小鼠肺部压力-容积曲线的测定

摘要

本文介绍了一种简单且可靠的小鼠肺压力-容积曲线测量方案，表明该方法具有足够的灵敏度，可检测两种常见肺部疾病——肺纤维化和肺气肿中肺实质的表型变化。该指标为量化肺部在疾病进展过程中发生的结构改变提供了有效手段。

摘要

近几十年来，小鼠已成为多种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，最能反映其典型表型变化的指标是肺弹性变化的测量。为了深入理解这些病理过程中特定的分子机制，必须进行能够反映疾病进展的功能性测量。尽管存在多种测量肺弹性的方法，经典方法仍是覆盖全肺容积范围的全肺压力-容积（PV）曲线测定法。该测量方法已应用于几乎所有哺乳动物成年肺组织的研究，历史近百年；此外，此类PV曲线在发现和理解肺表面活性物质在胎儿肺发育中的功能方面也发挥了重要作用。然而，尽管全肺PV曲线可提供有关肺结构改变宏观效应的有用信息，但其在小鼠中的应用却鲜有报道。尽管有时会报告仅测量肺容积变化的部分PV曲线，但由于缺乏绝对容积的测定，而全肺PV曲线本身具有非线性特征，因此这些部分曲线极难解释。在本研究中，我们描述了一种标准化的全肺PV曲线测量方法，并进一步检验该方法在两种常见肺部病理状态——肺气肿和纤维化中检测小鼠肺结构变化的能力。结果显示，多个变量发生了显著改变，且这些变化与预期的病理结构改变一致。因此，对小鼠肺PV曲线的测量为动态监测病理生理变化的进展以及评估治疗干预的潜在效果提供了一种简便而有效的方法。

引言

小鼠现已成为多种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，关键的表型变化最好通过测量肺弹性变化来评估。尽管存在多种测量弹性的方法，经典方法仍是测量从残气量（RV）到肺总量（TLC）的全肺压力-容积（PV）曲线。该测量方法已应用于几乎所有哺乳动物成年肺组织，历史几乎长达100年^1-3。此类PV曲线在发现和理解肺表面活性物质在胎儿肺发育中的功能方面也发挥了重要作用^4-7。尽管PV曲线作为肺表型的重要测量指标，但至今尚无标准化的操作方法。该测量通常通过分步向肺内充气和放气（每步后等待不同时间以达到平衡）或使用可连续充气和放气的泵来完成。PV曲线通常在零至某一用户定义肺容量的范围内进行，但不同实验室报告的每个压力-容积循环的时间跨度差异极大，从数秒⁸到数小时²不等。一些研究者将此全肺PV曲线称为静态或准静态，但这些为定性术语，提供的信息有限，本文中不采用此类表述。此外，尽管PV曲线可提供有关肺结构变化宏观效应的有用信息，但在小鼠中的报道仍不广泛。

多个因素导致了PV曲线获取过程中的变异性，包括：1）充气和放气速率；2）充气和放气过程中的压力变化范围；以及3）确定绝对肺容积测量值的方法。在本方法中，选择3 ml/min的速率作为折中方案，该速率既不会过快而反映与正常通气相关的动态弹性，也不会过慢而导致测量不切实际，尤其是在研究大样本群体时。由于C57BL/6健康小鼠的名义总肺容量约为1.2 m....

方案

约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准了所有动物实验方案。

1. 仪器设备

用于测量 PV 曲线的复合系统装置设置如图 1 所示。

1. 体积测量：
   1. 使用带有切换开关的注射泵，使用户在达到压力极限后可快速反转泵的方向，从而产生恒定速率的充气和放气。对于小鼠压力-容积（PV）曲线实验，使用一个涂有极少量润滑脂的5 ml玻璃注射器，并将初始容积（充气前）设为3 ml空气。3 ml的初始容积足够大，可准确测量几乎所有小鼠PV曲线中的容积变化。
   2. 通过将线性差动变压器连接到泵外壳，并将小型传感器杆连接至移动的注射器活塞，测量泵输送的体积。
      注意：系统中气体压缩的实证校正方法在PV曲线记录部分有所描述。
2. 压力测量：
   1. 使用标准的低成本压力计，量程为 0-60 cm H₂O（0-1 PSI）。
3. 记录测量值：
   1. 使用具备XY记录功能的任意数字记录仪来记录PV曲线（例如， PowerLab）。设置一个通道记录校正后的容积信号，另一个通道记录跨肺压（Ptp），以绘制压力-容积（PV）曲线。使用连接至主PowerLab的桥式前置放大器测量压力。将压....

结果

尽管视频中仅展示了对照组健康小鼠的PV曲线操作过程，但我们评估了PV曲线在两种常见病理模型小鼠中检测功能和病理变化的能力，这两种病理分别为肺气肿和肺纤维化。这些传统模型的详细信息见其他文献^12,13。简而言之，在使用3%异氟烷麻醉后，通过气管内给予3或6 U猪胰弹性蛋白酶以建立肺气肿模型，并在3周后进行检测；通过气管内给予0.05 U博来霉素以建立肺纤维化模型，并在损伤后2周进行检测。

图2 显示了一只对照小鼠典型的肺顺应性（PV）曲线。通过此类PV曲线，可测量一些易于量化、在不同小鼠之间具有可重复性、并能代表肺部疾病中发生的结构变化的变量。这些变量列于表1，并在图2中以图示方式展示。表1列出了这些变量，图2则说明了如何从PV曲线中测量它们。每项变量背后的原理将在后文讨论。

图3 分别展示了代表性对照组、.......

讨论

本文描述了一种简单且可重复的方法，用于在小鼠中测量经典的肺弹性表型分析方法——全肺压力-容积（PV）曲线。此类曲线在肺表面活性物质的发现及其对维持肺稳定性重要性的阐明中起到了关键作用。本文还展示了PV曲线在测量成年小鼠肺组织多种与肺弹性相关变量方面的实用价值。在两种常用的小鼠肺部病理改变模型中，所有测量变量均表现出高度显著的变化。下文将简要讨论各测量变量变化的意义。

肺总量（TLC）是最大肺容积的度量，更准确地说，是指在某一特定最大压力下容积开始趋于平缓时的肺容积，即压力-容积（PV）曲线的充气支开始变平的点。如前所述，PV曲线的充气支实际上永远不会完全变平，而小鼠在这一行为上表现得尤为显著¹⁰。尽管在人类中，TLC被定义为最大自主吸气末的肺容积，但在所有动物模型中，TLC均被定义为某一由使用者任意设定的压力下的容积。在本文所展示的病理模型中，随着肺气肿的加重，TLC呈进行性升高，而在肺纤维化时则出现下降。这些观察结果反映了上述每种疾病状态下的临床表现，因此也是在一种有实用价值的小鼠模型中所预期的结果。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射泵	Harvard Apparatus	55-2226	推注/回吸式注射泵
Pump 22 反向开关	Harvard Apparatus	552217	随泵附带
线性位移变压器	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 ml 玻璃注射器	Becton Dickenson		其他多个供应商亦可
数字记录仪	ADInstruments	PL3504	其他多个供应商亦可
桥式放大器信号调节器	ADInstruments	FE221
气体钢瓶，100% 氧气	Airgas, Inc		任何供应商或医院气源均可使用
压力传感器：0 - 1 psi mV 输出	Omega Engineering	PX-137	量程 ≈ 0 - 60 cm H2O