一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

摘要

在生物医学研究中，动物模型常被用于模拟严重的骨损伤。由于小鼠体型较小，大多数研究团队难以在其体内建立稳定的骨缺损模型。本文中，我们描述了一种在小鼠中建立和分析实验性股骨缺损的简便方法。

摘要

尽管骨组织具有显著的再生能力，但严重的骨创伤常常导致无法正常愈合的损伤。事实上，由于创伤程度、疾病或患者年龄等因素，所有四肢长骨骨折中有十分之一无法完全愈合。我们改进骨再生策略的能力在很大程度上依赖于在实验动物中模拟严重骨创伤的能力，但大段骨缺损的建立与稳定在技术上具有挑战性。通常情况下，实验上通过制造一个无法自然愈合的骨缺损来模拟严重的长骨创伤。这需要完全切除一段长度超过骨横截面直径1.5倍以上的骨组织来实现。随后使用金属植入物对骨进行固定，以维持骨折端的正确对位并允许肢体活动。

由于小鼠体型较小且长骨脆弱，大多数研究团队难以在小鼠体内建立此类损伤模型。因此，长骨缺损模型通常仅限于大鼠及其他较大的动物。然而，小鼠具有显著的研究优势，因其可进行基因改造，并可培育为免疫缺陷品系，不会排斥人类细胞和组织。

本文介绍了一种利用常规实验室和兽医设备在小鼠股骨上制造节段性骨缺损的技术。经过练习，大多数经过培训的兽医和动物研究人员均可完成固定装置的制备及手术植入。通过示例数据，我们还提供了该模型骨愈合定量分析的方法学。

引言

据估计，到65岁时，美国有一半人口会发生骨折¹。在接受手术治疗的骨折患者中，每年有50万例手术需要使用骨移植材料²，并且随着人口老龄化加剧，这一数字预计还将上升³。尽管骨骼是少数能够完全愈合而不留瘢痕的器官之一，但在某些情况下，其愈合过程仍会失败^3,4。根据具体情况和治疗质量的不同，长骨骨折的失败率在2%至30%之间，导致骨不连^3,5。尽管对于定义尚存争议，但假关节、临界尺寸缺损或骨不连性骨损伤通常是指在实验动物或患者自然寿命内无法自行愈合的损伤⁶。在实验研究中，该时间被缩短为普通大小骨损伤完全愈合所需的平均时间。骨不连的发生原因多种多样，主要因素包括造成临界尺寸缺损的严重创伤、感染、血管生成不良、吸烟，或因疾病或年龄导致的骨再生能力受损⁷。即使骨不连最终得到成功治疗，每例手术的费用也可能超过6万美元，具体金额取决于损伤类型及所采用的治疗方式⁸。

对于中度病例，通常采用自体骨移植。该策略涉及从供体部位获取骨组织并将其植入损伤部位。尽管这种方法非常有效，但可供使用的供体骨量有限，且该操作需要额外的手术，导致许多患者出现持续性疼痛^9,10。此外，自体骨移植的效果依赖于患者的健康状况。由合成材料或经处理的尸体骨制成的骨替代物虽然来源丰富^11-13，但存在显著局限性，....

方案

注意：本实验方案专为来自杰克逊实验室（Jackson Laboratories）的雌性裸鼠（Nu/J）（18–25 g，6周龄）设计。由于不同品系小鼠在解剖结构和生长速率上存在轻微差异，建议在将针体植入活体动物之前，根据受体小鼠的品系、性别和年龄优化针体的制备。若品系匹配得当，针体与骨髓腔之间的过盈配合具有高度可重复性。有关动物饲养、饮食及常规动物管理的操作程序不在本方案范围内，但所有小鼠的饲养均遵循《实验动物护理与使用指南》。 (8^th 版本 以及斯科特与怀特医院的机构动物护理与使用委员会（IACUC）和比较医学部（DCM）制定的机构政策。

1. 针的制备

图 2：针的组装。（A） 外科级不锈钢管在不同组装阶段的照片，以及从5 mm厚的明胶海绵片上切割下的直径为4 mm的圆柱体。....

结果

小鼠通常在停止麻醉后5-10分钟内恢复意识和后肢活动能力。术后前5天建议将小鼠单独饲养，并提供环境丰富化措施，以防止肢体过度使用。为此，圆顶形窝巢可减少筑巢需求并促进休息。我们还观察到，在笼底提供食物和水凝胶可降低钢针移位的可能性。在此5天期间，应根据机构批准的政策按需给予镇痛处理。术后5天内，体重减轻最多可达术前体重的约15%。术后24小时建议对患肢进行X光检查，以评估钢针位置。钢针应完全插入近端和远端骨髓腔，骨缺损边缘应与套管 collar 齐平（图2C、2E、图5E 和 图6A）。在极少数情况下（<5%的病例），钢针可能在愈合早期发生脱位，动物使用方案应包含在此情况下进行翻修手术的预案。尽管在小鼠股骨上定量扭转运动在技术上具有挑战性，但通过标本的手动触诊证实，随着钢针周围结缔组织的积累，术后7天时扭转和纵向运动已微乎其微。完成术后5天的监测后，可根据机构批准的政策将小鼠恢复至常规群养环境。

若不进行治疗干预，缺损边缘在21天内通常会扩展0.5 mm，但在少数情况下，新骨生长可.......

讨论

本文介绍一种利用标准实验室和兽医设备在小鼠股骨上制造临界尺寸针固定缺损的简单方法。尽管针具的组装和手术操作本身需要一定练习，但对于训练有素的生物医学科研人员或兽医而言，均可熟练掌握。

将钢针置入髓腔时无需额外固定，这使得该操作在技术上比使用外固定器或锁定螺钉的更复杂方法更具可行性。尽管在愈合早期阶段可能会发生一定程度的扭转运动，但通过仔细选择钢针直径并对髓腔进行充分扩髓，可使植入物与骨内膜之间形成牢固的过盈配合，从而最大限度地减少扭转。通过谨慎选择近交品系，并匹配年龄与性别，可在数天内实现稳定且可重复的固定效果。然而，随着3D打印技术的发展，未来有望通过改进钢针设计（如增加粗糙表面和/或带倒钩的附着位点）进一步减少扭转运动。由于钢针易于制作，且市面上有多种规格的皮下注射针管可供选择，因此该技术几乎可针对任何成年近交系小鼠进行优化，无论其具有何种天然或实验诱导的骨表型。

独特的销钉-套环设计具有两个目的：（i）防止因纵向滑移导致缺损异常变窄以及骨端损伤；（ii）提供解剖标志，以界定缺损的原始边界。因此，可使用如Skyscan 1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针组件
Dremel 旋转工具	Dremel	8220	或同等产品
重型切割轮	Dremel	420
手术管 19 G	Small Parts（亚马逊）	B000FMZ8LY	外径 1.07 mm，内径 0.889 mm
手术管 21 G	Small Parts（亚马逊）	B000FMZ8YQ	外径 0.82 mm，内径 0.635 mm
手术管 22 G	Small Parts（亚马逊）	B000FMYLZS	外径 0.719 mm，内径 0.502 mm
手术管 23 G	Small Parts（亚马逊）	B000FN0SY0	外径 0.643 mm，内径 0.444 mm
氰基丙烯酸酯粘合剂	Loctite	1365882
砂磨片	Dremel	413
橡胶抛光头	Dremel	462
毛毡抛光盘	Dremel	414
明胶海绵	Surgifoam/Ethicon	1974
穿孔活检切割器	Miltex	33-34
手术/术后处理
加热垫和循环泵	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
四价消毒喷雾	Steris	1429-77
珠式灭菌器	Germinator/CellPoint Scientific	Germinator 500
麻醉系统	VetEquip Inc	901806 或 901807/901809
异氟烷麻醉剂	VETone/MWI	501017, 502017
外科消毒剂	Chloraprep/CareFusion	260449
手术器械	Fine Science Tools	多种型号	推荐德国制造
面部防护	Splash Shield	4505
可充电高速钻	Fine Science Tools	18000-17
金刚石切割轮	Strauss Diamond	361.514.080HP
可吸收缝合线	Covidien	UM-213
外层缝合线	Ethicon	668G	或同等产品
Vetbond	3M	1469SB	或同等产品
水合凝胶	Clear H2O	70-01-1082
营养凝胶	Clear H2O	72-01-1062
丁丙诺啡	Reckitt and Benckiser	12496-0757-01	管制药品
小鼠窝	Bio Serv	K3328, 3570, 3327
安乐死混合剂	Euthasol/Virbac	710101	管制药品
分析
活体动物成像仪	Orthoscan	FD Pulse	或同等产品
显微CT设备及软件	Bruker	Skyscan1174	或同等产品
密封膜/Parafilm M	VWR 或 Fisher	100501-338, S37441
*纱布、手术单、防护服、动物护理设备等其他物品可使用通用来源。