小鼠肋骨切除手术操作：一种大规模长骨修复模型

摘要

本实验的总体目标是从小鼠肋骨上成功切除一段骨组织。该手术程序被开发用于研究大段长骨修复的模型。

摘要

本方案向研究人员介绍了一种利用小鼠肋骨进行大范围骨修复的新模型。该手术程序包括以下步骤：术前动物准备、打开胸壁、从周围肋间肌中暴露目标肋骨、在不引发气胸的情况下切除目标肋骨节段，以及关闭切口。与附肢骨骼的其他骨相比，肋骨具有更高的可及性。此外，由于相邻肋骨可提供天然固定，因此无需使用内固定或外固定装置。该手术采用 commercially available supplies（商业化供应品），易于学习，且动物耐受性良好。该操作可根据需要选择保留或去除周围骨膜，从而评估骨膜在骨修复过程中的作用。研究结果表明，若保留骨膜，可在1至2个月内实现有效的骨修复。我们预期，本方案的应用将推动肋骨修复领域的研究，并有助于开发促进身体其他部位骨修复的新方法。

引言

严重的骨骼损伤、慢性骨关节炎以及与重建手术相关的严重问题，影响着经济生产力、家庭福祉和生活质量。尽管较小的骨折和病损通常能够较好地愈合，但人类自身无法修复较大的骨缺损，因此必须依赖重建手术 来恢复结构与功能。重建方法可能包括同种异体移植、异种移植、碎骨移植、植入支架或牵张成骨术。然而，这些治疗手段不仅常伴随持续的并发症风险，且修复后的骨骼通常难以恢复原有的强度。因此，亟需开发新的临床治疗策略。

开发治疗节段性缺损创新方法的一种途径是研究大规模组织修复自然发生的状况。两栖动物以其能够再生骨骼结构而闻名，而哺乳动物则被认为在这一能力上受限。然而，自20世纪早期以来^th 近一个世纪以来，已有少数关于人类肋骨再生的报道发表，提示人类的再生能力可能并非如此有限^1-4 目前，这一现象在整形外科医生中最为人所知，他们常使用肋骨材料进行下颌、面部和耳部的重建，但其更广泛的意义尚未得到充分认识⁵为了更深入地研究这一修复过程，我们建立了一种使用小鼠的手术模型。通过该方案，研究人员能够鉴定出参与其中的固有因素，并利用这些信息促进其他部位的骨骼愈合。

使用肋骨作为研究骨骼修复的模型具有诸多优势。首先，周围的肋骨提供了天然的固定结构（相比之下，股骨切除则需要额外固定装置^6,7），这降低了使用内外固定装置所带来的并发症风险，并简化了手术操作。其次，胸壁的肌肉层较薄，便于手术入路并提供良好的视野，使该模型在操作便利性上可与颅顶骨切除模型相媲美⁸。第三，与通过膜内成骨方式形成的颅顶骨不同，肋骨通过软骨内成骨方式形成，并通过位于骨干两端的生长板延伸而增加长度。因此，肋骨的修复过程可能更接近附肢骨骼中长骨的修复过程。此外，我们发现与股骨相比，肋骨的骨膜更厚，更易于操作。因此，对于希望研究骨膜功能，或评估细胞治疗、药物制剂和/或组织支架在骨修复中作用的研究人员而言，该手术模型可能尤为适用。总之，这一肋骨切除模型为研究哺乳动物体内自然发生的较大规模骨修复提供了独特的实验体系，而目前尚无被广泛采用的类似模型。

方案

注意：所有操作均符合南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案。

1. 手术准备

1. 准备好必要的手术器械和耗材（已灭菌，参见材料列表中的项目 1 - 18），并在通风橱或下吸式工作台上放置解剖显微镜和光纤透射照明器。
2. 将一只性成熟的成年小鼠（20 - 30 g，1 - 3 月龄）放入诱导室，使用 4% 异氟烷诱导麻醉。
3. 通过脚掌和/或尾部夹捏试验确认麻醉效果。
4. 在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止手术过程中眼睛干燥。
5. 将小鼠转移至显微镜载物台上，将其鼻部接入维持用鼻罩，并使小鼠侧卧放置。在动物旁边放置保温袋以维持体温。
   注：小鼠的放置方向可根据个人习惯或术者惯用手选择，左侧或右侧均可。
6. 将异氟烷浓度调整至 2 - 3% 以维持麻醉，并密切观察呼吸频率。
7. 使用 25 G 针头在腿部外侧 flank 区域皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），用于术后镇痛。注射时腿部可能出现抽动，此为正常反应。

2. 开始切口

1. 通过触诊确定目标肋骨，并用剃刀清除该区域的毛发。
   注意：建议选择第8至10肋，因为第1至7肋靠近肺部，而第11至13肋明显较短。计数肋骨时应从最靠前的肋骨开始，将其记为第1肋。
2. 使用聚维酮碘和异丙醇（70%）交替擦拭进行区域消毒（动物使用方案通常建议重复3次）。
3. 用中号显微外科剪刀在目标肋骨正上方并与其平行处，切开2 cm长的皮肤切口。继续切开下方的肌肉和脂肪层。
4. 将皮肤、肌肉和脂肪三层组织全部置于拉钩中，以充分暴露手术区域，同时尽量缩小切口大小。

3. 切取肋骨

1. 用5.0 mm手术刀切开覆盖在目标肋骨区域的肋间肌。切口位置应位于肋软骨关节近端约5 mm处，因为此处肋骨弯曲程度较小。用精细尖头镊子小心地将肌肉从骨面分离。
2. 为在保留骨膜的前提下进行骨段切除，使用5.0 mm手术刀沿肋骨长轴切开骨膜。用精细尖头镊子小心地从外侧将骨膜与下方骨组织分离。操作时需格外谨慎，因骨膜极为脆弱，质地呈凝胶状。
3. 接着用精细显微剪在骨的一端横向剪断。必要时可通过显微镜中的测微尺或刻度尺测量切除长度。然后小心将骨块从骨膜中抬起，并剪断另一端。
   注意：操作需格外小心。此步骤最为精细，若在未完全切除下方肋骨的情况下强行上提，会撕裂胸膜，导致气胸。一旦胸膜破裂，胸腔内部将清晰可见，易于识别。
4. 若因骨切割出现出血，应用棉签在切口处施加压力4–5秒以止血。
   注意：极少数情况下若出血持续，可能需要终止实验并对动物实施安乐死，因为大量失血将影响其恢复（在不进行液体补充的情况下，可安全丢失的最大血量为总血量的10%，即7.7–8 µl/g。对于一只25 g的小鼠，相当于约180–200 µl⁹）。
5. 立即将取出的肋骨放入4%多聚甲醛（PFA）中，以备后续分析。
   注意：若需同时切除骨组织和骨膜，则跳过骨膜切开与分离步骤（步骤3.2）。由于骨膜与胸膜紧密相连，操作时应谨慎使用镊子轻轻分离肋骨与胸膜，避免撕裂。

4. 关闭切口

1. 使用9-0缝线将肋间肌缝合覆盖在残留的骨膜套上方（通常使用2针即可）。将缝线置于肋骨切断端的正上方，以作为手术位置的标记。
2. 移除牵开器。使用9-0缝线缝合表层肌肉和脂肪组织（通常使用3至4针即可）。对于肌肉和/或脂肪层特别厚的小鼠，应分别缝合各层（e.g.，肌肉层使用一层缝线，脂肪层另使用一层缝线）。
3. 使用7-0缝线关闭皮肤（通常使用4至5针即可）。
4. 使用缝合胶固定切口，并用大号镊子夹合切口边缘使其贴合。
5. 逐步减少异氟烷的供给，先将浓度调至1%维持数分钟，随后关闭麻醉气体。
6. 将小鼠置于加热灯下，直至其恢复意识（约5至10分钟）。意识恢复后，在整个恢复期间，小鼠应能正常活动和行走，且无任何痛苦迹象。

5. 回收与分析

1. 提供术后疼痛管理，包括以口服明胶形式给予0.5 mg/kg剂量的丁丙诺啡，每12小时一次，持续48小时。口服给药无需固定动物，可避免对胸部区域造成疼痛。
2. 在恢复期间，将小鼠饲养于笼中，自由获取食物和水。伤口干燥后，雌性动物可同笼饲养，而雄性必须单独饲养，以防止争斗。
3. 恢复期结束后，按照批准的程序实施安乐死。取出肋骨进行固定和分析。

结果

动物通常在此操作后能迅速恢复，切口愈合良好，且动物表现出正常行为。该操作使用市售试剂，经过练习后可在1小时以内完成。在使用此方法生成实验数据之前，重要的是在第0天时间点分析切除情况，以确定切除区域内是否可能残留较大的骨碎片。评估操作是否得当的一种方法是通过术后X射线或显微CT成像检查动物，尽管这通常需要特殊的辐射安全审批。另一种简单的评估方法则是进行骨骼染色制备，如图1A所示。该方法包括收集肋骨骨架，用乙醇（EtOH）固定，并采用标准方案¹¹用茜素红进行染色。可选择省略氢氧化钾（用于消化软组织），以便后续如有需要仍可用于组织学分析。由于覆盖的体壁肌肉层较薄，样本仍可通过80%甘油透明化后直接观察，无需氢氧化钾处理步骤。或者，也可在固定/染色前手动去除这些肌肉，如本图所示（图1A）。

切除的骨组织部分也可进行分析。如果实验目的是在动物体内保留骨膜，则通过光学显微镜和组织学分析可见，骨组织表面应较为光滑（图1B，B’）。若骨组织连同骨膜一并切除，则其表面应明显粗糙...

讨论

初次学习该方案时，确定初始切口的位置可能具有挑战性。然而，通过对已安乐死的小鼠进行练习，外科医生可以掌握初始切口的定位，并暴露需要切除的肋骨。在尸体上操作还有助于提高精细运动技能，以便在保留或不保留骨膜的情况下切除肋骨部分。此外，刚接触该操作的人员可能会发现操作精细器械和细缝线较为困难。在打结过程中，过度牵拉缝线可能导致组织撕裂。因此，在尸体上进行一些缝合练习可能会有所帮助。最后，如果外科医生初次进行啮齿类动物手术，建议在最初几次手术中由另一人协助监测和调整麻醉状态。

本方案最关键的步骤是在不诱发气胸（胸膜腔内异常积气）的情况下切除骨骼，而在小鼠中治疗气胸非常困难，因为其胸膜过薄，无法通过手术闭合。肋骨下方的肌肉层和壁层胸膜非常薄且脆弱，因此需要精确的操作，以防止穿刺到切除区域下方的胸膜。该问题最常发生在步骤 3.1 和 3.3 中。在步骤 3.1（将骨骼与周围肋间肌分离）中，若手术刀或镊子的尖端未保持在浅层，锋利的器械极易刺穿胸膜层。在步骤 3.3（使用精细的显微剪刀切除骨骼）中，将剪刀插入骨骼下方时可能超过胸膜的抗张强度，或者折断骨骼的操作可能导致骨碎片末端穿破胸膜。我们发现，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
中号显微解剖剪刀（Vannas-Tübingen 弹簧剪，5 mm）	Fine Science Tools	15003-08
精细显微解剖剪刀（Vannas 弹簧剪，2 mm 刃口）	Fine Science Tools	15000-04	弯曲尖端更佳
显微手术刀 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	可使用其他精细手术刀替代
Dumont 55 镊子	Fine Science Tools	11295-51
牵开器	Fine Science Tools	17004-05	可调节设计更方便
显微持针器	Fine Science Tools	12060-01
9.0 尼龙缝线（Ethilon），锥形针尖最佳	Ethicon	2819G 或类似型号	锥形针尖最佳，反向切割针尖也可使用
7.0 Prolene 缝线（Prolene）	Ethicon	8700H 或类似型号	也可使用 6-0 规格，针尖类型可不同
大型镊子（Adson 镊子）	Fine Science Tools	11006-12	其他品牌亦可
润滑性眼膏（Akwa Tears）	Akorn	17478-062-35
缝合胶（GLUture 外用组织粘合剂）	Abbot	32046-01	具有优异的操作时间
剃毛器	Wahl	9918-6171 或类似型号
夹灯	Zoo Med	LF-5
红外灯泡，75 W	Zoo Med	RS-75
RC2 小型啮齿类动物麻醉系统	VetEquip	922100
IsoFlo（异氟烷）	Abbot	05260-05
丁丙诺啡（Buprenex）	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
聚维酮碘（Betadine）	Purdue Frederick	67618015017
果味明胶，覆盆子味	Jell-O	B000E1FYL0	配制成较硬质地，类似“颤动果冻”（jigglers）的稠度