本文介绍了用于观察金属表层视网膜固定钉及视网膜假体邻近眼部组织的组织学技术。
本文内容
摘要
摘要
用于治疗某些类型失明的视网膜假体正在全球范围内的临床试验中获得越来越多的关注，目前已有商用设备进入市场。为了评估这些设备的安全性，在临床前研究中需要可靠的技术手段。然而，一些视网膜植入物中使用的金属硬质组件与传统的组织学处理流程不兼容，尤其是考虑到周围组织的 delicate 性质。本文介绍了一种用于评估通过金属钉固定于视网膜表面的视网膜植入物邻近眼部组织健康状况的技术方法。
视网膜假体包含与眼部组织接触的电极阵列。最常见的植入位置是视网膜内界膜表面（眼后房），在此位置，假体通过一枚贯穿眼球各层组织的金属钉固定于视网膜。以往的方法无法评估该固定钉邻近的眼部组织情况。 原位，由于传统组织学技术无法对金属物体进行切片。因此，若存在局部损伤，很难评估由图钉插入所导致的损害。
因此，我们开发了一种用于观察视网膜固定钉及植入物周围组织的技术。我们改进了一种既有的技术，该技术原本用于处理和观察耳蜗植入物周围的坚硬骨组织，现将其应用于眼部柔软而精细的组织。我们将包含植入物和视网膜固定钉的固定眼组织进行定向并包埋于环氧树脂中，以稳定并保护样本结构。随后对包埋的样本进行研磨、抛光、染色，并在不同放大倍数下，逐层递进地对样本不同深度进行成像观察。该技术实现了对金属固定钉邻近眼组织完整性及细胞结构的可靠评估。
引言
视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是一种遗传性疾病，会导致视网膜最外层负责将光（以光子形式）转化为神经活动的感光细胞广泛丧失。重要的是，RP 患者通常在视网膜其他层次中仍保留有功能性的残存神经元。视网膜假体可通过电刺激这些存活的神经元来激活其视觉通路，从而为这些患者恢复部分有限的视力1,2。临床试验的感知效果已显示出令人鼓舞的早期结果，最近一些设备已获准用于商业用途。目前，临床应用的视网膜假体主要有三种解剖位置：视网膜内层（epiretinal）3,4、视网膜下层（subretinal）5,6 和脉络膜上腔（suprachoroidal）7,8。不同设备采用不同的材料，其形态也根据植入位置进行定制。然而，它们均通过电脉冲激活视网膜中的残存神经元来产生视觉感知。
任何医用假体在植入初期或后续持续受力过程中，均可能因机械效应而损伤周围组织。对于可植入式刺激器（如视网膜假体）而言，还需额外考虑其电学参数应处于安全范围内。患者安全至关重要，因此在进入临床应用之前，设备必须经过严格的临床前研究测试9-15。在我们的配套文章中，我们描述了一种评估位于脉络膜上腔的植入物周围眼部局部组织病理学的方法16。在本研究中，我们介绍了一种在临床前（猫科）模型中对固定于视网膜内表面的电极阵列周围眼组织进行可视化观察的技术（图1）。
视网膜内表面位置是安置视觉假体最常采用的位置。位于此处的电极阵列通常通过一枚金属钉固定于 retina，该金属钉会穿透眼球的所有层次17-20。在本论文所述技术出现之前，难以准确评估金属钉周围邻近的视网膜及其他组织状况。使用中性缓冲甲醛进行眼球固定的常规方法会导致人为的视网膜损伤，原因是视网膜与巩膜相对于金属钉的固定点发生差异性移动。因此，无法准确观察由金属钉及视网膜内表面电极阵列本身所造成的实际损伤。此外，由于金属物体无法用传统的组织学切片设备轻易切割，因此无法在金属钉原位（in situ）的情况下对眼组织进行切片；而在组织学处理前移除金属钉同样不可取，因为这一操作也会导致人为的视网膜损伤。
本研究的目的有两个：1）减少视网膜脱离伪影，以便能够可靠地评估由固定钉及视网膜上植入电极阵列所引起的任何损伤；2）在不移除固定钉的情况下，可视化观察固定钉邻近区域的视网膜结构。为实现目标1，我们采用了一种新的固定技术（如配套文章16中所述），该技术可减少视网膜人为剥离伪影。为实现目标2，我们改进了一种包埋、研磨和抛光技术，该技术最初是为耳蜗植入电极的in situ观察而开发的21-23。本文所描述的方法能够在最小化视网膜人为损伤的前提下，实现对固定钉周围及邻近视网膜的in situ可视化，从而准确评估固定钉和视网膜上电极阵列可能造成的任何损伤。
方案
注意：所有实验程序均经皇家维多利亚眼耳医院动物研究伦理委员会批准 & 伦理委员会（RVEEH AEC；#10-199AB）批准。受试对象的处理遵循澳大利亚国家卫生与医学研究理事会《科学用途动物护理与使用实践规范》（2013年）以及《防止虐待动物法》（1986年及修订案）。所有外科手术、临床评估和电生理操作均在麻醉下进行，并尽一切努力最大限度减少动物痛苦。
1. 去核与固定
注意：请遵循配套论文中详细描述的去核和固定操作步骤16，若存在装置导线或玻璃体切除术端口，需特别小心。简要而言，该过程包括：
- 用温热的生理盐水进行心脏灌注，随后用冷的中性缓冲福尔马林固定。
- 在眼球上系缝线作为解剖标志。
- 摘除眼球16，同时保留装置的电缆以及任何附着的补片/标签。
- 将眼球在Davidson’s溶液中后固定18–36小时。
- 转移至50%乙醇中处理6–8小时。
- 转移至70%乙醇中，并于4 °C冷藏，直至进行解剖。
2. 电极移除与解剖。
注意：并非所有视网膜内植入物都具有相同的外形，但通常都会包含一个电极阵列以及某种形式的柔性且可贴合的载体材料。通过金属钉固定在视网膜上的装置具有一个钉孔，金属钉通过该孔穿过阵列并进入眼球后部，从而将这些结构固定在一起。
- 观察植入物及其固定在视网膜上的位置。
- 使用15度刀片进行环形角膜切口，移除角膜帽，暴露下方的虹膜和晶状体。
- 使用15度刀片分离晶状体的悬韧带纤维，并完整移除晶状体（in toto），暴露后房内的视网膜上植入物及原位的金属钉（in situ）。
- 根据植入物类型及所进行的研究，在进一步解剖前移除多余的组件。
注意：在本示例中，所评估的视网膜上电极阵列包含一个原型密封式金刚石电极和电子组件，封装于一个贴合型硅胶载体中（由本实验室制备；参见20）。- 在此，使用手术刀通过精细解剖小心取出金刚石电极封装部分。保留植入物的硅胶主体、视网膜固定钉以及铂金导线的残余部分（图2）。如果被研究的装置设计中不包含嵌入式阵列/封装结构，则可省略此步骤（2.2）。
- 以所需的方向小心解剖包含固定钉及其周围组织的样本。使用精细解剖剪从眼球后部剪取包含巩膜、脉络膜和视网膜的全层条状组织。取样时应获得固定钉的纵向横截面，显示紧邻固定钉的所有视网膜层次（图2）。
注意：样本所需的方向可能因具体研究目标而异。例如，若需评估固定钉损伤与视盘之间的接近程度，则应在样本中包含视盘。
3. 脱水、包埋、切片、磨片、染色与成像
- 在连续三天内，通过逐步提高乙醇浓度的方式对样品进行脱水：
- 将样品在70%乙醇中脱水，每次2小时，重复两次。
- 将样品在80%乙醇中脱水，每次2小时，重复两次，然后过夜（O/N）。
- 将样品在90%乙醇中脱水，每次2小时，重复两次。
- 将样品在100%乙醇中脱水，每次2小时，重复两次，然后过夜（O/N）。
- 将样品在100%丙酮中脱水，每次2小时，重复两次。
- 从丙酮中取出样品，在室温下自然风干过程中用光学显微镜观察。在样品即将开始卷曲或塌陷之前，立即将其转移至环氧树脂中（参见步骤3.4）。
注意：从软组织中去除液体将导致细胞塌陷和收缩。组织何时发生卷曲或塌陷需通过经验判断。
- 从丙酮中取出样品，在室温下自然风干过程中用光学显微镜观察。在样品即将开始卷曲或塌陷之前，立即将其转移至环氧树脂中（参见步骤3.4）。
- 按照制造商说明配制医用级环氧树脂。固化条件可选择55 °C下1小时，或室温下24小时。将树脂置于真空腔中，约50 mbar下抽真空约5分钟，以去除气泡。需手动调节真空度，过高的真空会导致环氧混合物沸腾，从而影响有效脱气。
注意：步骤3.3应与步骤3.2同时进行。 - 将样品包埋于透明环氧树脂中。将眼组织浸入已脱气的环氧树脂中，置于合适的可密封容器内，室温下过夜（O/N）使其固化。
- 通过修整并重新包埋固化后的环氧块，确保样品处于理想方向（图2）。重新包埋含有眼组织的修整后环氧块，使钉状物的长轴与模具底部平行（黄色杯 — 图3A）。
- 将树脂固定于研磨样品夹具中，使用碳化硅砂纸进行研磨（转速230–250 rpm，加水，手动研磨）（起始使用800目砂纸；图3C和3E）。
- 染色时，将研磨面浸入甲苯胺蓝染液中3–5分钟，或直至染色显现（图3F）。
- 用自来水冲洗（图3G）。
- 使用高倍解剖显微镜对样品的研磨面成像，以观察视网膜的细胞层结构（图3H）。在样品上方环氧树脂表面滴加一滴蒸馏水，以减少空气-环氧界面的衍射干扰。使用光纤“鹅颈”光源照射样品。
- 重复步骤3.6–3.9，每次研磨去除设定厚度的样品（样品夹具可实现的最小精确且可重复的研磨增量为20 μm）。
结果
固定方案显著减少了视网膜人为性脱离和分层现象16。通过所述的两步包埋法，可一致地实现样本在环氧树脂块中的定向。逐步研磨过程需要适度的手工技巧以获得最佳效果，但可借助可调节的样本夹具，从而精细控制研磨增量分辨率。在所有病例中（n = 5），均成功定位并研磨/抛光了铆钉部位，结果理想且具有一致性。铆钉邻近视网膜组织结构清晰可辨，染色效果良好。使用粒径P#800的碳化硅砂纸对环氧树脂块表面进行抛光，已足以观察包埋组织的细胞宏观结构。如需要，可在任意深度使用更细粒径的砂纸或金刚石研磨液进一步抛光表面。解剖显微镜配合光纤“鹅颈”光源被证明适用于观察研磨后树脂块表面及包埋组织样本。通过反复试验调整光源位置，以找到经显微镜观察时照明效果和对比度最佳的角度和位置。在样本上方的树脂块表面滴加一滴蒸馏水，有助于减少光路衍射和/或缓解环氧树脂-空气界面的畸变。图4展示了利用该技术观察到的视网膜组织紧邻钛合金视网膜铆钉的示例图像。在硅胶两侧可见非人为性的视网膜脱离和折叠现象（图4A）。铆钉杆部可见嵌于硅胶中；铆钉头部已穿透视网膜和巩膜。在硅胶两侧未染色的视网膜区域也存在非人为性的视网膜脱离（图4C）。该技术显示，在此案例中，铆钉邻近视网膜结构紊乱，且由于倾斜插入角度导致一侧视网膜受压。需注意的是，所展示图像仅用于说明该技术的成功应用，并不代表普遍意义上的铆钉相关组织病理损伤。
图1. 玻璃体内电极阵列的放置位置。 (A) 眼部示意图，显示后部巩膜、脉络膜及变性视网膜（缺乏感光细胞）的放大横截面。图中以蓝色表示固定于视网膜内表面的电极阵列。 (B) 玻璃体内电极阵列的计算机辅助设计图。a，集成电路（“芯片”）与电极组件；b，钛制视网膜固定钉；c，医用级硅胶外壳；d，导线引出点。图A经Bionic Vision Australia提供原始插图修改而成，版权属于Beth Croce。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 电极移除及眼球解剖。 高动态范围的猫眼球摘除后视网膜内界膜固定钉宏观照片 原位 （A） 使用Davidson固定液进行后固定以保存视网膜结构16去核眼球被解剖后，电极阵列封装部分从硅胶载体上移除（虚线方框表示电极阵列原始位置），固定用的钉（箭头）及植入物的硅胶主体部分仍保留。 （B） 眼睛沿靠近固定钉的纵向横截面（虚线）进行解剖。固定钉仍嵌于眼杯的后壁（箭头），主要由巩膜固定。包含固定钉的组织部分用于树脂包埋和研磨处理（右侧部分），而包含移除电极阵列下方视网膜的部分则进行常规组织学处理。16 （左段）。每个图板的底边均显示一把刻度为0.5 mm的标尺。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 3. 玻璃体腔内固定钉与视网膜组织的环氧树脂包埋及研磨。 环氧树脂包埋并定向的组织样品、研磨、染色及成像过程的实物照片。（A） 固定钉样品被包埋于环氧树脂块中。利用模具对样品进行定向，使其纵切面与模具底部平行。（B） 含有固定钉样品的已固化环氧树脂块。（C） 将环氧树脂块安装于研磨样品夹具中，准备进行研磨。（D） 对样品进行定向，以确保研磨后成像的切面包含视网膜的细胞层及固定钉的纵轴。（E） 使用旋转研磨机上的碳化硅砂纸对样品进行研磨。（F） 用甲苯胺蓝对树脂块的研磨面进行染色，以识别视网膜各层结构。（G） 用自来水冲洗树脂块，以去除多余的染料。（H） 使用高倍解剖显微镜对染色后的视网膜层及固定钉进行成像。
图 4. tack 与视网膜的高低倍图像。 在研磨过程中的不同阶段，使用解剖显微镜拍摄图像，显示 tack（星号）穿透眼球并从巩膜（“S”）穿出的纵切面，邻近的硅胶（井号）以及经甲苯胺蓝染色和未染色的视网膜（“R”）。请注意，这些仅为示例图像，旨在展示当前的可视化技术，并不代表所有表层视网膜植入物或 tack 插入的组织学结果。铂金导线的研磨残留物在图 A-D 中可见（“W”）。（A） 低倍、未染色的 tack 穿透视网膜和巩膜图像。（B） 高倍、未染色视网膜中视网膜脱离和折叠图像，位于图 A 中硅胶载体邻近区域。（C） tack 杆中心部位的低倍图像。（D） 图 C 中 tack 杆中心部位的高倍图像。（E） 在另一个不含硅胶载体的样本中，显示 tack 柄下方经甲苯胺蓝染色的视网膜的高倍图像，拍摄于研磨 tack 杆之前。（F） 使用相同研磨技术观察到的正常甲苯胺蓝染色视网膜结构（GCL：视网膜神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层；PR：光感受器；T：猫脉络膜毯）。各图中的比例尺分别为：A 和 C = 2 mm；B 和 D = 500 µm；E = 200 µm；F = 100 µm。
讨论
标准组织学技术无法处理金属硬质植入物 原位 由于使用金属、玻璃甚至金刚石刀片切割这些物体存在局限性。在我们的配套论文中16我们证明，采用改良的全眼球固定技术可减少人为的视网膜脱离现象。在本论文中，采用了一种成熟的研磨与抛光技术以可视化耳蜗植入体21-23原位 针对视网膜假体进行了改进。用于将电极阵列固定于视网膜表面的钛钉，连同周围的眼组织被包埋于环氧树脂中。将该树脂块适当定向后，逐步进行研磨和抛光，以暴露紧邻金属钉的组织形态。利用高倍解剖显微镜获取树脂块在不同深度的抛光表面图像。该技术可用于：观察和评估视网膜上植入物邻近组织的反应；评估植入手术相关的创伤；确定机体对硬质金属组件的生物学反应；以及测量植入物与视网膜表面之间的距离。
该技术将对未来安全性研究具有重要价值 原位 视网膜固定钉或其他硬性（例如， 眼内金属物体。该技术可直接应用于评估视网膜内表面固定假体的临床前安全性，也可用于评估位于视网膜下位置的植入物与其接触的视网膜区域之间的组织损伤情况。
有多种方法可以验证该技术是否正确执行。在每个阶段，视网膜应保持附着在眼球的外层组织上。如果出现明显的非生理性视网膜脱离，则可能提示固定过程中存在问题。当样本被包埋并最终在树脂块中重新定位时，视网膜应接近与切削面垂直，以最大限度减少斜切现象。检查穿过某一物体（如视网膜固定钉）所需的研磨步数（已知每步尺寸）是否与其实际尺寸相符，有助于验证操作的准确性。
该技术可通过多种方式优化。与研磨过程相关的环氧树脂块表面划痕可通过逐步使用更细粒度的抛光方法来减少。在本研究中，我们使用了800、1000、1200、2400和4000目的碳化硅砂纸。也可使用金刚石研磨膏以进一步改善表面光洁度。更精细的表面光洁度可获得更高质量的图像，但需要额外的抛光时间。改进该技术效果的另一个关键因素是图像采集所用光学器件和照明设备的选择与质量。其他常规组织学染色方法——特别是尼氏染色，可替代甲苯胺蓝使用，但可能需要进一步优化。某些染料会同时染色树脂和组织（例如，伊红），因此染色后可能需要进行浅层抛光以去除背景着色。本研究未尝试特殊染色、荧光染料或免疫组织化学染色，但除非需要非常特定的结果，否则在每一研磨层级进行此类染色所需的时间可能难以接受。然而，有可能在包埋前（步骤3.4）对整个组织进行染色24。
该技术的主要局限性在于，一旦感兴趣区域被研磨去除，便无法恢复，因此建议在每次研磨和抛光的各个阶段，以多种放大倍数拍摄大量（可能冗余）的图像。此外，每次调整研磨深度时应采用微小的增量。该技术的另一局限性在于其光学放大倍数和分辨率，与置于玻璃载玻片上并用标准（透射式）光学显微镜观察的组织相比仍有一定差距。在新型植入装置的原型设计和安全性评估中，主要关注的是大体病理学评价。该技术为观察与视网膜固定钉相关的临床相关损伤提供了一种高效的方法。经过练习后，对一个已包埋的标本完成研磨、抛光和拍照所需的总时间，与切片石蜡包埋块或冰冻切片所需的时间相当。
目前的技术还有望拓展应用于视网膜植入物范围之外的其他领域。该技术适用于评估硬质植入物周围组织的情况，尤其在无法取出植入物或取出会破坏界面结构的情况下。例如，该技术可进一步扩展用于评估金属材料制成的植入物例如铂、镍钛合金 等等。无法使用常规组织学技术切割的样本，例如某些深部脑区或外周神经电极、用于药物递送的套管、血管支架或骨科假体。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。Irfan Durmo 是科利耳有限公司的员工。
致谢
感谢 Nicole Vella（麦考瑞大学）提供试剂；感谢 Alexia Saunder（仿生学研究所；BI）、Michelle McPhedran（BI）和 Chris Williams（BI）提供实验支持；感谢皇家维多利亚眼科和耳科医院（RVEEH）生物研究中心工作人员在动物护理方面的帮助；感谢 Sue Pierce（RVEEH）提供的兽医建议；感谢 Anthony Burkitt（澳大利亚仿生视觉；BVA）、Tamara Brawn（BVA）以及 BVA 全体工作人员提供的行政支持。
本研究由澳大利亚研究理事会（ARC）通过其仿生视觉科学与技术特别研究计划（SRI）向澳大利亚仿生视觉联盟（BVA）提供的资助支持。仿生学研究所获得维多利亚州政府的运行基础设施支持，同时感谢Bertalli家族信托基金和J T Reid慈善信托基金的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
本稿件的澳大利亚仿生视觉联盟作者为（a-z）：
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, 和 Jonathan Yeoh。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Chem-Supply | AA008 | 丙酮 BHD 医用级 |
| Epo-Tek 301 环氧树脂 | 环氧技术 | A组 1675-54-3 B组 9046-10-0 | |
| 70-75% 乙醇（v/v） | 默克股份有限公司 | 4.10261 | 酒精 |
| 乙醇 | 默克股份有限公司 | 90143 | 酒精 |
| 甲苯胺蓝 O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol 研磨/抛光机 | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop 样品架 | Struers | Accustop | |
| 光学显微镜 | Leica | MZ16 | |
| 物镜 | 徕卡 | 2.0倍平场复消色差物镜 | |
| 数码显微镜相机 | Leica | DFC-420C | |
| 显微镜软件 | Leica | Application Suite v4.1.0 |
参考文献
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重印与许可
