基于蛋白脂质体的外排实验测定 Cl⁻ 通道单分子特性- 通道蛋白与转运蛋白

摘要

蛋白脂质体用于在明确的生化环境中研究纯化的通道蛋白和转运蛋白。本文图示了一种用于检测这些蛋白介导的外排作用的实验方法。详细描述了制备蛋白脂质体、进行记录以及分析数据以定量确定重组蛋白功能特性的各个步骤。

摘要

过去15年见证了从原核生物以及真核生物中过表达和纯化膜蛋白能力的迅猛发展。这一进步主要得益于获取膜蛋白结构信息的成功推动。然而，对这些蛋白进行功能性研究的能力并未以同等速度发展，通常局限于定量价值有限的定性检测，从而限制了其提供的机制性见解。本文描述了一种用于定量研究重建的Cl^-通道或转运蛋白运输活性的检测方法。该方法基于在加入K⁺离子载体缬氨霉素以消除膜电位后，测量Cl^-从蛋白脂质体中的外流速率。使用离子选择性电极监测目标蛋白重建的蛋白脂质体中离子外流的时间进程。该方法非常适用于机制研究，因为它能够定量测定重建蛋白的关键特性，例如其单体运输速率、活性蛋白所占比例以及功能单元的分子质量。该检测方法还可用于确定小分子化合物对重建蛋白的直接抑制或激活作用，以及测试膜组成或脂质修饰试剂的调节效应。在可能的情况下，使用该方法获得的结果与电生理学方法所得结果具有良好的一致性。本技术以CLC-ec1（一种CLC型H⁺/Cl^-交换体）作为模型系统进行演示。该外流检测法可用于研究任何传导Cl^-的通道/转运蛋白，并且经过极少改动后，亦可适用于研究其他离子转运蛋白。

引言

在过去的二十年中，过表达和纯化膜转运蛋白的能力显著提高：离子通道、初级和次级转运蛋白现在可常规地从异源表达系统以及天然来源中纯化。目前正不断开发新的方法来监测表达、改进并简化这些蛋白的提取过程，以及增强其稳定性^1-5。这些技术突破极大地推动了膜蛋白原子水平结构信息的迅猛增长，进而加深了我们对其功能结构基础的理解。相比之下，我们对纯化后蛋白功能特性进行检测的能力并未以同等速度发展，导致在某些情况下，高分辨率的结构信息仅伴随定性的功能数据，从而限制了我们对基于结构的预测进行定量验证的能力。因此，开发定量且具有普适性的功能检测方法，是阐明膜蛋白功能机制基础的关键步骤。

本文介绍一种外排实验方法，可用于定量测定纯化并重组的Cl^-通道和转运蛋白的关键功能特性。该实验的基本原理可推广至多种转运系统，以及非离子转运蛋白。将纯化的Cl^-通道/转运蛋白在存在较大Cl^-浓度梯度的条件下重组入脂质体中（图1A、B）。通过添加离子载体启动Cl^-外排，以允许反离子流动；在本实验中使用K⁺离子载体缬氨霉素，其可旁路由Cl^-梯度建立的膜电位，并将初始膜电位设定为K⁺的平衡电位^6,7。若无离子载体存在，则不会发生显著的净Cl^-外排，因为跨膜电位的产生会阻止其进行。实验数据可通过两个可测量参数进行定量描述（图1C）：τ（Cl^-外排的时间常数）和f₀（不含活性蛋白的脂质体比例）。由τ和f₀可推导出单个Cl^-转运速率、活性蛋白的比例以及活性复合物的分子质量⁸。本文以重组了CLC-ec1的蛋白脂质体为例说明该技术；CLC-ec1是一种结构与功能均已明确表征的CLC型H⁺/Cl^-交换体。该方法可轻易推广至具有不同离子选择性、或其活性依赖于电压和/或配体存在的通道或转运蛋白。此外，该实验还可用于确定小分子是否直接作用于重组蛋白，定量分析这些化合物的影响，以及研究膜组成或脂质修饰试剂如何影响重组通道和转运蛋白的功能。

方案

1. 脂质制备

1. 将所需量的脂质分装至透明玻璃管中。使用 E. coli 极性脂质提取物，但大多数脂质组成均可使用。若脂质为粉末状，用氯仿重悬至浓度为 20 mg/ml。在室温下用 N₂ 气体吹干，直至所有溶剂完全蒸发。
2. 用戊烷重悬脂质，并再次用持续的 N₂ 气流吹干，以去除残留的微量氯仿。持续干燥至所有溶剂完全蒸发。干燥过程中，轻轻旋转试管，使脂质均匀成膜，覆盖试管底部三分之一区域，而非在底部形成致密团块。
3. 加入含去垢剂的重构缓冲液（300 mM KCl，50 mM 柠檬酸，25 mM K₂HPO₄，pH 4.5，35 mM CHAPS）以溶解脂质。若蛋白对 CHAPS 耐受性较差，可在此步骤中使用其他温和去垢剂。
4. 使用水浴超声仪将脂质重悬至澄清。将试管置于水浴超声仪中心，以最大功率进行短时（30 秒至 1 分钟）脉冲超声，每次超声后间隔短时（30 秒至 1 分钟）暂停。溶液应逐渐变为澄清。
   注意：最终达到的澄清程度取决于所用的具体脂质组成。即使使用名义上相同的脂质，不同批次之间也可能存在一定的差异。残留的浑浊是由于悬浮液中大颗粒对光的散射所致，可通过离心去除。
5. 将重悬后的脂质在室温下孵育 20–60 分钟。

2. 蛋白脂质体的形成

注意：可采用多种策略将去污剂溶解的蛋白质插入脂质体中。对于 CLC-ec1，透析效果良好，因此是首选方法^6,9,10。

1. 将纯化的蛋白质加入至所需的蛋白质与脂质（P/L）比例（以 µg 蛋白质/毫克脂质）。P/L 比值的选择取决于实验目的。
   1. 如果目标是评估目的蛋白的活性，应在高蛋白/脂质比（P/L）条件下进行重建，以最大化信号强度，因为每个脂质体含有多个拷贝的蛋白。若要定量分析蛋白的活性和/或单分子转运速率，则应在低 P/L 条件下采用泊松稀释体系进行重建，使每个囊泡平均含有 1 个蛋白。有关何时使用每种体系的更深入分析，请参见步骤 7 和讨论部分。
2. 为确定各种方案的最佳P/L值，需对活性随蛋白浓度的变化进行完整的滴定。 ^8,11-13然而，对于已知其活性单位分子量（MW，以 kDa 表示）的任何蛋白质，可使用以下 P/L 值作为初步估算：
   
   
3. 将蛋白质和脂质混合物加入预先润湿的透析管或透析盒中。将透析装置置于含有500-1,000倍脂质重组缓冲液体积的烧杯中（即，1 ml 脂质重悬液使用 1 L 缓冲液，在温和搅拌下进行。
   1. 每隔一段时间更换缓冲液 3-4 次 >3 小时。每次更换溶液时，用蒸馏水清洗 cassette/管路和烧杯，并向烧杯中加入新鲜的重构缓冲液。溶液更换过程中应包含 1–2 个过夜间隔。溶液更换的具体次数和持续时间取决于所使用的特定脂质和去污剂。
4. 最后一步完成后，将脂质体从透析装置中取出，分装至离心管中，并在液氮中速冻₂ 或在 -80 °C.

3. 记录装置设置

注意：记录装置（图2A）由两个腔室（平底圆柱形，体积约3-4 ml）、一个Cl^- 电极（见下文）、一台带有模拟或数字电信号输出的pH计、一个数字转换器，以及一台配备适当采集软件的计算机组成。

1. 将 Cl^- 电极连接到 pH 计，再将 pH 计的输出端连接至与计算机相连的数字转换器。将参比电极置于一个腔室中，记录导线置于另一个腔室中（图 2B）。
   注意：若 ΔV_Cal（见步骤 6.4 和 7.2）为正值，则表明导线极性连接正确。
2. 将腔室放置在磁力搅拌器上，并在记录腔室中放入搅拌子（图 1B）。确保搅拌子不接触电极。
3. 使用琼脂桥（图 2B）（含 100 mM KCl 和 2% 琼脂糖）连接两个腔室。琼脂桥应保存在 100 mM KCl 溶液中。

4. Cl 的制备^- 电极

1. 取一支老旧且可能已无法正常工作的 pH 电极。打破玻璃涂层，完全暴露银丝。
2. 使用解剖刀片小心去除银丝表面的涂层。用大量 H₂O 和 EtOH 清洗银丝。
3. 将银丝置于饱和的 FeCl₃ 溶液（或漂白剂）中，直至其表面被一层均匀的黑色 AgCl 涂层覆盖。

5. 单层囊泡的制备

1. 实验前一晚，将1 g Sephadex G-50珠粒加入15 ml外部缓冲液（1 mM KCl，150 mM K₂SO₄，25 mM柠檬酸，pH 4.5）中，轻轻振荡（切勿搅拌），室温溶胀至少3小时。每次实验需使用约3 ml溶胀后的珠粒。溶胀后的珠粒最多可在4 °C保存数天。
2. 当脂质体在室温解冻时，向每根层析柱中加入约3 ml溶胀后的G-50珠粒。让其在室温下依靠重力自然干燥，通常需要1–2分钟。
3. 使用Mini-Extruder装置，将蛋白脂质体通过0.4 µm聚四氟乙烯（Teflon）滤膜挤出11次，以制备单层脂质囊泡。
4. 将层析柱置于塑料圆底试管中。离心去除多余液体：在临床离心机中以1,400 × g离心20–30秒。
5. 弃去穿流液，将层析柱转移至一支13 × 100 mm玻璃试管中，向柱顶加入100 µl挤出后的囊泡溶液。在临床离心机中以500 × g离心1分钟。
6. 收集约200 µl穿流液，用于步骤6.5中加入记录室。

6. 外排测量

1. 在参考（接地）室中加入 2 ml 的 100 mM KCl，在记录室中加入 1.8 ml 外液缓冲液（1 mM KCl，150 mM K₂SO₄，25 mM 柠檬酸，pH 4.5）。内外溶液之间轻微的渗透压不平衡不会影响
2. 启动采集程序。让基线达到平衡，这可能需要几分钟。
3. 当信号达到稳定基线时（脂质体已准备就绪且柱子已干燥），开始记录（图 3A）。
4. 加入 15 µl 的 10 mM KCl 溶液以校准系统（图 2A）。
5. 加入脂质体。由于蛋白脂质体表面残留的外部 Cl^- 未完全去除，可能会观察到一个小的信号跳跃（图 3A）。等待基线重新稳定。
6. 加入缬氨霉素（1 µl，1 mg/ml 溶于乙醇）以启动外排（图 3A）。
7. 让外排过程持续进行，直至信号趋于平稳（图 3A）。
8. 加入 40 µl 用外液缓冲液配制的 1.5 M β-辛基葡萄糖苷（β-OG），以溶解所有脂质体（图 3A）。结束记录。

7. 数据分析

1. 将以 ASCII 或文本格式导出的迹线文件导入所选的分析程序。
2. 测量以下各点的电压（图 3A）：
   记录开始时的电压（V₀）；
   加入校准脉冲后的电压（V_cal）；
   加入脂质体后的电压（V_lipo）；
   外排结束时的电压（V_fin）；
   加入去垢剂后的电压（V_tot）；
   对电压进行基线校正，使 V₀=0。
3. 使用 Nernst-Planck 方程，通过测量以下表达式来确定 的实验值：
   
   其中 Vol_Cal 为校准脉冲的体积（单位为 µl），1,800 为实验开始时的腔室体积（单位为 µl），[Cl]_cal/in 为校准脉冲和外部缓冲液中的 Cl^- 浓度（单位为 mM），ΔV_cal 为加入校准脉冲后测得的电压跳跃值（单位为 mV）。
   注意：该 α 值的经验测定具有三个目的：确保系统响应正常，评估仪器在不同实验间响应的一致性，以及验证溶液配制过程中无误。
4. 按以下方式计算每一步骤后的 Cl 浓度：
   
   
   
   系数 3/400 来源于 15 µl 校准脉冲稀释至最终体积 2,000 µl 所得。
5. 计算每一步骤中 [Cl] 的变化量，即 ΔCl_{lipo/fin/tot.}。
6. 通过以下公式将 V(t) 转换为 Cl(t)：
   
   直接测定关键点的 [Cl] 值，并将其与计算值进行比较，作为内部对照。
7. 对迹线进行归一化处理，使 Cl_rel^lipo=0 且 Cl_rel^tot=1：
   
8. 将外排时间过程拟合至以下方程：
   
   其中 L 为 Cl^- 泄漏速率，通过在相同条件下制备的不含蛋白脂质体的 Cl^- 外排实验测定，τ 为该过程的时间常数。
9. 计算初始速度 v：
   
   其中 ΔCl_fin 以毫摩尔（mM）表示，V 为腔室体积（单位为 μl）。
10. 计算转运速率/电导：
    
    其中 p 为 P/L，MW 为活性复合物的分子量（单位为 kDa）。

结果

我们描述了一种详细且稳健的实验方案，用于测量在脂质体中重建的纯化CLC-ec1（一种原核生物CLC型H⁺/Cl^-交换体）所介导的Cl^-转运。该实验的示意图见图3。将含有高浓度内腔Cl^-并重建了纯化CLC-ec1的蛋白脂质体浸入低Cl^-的浴液中。在此条件下，由于脂质体内部正电荷的积累，净Cl^-外流受到抑制（图3A）。加入缬氨霉素后，K⁺得以跨膜移动，从而分流膜电位，启动Cl^-外流（图3B）。通过Cl^-选择性电极监测外流动力学过程，并通过去垢剂溶解脂质体直接测定囊泡中所含Cl^-的总量。基于这些整体实验，可推导出单个重建蛋白的特性，例如周转率、活性复合物的化学计量比以及活性蛋白的比例。利用公式7-9拟合外流时间过程并估算CLC-ec1的单分子转运速率，我们得到τ(0.2 µg/mg) = 41 秒，f₀(...

讨论

我们已描述了一种详细方案，用于测量在脂质体中重建的纯化阴离子选择性通道或转运蛋白所介导的Cl^-转运。所用示例为原核生物H⁺/Cl^-交换体CLC-ec1。然而，通过将Ag:AgCl电极替换为适合目标离子的电极，该方法可轻松适用于研究由配体^12,13,15、电压^11,12门控或具有不同阴离子选择性^15,16的通道。针对除Cl^-以外其他离子（如H⁺、I^-和F^-）的选择性电极可商业获得。

以下对一些关键步骤和假设进行讨论。

泊松稀释假设的局限性

单通道速率（公式7-9）的推导仅在泊松稀释条件下成立，即大多数脂质体仅包含一个活性蛋白，使得特定囊泡中存在多个拷贝的概率较低，且囊泡群体的宏观外排时间常数可很好地近似为仅含单个蛋白的脂质体的时间常数。事实上，通过比较在低蛋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂质体合成仪，Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 台式离心机	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A 数字式 pH/mV 计			可在 eBay 上找到。
非功能性 pH 探头			任何带有银丝的 pH 计探头均可使用。需去除玻璃/塑料涂层，并清洁金属丝。
DI-710 数据记录仪	DATAQ instruments
WinDAQ 数据采集软件	DATAQ instruments
Pierce 一次性塑料层析柱，重力流，2 ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX 培养管，一次性，硼硅酸盐玻璃	Kimble Chase	73500-13100
带支架/加热块的挤出器套装	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
计算机