通过化学固定法为X射线荧光成像制备贴壁细胞

摘要

本文介绍了一种利用同步辐射X射线荧光技术测定样品中金属元素含量与分布的实验方案。我们以贴壁细胞为重点，描述了用于制备此类样品的化学固定方法。随后，详细说明了如何利用同步辐射X射线对样品进行装载与成像。

摘要

X射线荧光成像技术能够对大范围或小范围样品区域内的多种元素进行无损、同步的空间分布和浓度测定。该技术已广泛应用于多个科学领域，包括材料科学、地球科学、文化遗产研究以及化学生物学。在化学生物学领域中，例如通过可视化细胞内金属元素的分布，可以研究细胞中天然存在的金属离子，以及外源性引入的金属物质，如药物和纳米颗粒。由于几乎所有生物样品都处于完全水合状态，目前最理想的成像方式是采用冷冻固定后在低温条件下进行成像。然而，在无法便捷获取或实际操作受限的情况下，基于醛类的化学固定法仍然具有应用价值，有时甚至是不可避免的选择。本文尽可能详细地描述了通过化学固定法来制备贴壁哺乳动物细胞以用于X射线荧光成像的全过程。

引言

X射线荧光成像能够对样品中所含元素的种类和含量进行空间分辨。入射X射线的能量被选择为高于待测最重元素的电子结合能，从而克服内壳层电子与原子核之间的结合能¹。这一过程在电子壳层中产生“空穴”。当高能电子跃迁填补这些空穴时，会发射出荧光X射线，其波长取决于这些轨道之间的能量差。由于轨道间能量间隔是特定元素的特征，X射线荧光发射也具有特征性的波长，该波长取决于元素种类。正是这种在特征波长处的发射使得能够识别样品中存在的元素。通过对荧光强度进行校准，可实现对元素含量的定量分析。

X射线荧光显微技术（XFM）的应用日益广泛，部分原因在于高亮度X射线同步辐射光源的发展，例如日本的Spring-8、法国的欧洲同步辐射装置（ESRF）以及美国的先进光子源（APS）²。这些光源可提供极高强度的X射线束。与此同时，X射线光学技术的进步，如波带片技术，使得这些光束能够被聚焦到亚微米尺度的光斑上，尽管效率相对较低³。由于X射线束强度极高，即使仅有少量光子被成功聚焦，也足以激发细胞内源性金属元素，产生可被现有探测器技术检测到的信号。因此，研究细胞内金属元素的化学生物学成为该技术近年来诸多进展的重要应用之一^4-10。

在应用X射线荧光显微技术（XFM）研究培养的哺乳动物细胞或其他生物样品中的元素分布与定量时，需考虑诸多关键因素。首先，样品必须在结构和元素组成方面保持完整，以确保测量结果具有实际意义。其次，样品还需以某种方式加以保存，以耐受聚焦X射线束可能引起的辐射损伤。实现上述两个条件的一种方法是将样品迅速冷冻为玻璃态的非晶态冰^11,12。快速冷冻通常通过各种低温保存技术实现，例如浸入式冷冻或高压冷冻^13-16。普遍认为，低温保存能够将生物样品的整体细胞结构和化学组成尽可能地维持在接近天然状态。相比之下，化学固定由于固定剂在细胞和组织中的渗透缓慢且具有选择性，以及后续细胞膜通透性的改变，可能导致多种细胞内离子（尤其是可扩散离子，如Cl、Ca和K）发生浸出、丢失或重新分布，从而不利于对这些元素的准确研究^17-19。尽管总体而言，低温固定相比化学固定具有明显优势，但对于贴壁生长的哺乳动物细胞而言，低温保存仍存在多种局限性^20-23。最明显的问题是，并非所有研究实验室都能方便地获得低温保存设备。目前大多数高压冷冻机甚至浸入式冷冻装置价格昂贵，仅由少数专门的低温设施拥有，而这些设施的位置可能远离细胞培养场所。低温保存所带来的优势可能被细胞在运输过程中所承受的应激劣势所抵消。因此，尽管低温保存无疑是为X射线荧光分析保存样品最严谨的方法，但它并非在所有情况下对所有研究人员都易于实施；也并非总是必需的——如果所关注的金属元素紧密地结合在可固定的生物大分子上，且样品成像的分辨率高于干燥过程中可能造成的超微结构损伤程度。在充分认识到这些局限性的前提下²⁴，化学固定与干燥仍可能是一种合适的选择。

成功进行X射线荧光成像实验的其他因素包括恰当的分析。X射线荧光成像本质上是将X射线荧光发射光谱与光栅扫描相结合，以实现空间分辨。所采集的X射线荧光发射光谱包含重叠的发射峰、背景信号以及入射光束的弹性与非弹性散射峰。能够对这些组分进行解卷积并拟合发射峰的软件，是该领域发展的关键²⁵。此外，已知成分的薄膜标准样品的开发及其商业化供应，用于校准荧光强度与物质含量之间的关系，也具有重要意义。

本方案描述了通过化学固定和空气干燥制备贴壁细胞的方法。该过程中的关键步骤是在氮化硅窗口上培养细胞，由于细胞通常不易贴附，因此以特定方式轻柔清洗是成功的关键。

方案

1. 仪器、基质、培养基和培养皿的准备

1. 氮化硅（Si₃N₄）的处理₃N₄）窗口。
   1. 轻轻挤压胶囊一端含有窗口的部分，使胶囊略微打开，注意不要挤压到窗口本身，同时用另一只手旋转胶囊的另一端。
   2. 在体视显微镜下检查一对反向细尖镊子，确保其尖端无粘附物、缝隙或弯曲。否则，在后续步骤中镊子可能会损坏窗片或将窗片弹飞。
   3. 用镊子轻轻夹住窗片的框架，同时用手轻轻挤压胶囊靠近开口的一端，施加压力的方向应使窗片边缘需伸出部位的胶囊扩张，从而将窗片从胶囊中取出。
2. 窗板预清洗（可选）。
   1. 必要时，可先将玻片轻轻浸入蒸馏水中5秒，随后在70%乙醇中洗涤2分钟，再在100%乙醇中洗涤2分钟。
3. 在培养皿上固定并灭菌窗口
   1. 将窗口平的一面朝上放置于培养皿底部以固定窗口，在干净的玻璃载片上贴一条胶带，沿胶带长边剪下约四分之一英寸宽的条状部分，再从短边取下一小段胶带（在 ⅛” 由 ¾”用干净的剃须刀片。
   2. 使用镊子将胶带片贴在网格或窗口边缘，用量应足以牢固粘附，但不得覆盖窗口开口本身。用镊子操作已粘附的胶带，将窗口轻轻放置于培养皿底部。再用镊子尖端将胶带牢固地粘贴在培养皿底部。
   3. 用另一条胶带贴附于另一侧边缘，并用镊子尖端将其底部牢固地粘附。
   4. 所有窗口贴好胶带后，使用紫外线（UV）辐射对培养皿中的窗口进行灭菌。操作时，将培养皿置于超净工作台内的紫外灯下照射约1小时。
   5. （可选）若需预先用多聚赖氨酸包被玻片，请在玻片灭菌后进行。用10 μ1 mL 无菌 0.01% 聚-L-赖氨酸溶液，在 37 ℃ 下孵育 1 小时 °C 培养箱中孵育，然后用培养基冲洗去除残留溶液。
4. 在XFM最终洗涤前准备缓冲液。
   1. 制备Tris-葡萄糖或哌嗪-N,N’不含任何痕量金属的哌嗪-1,4-二(乙磺酸)（PIPES）-蔗糖缓冲液，其渗透压和pH值与不含钙、镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）相当。在化学固定细胞后，使用其中一种缓冲液冲洗细胞。
      1. 配制Tris-葡萄糖溶液（10 mM Tris，260 mM葡萄糖，9 mM乙酸），加入1.4 g葡萄糖、36 mg Tris碱和16 μL乙酸 µ将乙酸加入20 ml超纯水中，定容至30 ml。无需调节pH。室温保存，可稳定存放一周。
      2. 加入0.18 g PIPES和2.0 g蔗糖至20 ml超纯水中，配制PIPES-蔗糖溶液（20 mM PIPES，200 mM蔗糖），用少量浓乙酸调节pH至7.4，再用超纯水定容至30 ml。室温保存，最多可使用一周。
         注意：最终漂洗步骤避免使用PBS的原因是，PBS中磷酸盐、氯化物和钾的浓度较高，若在空气干燥前未完全去除，可能会干扰X射线荧光显微成像（XFM）。
5. 准备细胞铺板用缓冲液。
   1. 准备或取出所有培养基，例如 RPMI 1640 培养基、1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液、D-PBS，以及根据特定贴壁细胞系所需使用的其他试剂（如同常规传代目标贴壁细胞时的操作），并将它们预热至 37 °C.

2. 细胞接种

1. 在超净工作台中，向含有窗口的已灭菌培养皿沿侧壁缓慢加入培养基（100 mm 培养皿加 10 ml），同时将培养皿倾斜一定角度。避免产生不必要的表面张力，切勿将培养基直接滴加到氮化硅窗口表面。随着培养基的加入，逐渐减小倾斜角度，使培养基缓慢覆盖网格和窗口表面。
2. 按照常规传代方法，对目标贴壁细胞系进行适当处理，使用胰酶消化或刮取法将细胞从培养板上分离。在将细胞接种至新培养皿前，完成必要的细胞计数及其他准备工作。
3. 将细胞以适当密度接种至含窗口的培养皿中，确保细胞在 24–72 小时内通常达到 50%–70% 汇合度，随后在 37 °C、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育。
4. 使用倒置光学显微镜定期观察细胞生长情况，直至达到所需细胞密度（通常为 50%–70% 汇合度）。

3. 细胞固定

1. 通过稀释购买的储备液（如25%多聚甲醛），用乙酸调节pH至7.4，配制新鲜的4%多聚甲醛D-PBS溶液（以避免向样品中添加过量钠离子）。
2. 当细胞培养达到所需状态，并完成活体染色（如Hoechst染色）及成像后，用手将培养皿倾斜约45°角，另一只手用移液器轻柔吸除培养基。
   注意：也可不通过移液方式去除废液，而是将小室取出，先后浸入两个装有D-PBS的微量离心管中各一次，随后将其放入含有固定液的新培养容器中固定20分钟，再用PBS洗涤两次以去除残留固定剂。若采用此方法，请直接进入步骤3.5。
3. 用D-PBS轻柔冲洗培养皿，然后在保持培养皿倾斜45°角的情况下，沿皿壁缓慢加入新鲜的4% PFA/PBS溶液，并逐渐放平培养皿，使固定液均匀覆盖小室表面。室温下让细胞在固定液中覆盖孵育20分钟。
4. 再次采用上述方法，轻柔倾斜培养皿并用移液器吸除液体。
5. 使用步骤3.3中所述的倾斜与移液方法，轻柔加入适量PIPES/蔗糖溶液以替换已去除的液体。
6. 重复步骤3.4和3.5。
7. 准备干燥所需材料。
   1. 准备好无尘纸巾（如Kimwipe），从盒中抽出一张备用，以便快速、方便地取用。
   2. 准备一个干净且非水平的放置位置用于晾干小室。铺设一种常用于电子显微镜的带棱纹橡胶网格垫，使小室可在干燥过程中一端支撑在棱上。这可防止小室在干燥时粘附于支撑表面，并使残余缓冲液流向样品边缘排出。
8. 小心使用镊子夹住连接在小室上的胶带，将小室从液体中提起。对于脱离胶带的小室，可滴加少量PIPES/蔗糖溶液使其漂浮，再用反向镊子将其拾起。
9. 用Kimwipe小心地（切勿触碰小室表面）彻底吸干小室边缘多余的PIPES/蔗糖溶液。同时，使用折叠成圆形的Kimwipe擦拭小室背面的凹陷区域。
   注意：目标是尽可能减少盐类或缓冲液在小室表面结晶。
10. 将小室放置于网格垫上。确保小室并非平放在网格垫上，而是借助网格垫的棱边支撑起一端，并尽量减少与网格垫的接触面积。让小室自然干燥。

4. 样品制备与成像

1. 样品干燥后，使用光学显微镜检查窗口上是否存在细胞。在将样品送往同步辐射光源之前，需完成此项检查。
2. 将窗口样品妥善包装，准备运送到同步辐射光束线实验站。用胶带轻轻将窗口固定在载玻片的两侧，再将载玻片用胶带固定于塑料培养皿底部，并用胶带将培养皿封好。
   注意：在此之前的所有步骤可在任何常规实验室中进行。以下步骤建议在同步辐射光束线处完成。
3. 用镊子小心去除窗口上的胶带。沿窗口边缘均匀涂上一层薄薄的指甲油，将窗口牢固地固定在同步辐射光束线合作者提供的铝制样品托上。
4. 将铝制样品托插入运动学支架中，然后将其安置到X射线显微镜的指定位置。将样品安装在连接至电动位移台的支架上，置于光束线样品腔室内。
5. 离开样品X射线显微镜仪器区域（由填充铅的墙体构成的屏蔽舱）后，开始设置扫描参数。使用光束线专用软件，在相机图像引导下选择待扫描的样品区域；该相机配备视频十字准线，并已与下游闪烁体相机预先对准，可用于实时观察X射线束在样品上的位置。
6. 根据目标样品中最小特征尺寸的估计值，选择合适的分辨率。对于成像单个哺乳动物细胞（大小约为20–40 µm），应采用0.25–0.5 μm的分辨率；对于组织区域成像并区分不同细胞层，则应采用2–20 μm的分辨率。
7. 根据样品中目标金属含量的估计值，选择合适的停留时间。若进行快速概览扫描，或样品中含有较高浓度的金属，可采用飞行扫描模式，每个像素的停留时间为30–300毫秒；若样品中物质含量较低，或需检测相对丰度较低的金属元素，则应采用步进扫描模式，每个像素的停留时间为1–2秒。
8. 将扫描参数输入光束线专用软件，执行光栅扫描成像。与光束线合作者共同使用分析软件处理数据，识别各元素的特征能量峰。

结果

X射线荧光成像提供生物样品信息的能力取决于样品的制备方式，即样品必须在实验时间尺度上具有抗辐射损伤的稳定性，同时其化学和结构特征又能得到良好保存。观察按照上述方法制备并成像的样品结果，可以看出样品中元素分布存在差异——表明固定过程保留了细胞的这些特征（图1）。

相反，观察一个该过程未成功进行的样品，缓冲液在干燥过程中仍然存在，其中存在的分子会形成大量晶体，从而对细胞结构造成损伤，并干扰X射线荧光光谱的采集（图2）。

这些图像通过逐像素拟合图像中每个点的X射线荧光光谱生成，这意味着在每个像素处采集的每条光谱均经过了独立分析。在查看由拟合数据生成的这些图像面板时，图像中每个点所赋予的值是对应特定元素特征发射峰的高斯函数积分总和例如， 铁）以最佳拟合在该点采集的X射线荧光光谱。例如，图像中的单个像素具有一个铁元素的数值，该数值等于在铁的特征发射能量处的高斯曲线下的面积总和，该高斯曲线用于拟合并建模样品上该点的发射光谱数据。数据通过每个图像上方的阈值...

讨论

X射线荧光成像在许多领域中具有重要应用，包括地球科学、材料科学和化学生物学^26-34。同步辐射X射线技术及其聚焦技术的进步，已能够产生极高强度的X射线束。目前已有足够强度的聚焦X射线束，可激发细胞内源性金属，产生的信号能够通过当前可用的硅漂移探测器技术进行检测。其中，研究细胞内金属的化学生物学正是充分利用该领域近年来诸多进展的一个典型应用。

然而，由于生物材料含有水分，在使用X射线荧光显微技术研究生物材料时，相较于其他材料会面临特殊的挑战。为防止辐射损伤，理想情况下应在测量过程中将样品速冻形成玻璃态冰。然而，化学固定和空气干燥对初学者而言更容易实现，如果所关注的金属惰性地结合在可固定的生物大分子上，并且成像分辨率高于干燥过程中可能发生的超微结构损伤程度，则这些方法可能是合适的。

在为贴壁细胞XFM研究选择基底材料时，理想的基底需满足以下基本要求：1）支持细胞 robust 生长，且不干扰细胞正常的增殖及表型；2）其X射线荧光信号不得与目标元素的信号重叠；3）在XFM前可通过光学显微镜观察细胞生长状态，因此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氮化硅窗口	英国Silson有限公司 / J B J商务园 / 北安普顿北路，北安普顿 NN7 3DW，英国	SiRN-5.0-200-2.0-200。按尺寸订购。膜尺寸：1.5 mm × 1.5 mm。厚度：200 nm。框架尺寸：5 mm × 5 mm。框架厚度：200 µm。	替代来源：SPI Supplies / Structure Probe, Inc.，宾夕法尼亚州韦斯特切斯特。
反向镊子	电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – 超细镊子
橡胶载网垫	电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450	71170	圆形载网垫
乙酸	Sigma-Aldrich，3050 Spruce St.，圣路易斯，密苏里州 63103，电话：800-325-3010，传真：800-325-5052	338826	痕量金属级浓乙酸
PIPES缓冲液	Sigma-Aldrich，3050 Spruce St.，圣路易斯，密苏里州 63103，电话：800-325-3010，传真：800-325-5052	P6757	固体PIPES缓冲液
甲醛储备液	电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450	RT 17113	10 × 10 ml安瓿装20%水溶液多聚甲醛