2 ml 1× PBS快速洗涤两次后，向微孔中加入2 ml 0.1% Triton X-100溶液，室温避光处理5分钟，以通透细胞膜。
  4. 用2 ml 1× PBS快速洗涤一次后，向微孔中加入3%牛血清白蛋白封闭液，室温避光封闭60分钟。
  5. 在封闭液中加入150 µl小鼠抗cortactin抗体（1:750稀释），每孔加入150 µl，室温避光孵育60分钟。
  6. 用2 ml 1× PBS洗涤微孔，每次5分钟，重复三次，共15分钟。
  7. 在封闭液中加入150 µl山羊抗小鼠633荧光二抗（1:500稀释）和546标记的鬼笔环肽（phalloidin，1:750稀释），每孔加入150 µl，室温避光孵育60分钟。
  8. 用2 ml 1× PBS洗涤微孔，每次5分钟，重复三次，共15分钟。
  9. 每孔滴加六滴封片剂，用22 × 22 mm盖玻片封片。
  10. 使用倒置宽场荧光显微镜，配备高数值孔径（NA）40倍油镜，分别采用632/647 nm和556/570 nm的激发/发射滤光片成像cortactin和肌动蛋白，以识别侵袭伪足；同样，使用492/518 nm激发/发射滤光片成像纤连蛋白，以检测细胞外基质（ECM）降解情况。

6. 牵引力检测的制备与成像

  1. 在2 ml侵袭伪足培养基中加入15,000个癌细胞，接种至玻璃底培养皿中，过夜培养。
  2. 吸除玻璃底培养皿中的培养基，更换为2 ml L-15培养基，其中添加相同补剂（5%低蛋白血清、10%胎牛血清和20 ng/ml新鲜添加的表皮生长因子），并预先加热至37 °C。
  3. 将玻璃底培养皿置于倒置显微镜的环境培养舱中，在37 °C、高湿度条件下平衡1小时。
  4. 使用配备自动载物台的宽场倒置显微镜，采用高数值孔径（NA）40倍物镜，采集四组图像以标记细胞位置：
    1. 使用相差模式对位于PAA表面的细胞进行成像（“相位”图像）。
    2. 使用560/645 nm激发和发射滤光片对荧光微球进行成像，聚焦位置略低于细胞，直至PAA顶部第一层微球清晰对焦（“受力”图像）。
    3. 此外，将焦平面调至PAA底部（以微球作为标记），采集图像（“底部”图像）。注意：该图像用于记录z轴位置，以便获得每个位置的实际PAA厚度，用于后续牵引力计算，详见代表性结果部分。
    4. 在多个位置完成上述图像采集后，轻柔加入220 µl 10% Triton-X溶液以去除细胞。随后在每个位置按照前述方法再次对PAA顶部的微球进行成像（“零应力”图像）。

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结果

在侵袭伪足实验中，通常通过细胞体内点状结构处肌动蛋白和皮质肌动蛋白等标志物的共定位来鉴定侵袭伪足（图1）。可对正在降解基质和非降解性的侵袭伪足进行计数，并根据这些结构是否与FITC标记的纤连蛋白中缺乏荧光信号的黑色区域共定位加以区分（图1）。侵袭伪足通过人工计数，每个细胞的细胞外基质降解程度则通过在细胞轮廓内对这些黑色区域进行人工设定阈值来确定。

在牵引力测定实验中，会在由载物台位置标记的每个细胞位置处采集四幅图像图2首先，对所有目标细胞分别采集“相位”和“受力”图像。同时，在每个位置采集聚丙烯酰胺凝胶（PAA）的“底部”图像，用于计算水凝胶的厚度。去除细胞后，在每个标记的载物台位置采集“零点”图像。通过比较“受力”图像与“零点”图像中微球位置的变化，计算PAA中的形变。然后结合这些位移数据以及PAA的力学性质（弹性模量E和泊松比，后者假设为0.5），计算牵引力图2). 计算牵引力存在多种不同的方法24 基于无限弹性半空间的布...

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讨论

我们介绍了一种制备聚丙烯酰胺凝胶（PAAs）的方法，该凝胶可作为侵袭性伪足和牵引力测定实验的基础，用于关联细胞的侵袭性和收缩性行为。尽管PAAs长期以来已被用于研究基质刚度对细胞的影响并计算牵引力18,24,27，但本实验方案是首个基于相同刚度的PAAs建立平行测定方法，以关联细胞对基质力学性质响应中的侵袭性和收缩性行为。正确活化玻璃底培养皿的盖玻片可确保PAAs牢固结合于其表面而不脱落。过去，我们及其他研究者曾依赖如磺基-SANPAH和丙烯酸NHS酯等试剂将明胶结合至PAAs表面4,12,28，但我们发现这些方法无法在表面形成稳定且均匀的纤连蛋白层。因此，我们采用其他研究组所使用的方法，通过丙烯酸NHS酯将纤连蛋白整体嵌入并交联至PAAs中29,30。然而，为了在软、硬和刚性PAAs表面获得相同的配体密度，需要逐步提高纤连蛋白的浓度5。此外，加入纤连蛋白（而非微球）使软、硬和刚性PAAs的力学性能分别从1,071、9,299和28,283 Pa4降低至1,023、7,307和22,692 Pa5。尽管如此...

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披露

本研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助（资助号 K25CA143412，Parekh）。我们谨此致谢耳鼻喉科提供的额外支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-氨基丙基三甲氧基硅烷Sigma-Aldrich281778
丙烯酰胺（40%）Bio-Rad161-0140
丙烯酸NHS酯Sigma-AldrichA8060在通风橱中新鲜配制，用DMSO配成10 mg/ml溶液
Alexa Fluor 546鬼笔环肽Life TechnologiesA22283也可使用罗丹明标记的鬼笔环肽
过硫酸铵Bio-Rad161-0700新鲜配制10%的1×PBS溶液
Aqua Poly/Mount封片剂Polysciences18606每孔使用6滴填充微孔
BIS（2%）Bio-Rad161-0142
牛血清白蛋白RPIA30075用1×PBS配制成3%的封闭液，4 °C保存
盖玻片（12 mm）Fisher Scientific12-545-80
透析袋Sigma-AldrichD9777在硼酸盐缓冲液中预平衡15–30分钟
DMEM培养基Cellgro10-013-CV用于配制侵袭伪足培养基
DMSOSigma-AldrichD8418用于配制丙烯酸NHS酯溶液
表皮生长因子Life TechnologiesPHG0311用于配制侵袭伪足培养基
乙醇PHARMCO-AAPERE200用超纯水稀释至70%
胎牛血清Thermo ScientificSH30070.03用于配制侵袭伪足培养基
异硫氰酸荧光素Sigma-AldrichF7250避光保存
明胶Polysciences00639通常在PBS中配制10 ml含1%蔗糖/1%明胶的溶液，4 °C保存（预热PBS以利于明胶溶解）
玻璃底培养皿（35 mm盖玻片）MatTekP35G-0-14-C盖玻片未包被
戊二醛（25%）Polysciences01909用1×PBS稀释至0.5%
山羊抗小鼠Alexa Fluor 633抗体Life TechnologiesA21050
人血浆纤维连接蛋白Life Technologies33016-015加入5 ml超纯水配制成1 mg/ml溶液；根据使用量分装，避免反复冻融
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1用于配制10×PBS储备液
小鼠抗cortactin 4F11抗体EMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1用于配制10×PBS储备液
NaClRPIS23020用于配制10×PBS储备液和硼酸盐缓冲液
NaOH（1 N）Sigma-AldrichS2770用超纯水稀释至0.1 N
Nu-Serum（低蛋白血清）BD Biosciences355500用于配制侵袭伪足培养基
多聚甲醛Acros416785000通常在1×PBS中配制10%储备液，在通风橱中操作，加入数毫升浓NaOH以助溶解，随后用浓HCl调回pH至7.4
PBS（无菌）Cellgro21-040-CV用于细胞培养
RPMI 1640Cellgro10-040-CV用于配制侵袭伪足培养基
硼氢化钠Sigma-Aldrich452882在通风橱中新鲜配制，用1×PBS配成1 mg/ml溶液
四水合偏硼酸钠Sigma-AldrichS0251用于配制硼酸盐缓冲液
蔗糖RPIS24060通常在PBS中配制10 ml含1%蔗糖/1%明胶的溶液，4 °C保存（预热PBS以利于明胶溶解）
TEMEDBio-Rad161-0800
吐温X-100Alfa AesarA16046用1×PBS配制成10%储备液，用于牵引力测定中的细胞去除，或用1×PBS稀释后用于染色

参考文献

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