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方法文章

利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

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DOI：

10.3791/52358

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2015年1月10日

 ,  , 
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

本文内容

摘要

在急性脑切片中对突触连接的神经元进行膜片钳记录和同时的细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的相关联分析。本方案的目的是描述从神经元微环路进行电生理记录及其后续形态学分析的关键技术步骤。

摘要

在急性脑切片制备中，对两个（或更多）突触连接的神经元进行膜片钳记录（成对记录），同时结合细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的关联分析。该方法能够根据神经元的形态特征和电生理反应模式，识别并表征突触前和突触后神经元。成对记录可用于研究这些神经元之间的连接模式，以及化学性和电性突触传递的特性。本文将逐步介绍获得可靠成对记录并同时优化神经元形态回收所需的操作流程。我们将描述如何在脑切片制备中识别通过化学突触或缝隙连接连接的神经元对；概述如何重建神经元以获得其树突和轴突区域的三维形态，以及如何识别和定位突触接触。我们还将讨论成对记录技术的注意事项与局限性，特别是脑切片制备过程中因树突和轴突被截断而带来的问题，因为这些因素会显著影响连接性的估计。然而，由于成对记录方法具有高度的灵活性，它仍将是表征脑内已知神经微环路中突触传递多个方面的有力工具。

引言

由两个突触连接的神经元构成的神经元微环路是大脑大规模网络的基本组成单元，也是突触信息处理的基本功能单位。要表征这类神经元微环路，必须首先了解其形态学特征和功能特性。 两者 突触前和突触后配对神经元、突触连接的类型及其结构与功能机制。然而，在许多关于突触连接的研究中，微环路中的至少一个神经元并未得到充分表征。这主要是由于在突触连接性研究中常采用相对非特异性的刺激方案所致。因此，突触前神经元的结构和功能特性要么完全未被鉴定，要么仅被极有限地鉴定即， 标志蛋白的表达 等等。）。结合生物胞素、神经生物胞素或荧光染料等标记物进行的成对记录更适用于研究小型神经元微环路。该技术可同时检测形态学明确的突触连接的多种结构与功能参数。

通过急性脑片制备技术，已在大脑皮层和皮层下脑区研究了两个神经元之间所谓的“单突触”单突触连接1-10。早期实验使用锐利微电极；随后采用膜片钳记录技术，以获得噪声水平更低、时间分辨率更高的突触信号记录。

一项重要的技术进步是采用了红外微分干涉差（IR-DIC）光学技术11-14，这种显微技术显著提高了脑片中神经元的可见性和识别能力，使得对视觉可辨的突触连接进行记录成为可能15-17。通常情况下，成对记录是在急性脑片制备中进行的；仅有极少数研究报道了在活体（in vivo）条件下对突触连接的神经元进行记录18-20。

配对记录最重要的优势在于，可以在光镜和电镜水平上将功能特性分析与形态学分析相结合（参见 例如.,7,16,21）。经过组织化学处理后，追踪突触连接的神经元对的树突和轴突形态。随后，可对长度、空间密度、方向、分支模式等形态学特征进行量化分析 等等。 这些参数可为特定突触连接的客观分类提供依据。此外，与其他大多数用于研究神经元连接性的技术相比，成对记录还能够识别单突触连接的突触接触位点。这一识别可通过光学显微镜与电子显微镜的联合使用直接实现。16,21-27 或使用钙成像28,29 树突棘。然而，后一种方法仅能研究兴奋性连接而无法研究抑制性连接，因为它依赖于通过突触后受体通道的钙离子内流。

除了对特定神经元微环路中的突触传递进行详细分析外，成对记录还可用于研究突触可塑性规律30,31，或结合激动剂/拮抗剂的应用，研究乙酰胆碱32和腺苷33等神经递质对突触传递的调制作用。

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方案

所有实验操作均按照欧盟动物保护指令、德国动物福利法（Tierschutzgesetz）以及欧洲实验动物科学联合会指南的规定进行。

1. 电生理实验的设置

在开始进行成对记录之前，必须先建立电生理实验装置。以下简要概述了此类装置的组装方法：

  1. 安装一个防震台，用于放置显微镜、操纵器及其他所有设备。
    注意：记录突触连接时，振动或任何形式的移动需尽可能减小，因为该过程需要更换移液管（搜索电极被替换为记录电极）。
  2. 在防震台上放置法拉第笼以减少电噪声。将法拉第笼内的所有设备连接至电气接地。
  3. 在防震台上根据制造商的说明安装配备电动聚焦轴的显微镜，该显微镜基于电动x-y载物台。这能够可靠地将显微镜移动至不在同一视野范围内的神经元，例如新皮层中跨层连接的情况。
  4. 在显微镜的相机接口上安装视频摄像机，并将其连接至模拟和/或数字显示屏，以观察脑片制备过程及电极的移动。使用可在低倍与高倍放大之间切换的摄像机，分别获取突触连接的神经元细胞对的整体视野与近景图像。这也有助于控制膜片钳电极的移动。
  5. 安装一个带有浴槽室嵌入孔的标本台（由聚甲基丙烯酸甲酯块自行钻制），用于脑切片制备。该标本台不得与显微镜连接。 即， 必须固定在气浮台上，且显微镜应在气浮台下方可灵活移动。
  6. 安装两个（或根据需要更多）可沿三个维度移动的高精度显微操作器。将膜片钳前置放大器安装在显微操作器上，并将其连接至主放大器。
    注意：如有需要，可安装额外的机械臂 例如， 两个以上的前置放大器、细胞外刺激电极、药物递送系统 等等。
  7. 将灌流 chamber 置于样品台中。安装溶液进口和出口，并将其连接至灌流系统。
  8. 使用蠕动泵持续向记录室灌注人工脑脊液（ACSF； 表1以4 - 6 ml/min的稳定流速灌注，以确保脑片的最佳存活率。
    注意：切勿显著超过此流速，否则会导致人工脑脊液（ACSF）中产生湍流，从而引起脑片移动。
  9. 在样品台上安装温度探针和Ag/AgCl接地电极的固定装置。这是为了使探针和电极能够接触并监测腔室中的浴液。
  10. 为在脑片制备中获得良好的神经元可视性，请在显微镜下使用红外照明。这可减少光的衍射，从而降低图像模糊。确保显微镜配备微分干涉差（DIC）光学系统，以实现类似“三维”的可视化效果。这有助于进行膜片钳记录，并可定位脑片深层（60 µm 或更深）的神经元。
  11. 实验过程中，将脑片置于底部带有玻璃盖玻片的实验腔室中。在脑片上方放置一个“铂金网架”以防止脑片漂浮。铂金网架由U形压扁的铂丝制成，其上粘附有牙线作为固定丝线。
  12. 将人工脑脊液（ACSF）以32 - 35 °C的温度持续灌流脑片，以确保氧合和pH值处于最佳控制状态。可通过在灌流 chamber 的ACSF入口附近安装帕尔贴（Peltier）加热装置来实现溶液加热。
    注意：使用超薄盖玻片，以便即使具有高数值孔径和短工作距离的显微镜聚光镜也能聚焦到样本上。这对于切片的最佳照明至关重要。
    有关用于脑片制备中配对记录的优化电生理装置的图像和描述，请参见 图 4 在参考文献中 34.

2. 脑切片制备

  1. 用异氟烷（终浓度 <0.1%).
    注意：也可使用其他麻醉剂。麻醉剂的使用应符合相应动物伦理委员会的建议和规定。添加麻醉剂后，务必确保动物未受到刺激或处于应激状态。
  2. 将动物断头，迅速打开颅骨，并按照参考文献中描述的步骤尽快取出脑组织。 34,35.
  3. 将脑组织转移至用含95% O₂和5% CO₂的碳合气饱和、冷却至4 °C的人工脑脊液中2 和5% CO2.
  4. 分离待研究的脑区。
    注意：为了获得最佳的突触前和突触后神经元树突与轴突的保存效果并最小化截断，应在研究每种神经连接类型及发育阶段前预先确定最佳参数。在理想制备的脑切片中，突触前神经元的轴突无需与切片表面平行；相反，应以较小的角度指向切片内部。突触后锥体神经元的顶端树突亦应如此；该取向应在光学显微镜下进行检查确认。此要求对于非局部或跨层突触连接尤为重要。 即其中，突触前与突触后胞体相距超过200 µm，树突和轴突被截断的概率可能显著高于局部连接。
  5. 将脑组织转移至切片机腔室。根据经验结果，依据动物年龄的不同，使用不同的细胞外切片溶液（参见 表 2 和表 3；您还可以在“http://www.brainslicemethods.com/’).
  6. 修剪脑组织，直至目标区域可见。
  7. 为获得细胞可见性良好的切片，若动物已成熟，应切割300 - 400 µm厚的脑片>3 周）。如果动物未成熟（1st 至 2nd 小鼠和大鼠出生后数周内，脑片可切至约600 - 800 µm的厚度，而不会显著影响细胞的可见性。
    注意：这将提高“未成熟”脑片的稳定性，并减少长距离树突和轴突侧支可能发生的截断数量。
  8. 将切片从切片机样本槽转移至盛有切片液的孵育槽中，切片液用95% O₂2 和5% CO₂2将切片置于孵育 chamber 中，于室温或约 30 °C 下孵育至少 30 分钟至 1 小时，具体条件取决于实验类型。

3. 配对膜片钳记录与生物胞素填充

根据突触连接的类型，采用三种不同的方法来寻找突触连接的神经元。如果连接概率较低（大多数兴奋性连接的情况），请按以下步骤进行：

  1. 低连接性的神经元连接
    1. 使用 表4 所列成分的内液填充膜片电极。在全细胞记录配置中，需在内液（电极液）中加入浓度为 3 - 5 mg/ml 的生物素，以获得良好的突触前和突触后神经元染色效果。让生物素在细胞内扩散至少 15 - 30 分钟（具体时间取决于神经元的大小）。
      注意：不要将生物素加入下文所述“搜索”电极所使用的溶液中。
    2. 以全细胞模式对一个潜在的突触后神经元进行膜片钳制。使用长而细的电极柄的膜片电极，这有助于在物镜下灵活操控电极，并减少电极插入脑片时可能产生的运动伪影。
    3. 然后，使用电阻为 8 - 10 MΩ、尖端直径较小的“搜索”膜片电极，以细胞贴附模式对一个潜在的突触前神经元进行钳制。使用此类电极建立一个“松散”的细胞贴附膜片。将“搜索”电极填充一种内液，其中 K+ 被 Na+ 取代（表5），以避免在寻找突触前细胞过程中使神经元去极化。
      注意：“松散”封接的电阻不在 GΩ 范围，通常约为 30 - 300 MΩ。
    4. 在电流钳模式下，将“松散”封接下的膜电位维持在约 -30 至 -60 mV。然后施加大电流脉冲（0.2 - 2 nA），以在潜在的突触前细胞中诱发动作电位。在电压反应中观察到的动作电位表现为一个小的尖峰样信号。
    5. 将刺激频率设定为 0.1 Hz，以防止突触后反应衰减。若脑组织非常不成熟或突触连接不够稳定，可使用更低的刺激频率。
    6. 若“突触后”神经元对所测试“突触前”神经元的刺激无反应，则换另一个神经元建立“松散”封接。只要封接电阻保持在 >30 MΩ，就无需更换“搜索”膜片电极。以这种方式最多测试 30 个潜在的突触前神经元。
      注意：为防止在松散膜片钳搜索过程中损伤神经元，施加于搜索电极的负压应远小于全细胞膜片电极所用的负压。
    7. 若在“松散”封接模式下的刺激在突触后神经元中引发潜伏期 <5 毫秒的兴奋性突触后电位（EPSP）或抑制性突触后电位（IPSP），则将“搜索”电极从突触前神经元上移开。
    8. 将“搜索”膜片电极更换为填充含生物素的常规内液的记录电极。确保该记录电极的电阻为 4 - 8 MΩ；细胞体越大，电极电阻可越低。
    9. 对突触前神经元进行膜片钳制，并以全细胞电流钳模式进行记录。通过电流注入在突触前神经元中诱发动作电位，并记录突触后反应。将数据存储于计算机中，供后续离线分析。
  2. 高连接性的神经元连接
    注意：对于连接率较高（> 30%）的神经元微环路，应采用不同的方法寻找突触连接。该方法如下所述，常用于平均连接率高于兴奋性连接的抑制性突触连接36。当连接率低于此值时，不应使用该方法。
    1. 直接以全细胞模式对一个突触前神经元进行膜片钳制。然后，同样以全细胞模式对一个潜在的突触后神经元进行钳制。两个细胞均应处于电流钳控制下。在突触前细胞中诱发动作电位，并监测潜在的突触后神经元是否出现突触后电位。
    2. 若该神经元对突触前刺激无反应，则使用填充常规内液的膜片电极，以全细胞模式钳制另一个新的神经元。若发现连接，则无需更换膜片电极，继续记录。随后按步骤 3.1.9 进行操作。
  3. 通过缝隙连接的神经元连接
    注意：为寻找电性（缝隙连接）连接，应采用以下步骤，该步骤是对低概率连接方法的改进版本。
    1. 以全细胞膜片钳模式对一个突触后神经元进行钳制。
    2. 随后，使用电阻为 7 - 10 MΩ 的“搜索”膜片电极，以松散封接模式（低封接电阻，30 - 300 MΩ）对一个潜在的突触前神经元进行钳制。该电极应填充用于松散封接刺激的改良高 Na+ 内液。
    3. 通过“松散”封接施加持续时间为 100 - 300 毫秒的超极化电流脉冲；电极指令电位应设定在约 -60 至 -70 mV。若该刺激在“突触后”神经元中引发微小的超极化反应，则表明存在缝隙连接。
    4. 将“突触前”神经元重新以全细胞模式进行膜片钳制，并按上述方法继续操作。
      注意：为确保轴突和树突结构的良好染色，请采用下述方案。此处仅简要描述，实验室所用组织化学处理的详细方案见参考文献 37。

4. 组织化学处理

  1. 将含有成对突触连接神经元的脑片转移至含有4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液）的离心管中，固定24小时。用于电子显微镜时，使用2.5%戊二醛和1%多聚甲醛进行固定。
  2. 次日，将脑片转移至不含固定剂的正常磷酸盐缓冲液中。用磷酸盐缓冲液清洗脑片，每次10–15分钟，共清洗6–8次，以去除多余的固定剂。
  3. 将脑片在含3% H2O2的0.1 M磷酸盐缓冲液中孵育20分钟，以减少内源性过氧化物酶反应。观察到明显的气泡生成，继续反应直至不再产生气泡。随后用0.1 M磷酸盐缓冲液清洗脑片6–8次，每次10分钟，以彻底去除残留的H2O2。
  4. 免疫细胞化学与显色反应
    生物胞素标记神经元的可视化基于链霉亲和素-生物素化辣根过氧化物酶反应，以二氨基联苯胺（DAB）为底物催化生成深色沉淀，从而实现高空间分辨率的清晰染色。以下为显色反应的操作步骤：
    1. 按照试剂盒说明书配制ABC溶液。将其加入14.55 ml磷酸盐缓冲液中，并添加150 µl 10% Triton X100（表6；仅用于光学显微镜），避光静置约30分钟。使用前将脑片在此溶液中孵育过夜（O/N）。
    2. 将脑片在ABC溶液中于室温避光、摇床上孵育1小时，随后置于4 °C冰箱中过夜。次日早晨，再于室温继续孵育1小时。
    3. 之后，用磷酸盐缓冲液至少清洗脑片四次，每次10分钟。然后在避光条件下，于2 ml镍增强型3,3’-二氨基联苯胺溶液中摇床孵育约30分钟（表7）。操作二氨基联苯胺时需格外小心，仅可在通风橱中使用；即使在极低浓度下，该物质也具有极强的致癌性。
    4. 向含二氨基联苯胺的溶液中加入6.5 µl 3% H2O2。在光学显微镜下监测显色反应，直至棕黑色染色的神经元清晰可见。随即通过多次磷酸盐缓冲液洗涤立即终止反应。
    5. 将染色后的脑片贴附于带粘附剂的硅烷涂层Histobond载玻片或明胶包被的标准载玻片上。
    6. 将载玻片置于湿度至少为80%的湿盒中过夜。次日，让脑片在空气中自然干燥10分钟。包埋前，将载玻片依次浸入浓度递增的乙醇溶液（20–100%）中进行脱水。
      注：脱水过程应缓慢进行，否则可能导致树突和轴突结构发生形变37。若采用其他包埋方法，例如以甘油为基础的Moviol包埋，则无需脱水；但可能导致脑片压缩不均，从而引起神经元形态扭曲。
    7. 最后，将脑片在二甲苯中孵育10分钟，使用适用于光学显微镜的疏水性封片介质进行封片，并覆盖超薄盖玻片。室温下干燥20分钟。

5. 神经元重建与突触接触定位

  1. 使用配备60X/100X油镜物镜和高数值孔径聚光镜的光学显微镜观察生物胞素标记的神经元切片，以获得最佳空间分辨率。确保轴突终末膨大和树突棘清晰可见。
  2. 使用商用神经元示踪系统示踪神经元或突触连接的神经元对（参见 特定材料/设备列表) 以获得三维神经元重建。在持续目视检查下进行手动追踪，以检测即使微小的轴突或树突侧支。对于来自突触连接神经元的配对记录，手动追踪仍是首选方法，因为该方法能够准确归属 例如， 对轴突轮廓进行重建以确定其属于突触前或突触后神经元，需要丰富的重建经验。
  3. 如有需要，可对轴突末梢和/或树突棘进行计数。因为树突棘，甚至不同亚型的树突棘以及轴突末梢，可能在分布和密度上表现出特定的特征，相对于 例如， 皮质层或区域，这有助于表征神经元细胞类型。
  4. 对于存在突触连接的神经元成对结构，在可用的最高放大倍数下检查突触前轴突与突触后树突是否存在紧密相邻的区域。若观察到轴突终末与突触后树突棘或树突干位于同一焦平面，则可视为潜在的突触接触。在重建图像中标记该接触点。
  5. 在追踪程序的相应部分，对神经元重建结果在三个空间维度上的收缩进行校正。
    注意：在固定、组织化学处理和脱水过程中，会发生显著的机械形变和收缩；这将影响轴突和树突长度的测量，并严重扭曲其空间排列。包埋介质的收缩校正系数在 x 和 y 方向上约为 1.1，在 z 方向上约为 2.137.
  6. 用于定量形态学分析时，使用神经生理学数据分析程序（参见 特定材料/设备清单).

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结果

配对记录是深入表征形态学明确的单向或双向突触连接以及缝隙连接（电性连接）的首选方法图1。图中展示了体感桶状皮层第4层中一对记录的示例 图1A单向兴奋性和抑制性突触连接均可被表征（图1B,C此外，配对记录技术可用于记录双向突触连接的信号， 即， 来自一对神经元中两个细胞互为突触前和突触后连接的情况。这一点在下图中得到说明。 图1D，显示了一个抑制性中间神经元和一个兴奋性神经元的记录结果。在兴奋性神经元中诱发动作电位（红色轨迹）会在突触后抑制性中间神经元中引起兴奋性突触后电位（EPSP，黑色轨迹）。然而，当在中间神经元中诱发动作电位时，可在兴奋性神经元中记录到抑制性突触后电位（IPSP）。 图1E 表明通过缝隙连接或同时通过缝隙连接和化学突触耦合的神经元也能够进行记录。目前，只有通过成对的电生理记录才能鉴定出相互连接和缝隙连接，尚无其他技术可实现。

通过膜片钳电极对电耦合神经元进行生物胞素填充，并结合...

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讨论

对突触耦合的兴奋性和/或抑制性神经元进行成对记录，是研究神经元微环路的一种非常灵活的方法。该方法不仅可用于估算不同类型神经元之间的突触连接性，还能用于确定连接的功能特性以及突触前和突触后神经元的形态。此外，可轻松地将激动剂和/或拮抗剂施加于脑片标本中的神经元，从而研究神经调质对突触传递特性的影响32，或利用例如突触递质释放的量子分析等方法，对特定的单突触连接进行深入表征16,17,38,39。发现化学性和/或电性（缝隙连接）突触连接是本实验方案中最关键的步骤。因此，我们根据连接比率及其类型（化学性/电性），列出了多种寻找突触连接的方法。

脑片制备的一个主要缺点是长距离轴突投射常常被显著截断，因此只能回收轴突总长度的一小部分。对于某些锥体细胞类型而言，若考虑投射至其他皮层区域或皮层下区域的纤维，则其截断程度可能高达90%甚至更高。这使得脑片制备不适合用于研究胞体间距超过>300 µm的神经元之间的突触连接。然而，在急性脑片制备中，由于局部中间神经元的轴突分支在水平和垂直方向上的分布范围有限，其局部轴突投射通常能够以...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢于德国于利希研究中心神经科学与医学研究所（INM-2）“神经元微环路功能”研究组，以及亚琛工业大学医学院（JARA）精神病学、心理治疗与心身医学系“皮层微环路功能”研究组所有成员的有益讨论。本研究得到了德国研究基金会（DFG）关于桶状皮层功能（BaCoFun）研究小组的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放大器HEKAEPC 10 USB Triple配备 2 - 3 个前置放大器
显微镜OlympusBX51WI具有两个相机接口、一个 4X 物镜和一个 40X 水浸物镜
相机TILL PhotonicsVX55红外 CCD 相机
工作站Luigs & NeumannInfrapatch 240配备电动 x-y 载物台和用于显微镜的电动调焦轴
微操纵器Luigs & NeumannSM-5用于 2 - 3 个前置放大器的 x-y-z 操纵器
法拉第笼Luigs & Neumann
防震台Newport Spectra-Physics
PatchmasterHEKA
切片机Microm InternationalHM650V
微量移液器拉制仪HEKASutter P-97
Neurolucida 系统Microbrightfield配备 Neurolucida 和 Neuroexplorer 软件

参考文献

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