评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

摘要

通过优化的人类外周血单个核细胞（PBMC）ex vivo 检测方法，我们发现可燃性烟草制品的提取物显著抑制了效应PBMCs中受体介导的细胞内分泌细胞因子及其细胞溶解能力。这些快速检测方法可能有助于烟草产品的评估，并帮助理解烟草暴露潜在的长期影响。

摘要

除其他病理生理变化外，长期暴露于香烟烟雾可导致炎症和免疫抑制，这与吸烟者对微生物感染和肿瘤发生易感性增加相关。ex vivo 条件下研究经烟雾成分处理的人外周血单个核细胞（PBMCs）中受体介导的免疫反应抑制，是研究其作用机制并评估烟草制品长期暴露可能影响的有效方法。本文中，我们优化了利用细菌脂多糖（一种Toll样受体4配体）刺激PBMCs进行ex vivo 检测的方法。在ex vivo 检测中，我们研究了全烟雾条件培养基（WS-CM）、一种可燃性烟草制品提取物（TPP）以及尼古丁对PBMCs分泌细胞因子及其杀伤靶细胞功能的影响。结果显示，在暴露于WS-CM的PBMCs中，分泌型细胞因子IFN-γ、TNF、IL-10、IL-6和IL-8，以及胞内细胞因子IFN-γ、TNF-α和MIP-1α均受到抑制。通过K562靶细胞杀伤实验测定，效应PBMCs的细胞溶解功能也因WS-CM暴露而降低；相比之下，尼古丁在这些实验中作用甚微。综上所述，我们建立了一系列改进的检测方法，可用于评估烟草制品在ex vivo 条件下的生物学效应，这些方法也可便捷地适用于其他待测产品的研究。

引言

大量研究证据表明，长期吸烟对健康有害，可导致心血管疾病（CVD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和癌症^1,2长期吸烟已被证实可引起炎症和免疫抑制，这些改变据报会增加吸烟者发生微生物感染和癌症的风险³. 在 体外 和 离体 这些技术有助于阐明香烟烟雾对病理生理效应的分子基础^4-9 (表1）并被视为指导各类烟草产品新兴监管的重要工具^10,11.

例如，我们已证明，可燃性烟草制品制剂（TPPs）如全烟气条件培养基（WS-CM）和总颗粒物（TPM）对细胞的毒性及对DNA的损伤远高于非可燃性TPPs或尼古丁^12,13. 与已发表的研究一致，最近有报道称可燃的TPPs或尼古丁^12,13与已发表的研究一致，我们近期报道了可燃性 TPPs 会引起显著的免疫抑制。这一点体现在 Toll 样受体（TLR）配体刺激下的细胞因子分泌受到抑制，以及外周血单个核细胞（PBMCs）对靶细胞（K562）杀伤能力的下降。 离体 模型¹⁴鉴于炎症在香烟烟雾诱导的疾病过程中的重要性，本报告提出了进一步优化检测条件，以评估香烟烟雾对免疫调节作用的方法。

通常采用ex vivo（离体）实验检....

方案

注意：根据良好临床实践要求，在机构审查委员会（IRB）批准的当地临床研究单位获得了开展本研究的书面知情同意。血液处理、外周血单个核细胞（PBMC）的分离及其他细胞培养实验均在无菌条件下进行，使用微生物学上无菌的耗材和试剂。

1. WS-CM 的制备

1. 按先前所述方法制备香烟烟雾条件培养基（WS-CM）¹²。
   1. 使用以下吸烟程序，将四支3R4F标准香烟产生的烟雾通入不含酚红的RPMI 1640培养基中，以制备WS-CM：每次抽吸体积为35 ml，抽吸间隔为60秒，抽吸持续时间为2秒。每次制备可获得20 ml样品。
2. 在管子上标注日期、完成时间以及香烟名称和编号。吸烟完成后立即于-80 °C保存500 µl分装样品。
3. 分析冷冻保存的WS-CM分装样品，以测定其中尼古丁、烟草特异性亚硝胺和多环芳烃的含量，方法同前文所述¹²。

2. 外周血单个核细胞的分离

1. 从健康献血者（不使用烟草制品者）采集新鲜血液，并在维克森林浸信会医疗中心机构审查委员会（IRB）的单独批准下，按照以下方法分离外周血单个核细胞（PBMCs）¹⁵。
   1. 在血袋送达前，于生物安全二级（BSL-2）细胞培养罩内准备好一个500 ml的....

结果

结果以均值 ± 均值标准误表示（四个供体样本）。使用 Excel 软件对处理组与未处理对照组进行学生 t 检验，并对所有处理组与其相应对照组进行 t 检验比较。统计学显著性以以下符号表示：*，P < 0.05；**，P < 0.005；***，P < 0.0005。

为了检测暴露于WS-CM和尼古丁的影响，将PBMCs分别用不同浓度的WS-CM和尼古丁处理3小时或24小时。细胞死亡通过稳定可靠的7AAD染色法进行检测，因为7AAD可插入双链核酸中，并能穿透正在死亡或已死亡细胞的细胞膜¹⁶。在处理24小时后，WS-CM引起细胞死亡呈剂量依赖性增加，在相当于4 µg/ml尼古丁单位时，检测到接近80%的细胞死亡（图1A）。只有在3,000 µg/ml尼古丁浓度下才观察到类似程度的细胞死亡（图1B）。由于我们采用3小时的WS-CM和尼古丁暴露以评估其对细胞因子诱导及杀伤靶细胞能力的影响，因此有必要确定WS-CM在3小时处理后是否引起显著的细胞毒性。用相当于5 µg/ml尼古丁单位的.......

讨论

我们及其他研究者此前已证实，用 TPPs 处理 PBMCs 可抑制多种反应，包括细胞因子的表达与分泌，以及靶细胞杀伤等功能学指标¹⁴之前研究所描述的实验方法需要较长的孵育时间，且效应幅度有限。¹⁴. 鉴于这一有吸引力的特性可能具有的应用前景 离体 用于基础与应用研究的模型，我们探究了这些多步骤生物学检测中的任何检测参数是否可优化。本文介绍了利用TPP处理来测量TLR介导的免疫应答的简化方法 离体 外周血单个核细胞模型

分离活的外周血单个核细胞是这些实验的关键前提 离体实验 鉴于潜在供体之间存在个体差异和生理状态的不同，获得具有反应性的外周血单个核细胞（PBMCs）是理想的选择。为实现本研究目的，我们采用既往发表的方法，从总体健康的成年受试者中分离PBMCs。¹⁵此外，本研究为尽量减少供者间的个体差异，排除了存在过敏、感染或正在服用任何处方药及非处方药（如阿司匹林）的供者。同时，建议从新鲜采集的血液中分离PBMCs，以确保细胞在后续实验中具有最佳的活力和功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 x 75 mm 离心管	BD Falcon	352058
15 ml 锥形离心管	Corning	430790
2 ml 微量离心管	Axygen	MCT-150-C-S
3R4F 参考香烟	肯塔基大学农业学院	3R4F
50 ml 锥形离心管	Corning	430828
500 ml 瓶	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96 孔平底板	Thermo Nunc	439454
96 孔圆底板	BD Falcon	353077
细胞培养超净台	Thermo Scientific	1300 Series A2
离心机	Eppendorf	58110R
CFSE	Molecular Probes Life Technologies	C34554
Cluster 管	Corning	4401	吞咽有害，致癌物
Cytofix/Cytoperm（Permwash）	BD Biosciences	555028	易燃
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FCAP Array	BD Biosciences	652099	软件用于分析 CBA 数据
滤器单元	Nalgene	156-4020
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Canto II	8 色，激发波长 405，发射波长 785。
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Calibur	4 色，激发波长 495，发射波长 785。
流式细胞术分析软件	Tree Star	FlowJo
冻存容器	Nalgene	5100-0001	含 DMSO，刺激物
GolgiPlug	BD Biosciences	555029	致癌物，刺激物，腐蚀性
H2SO4	Sigma-Aldrich	339741
人炎症性细胞因子检测试剂盒	BD Biosciences	551811
IFN-γ V-500 抗体	BD Horizon	561980	皮肤致敏物
IL-8 ELISA 试剂盒	R&D Systems	DY208
分离缓冲液	Isolymph, CTL Scientific Corp.	1114868	易燃液体，刺激物
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907
L-谷氨酰胺	Gibco Life Technologies	25030-081
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
MIP1-α PE 抗体	BD Pharmingen	554730	急性毒性，经口
莫能菌素	Sigma-Aldrich	M5273
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
尼古丁	Sigma-Aldrich	N3876	急性毒性，环境危害
Parafilm	Bemis	“M”
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	易燃，皮肤刺激
青霉素/链霉素	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
运行缓冲液	MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech	130-091-221
Th1/Th2 CBA 试剂盒	BD Biosciences	551809
TNF-α Alexa Fluor 488 抗体	BioLegend	502915
移液管	Fisher Scientific	13-711-20
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503