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方法文章

小鼠肺部压力-容积曲线的测定

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DOI：

10.3791/52376

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2015年1月27日

 ,  ,  , 
1Environmental Health Sciences, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单且可靠的小鼠肺压力-容积曲线测量方案，表明该方法具有足够的灵敏度，可检测两种常见肺部疾病——肺纤维化和肺气肿中肺实质的表型变化。该指标为量化肺部在疾病进展过程中发生的结构改变提供了有效手段。

摘要

近几十年来，小鼠已成为多种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，最能反映其典型表型变化的指标是肺弹性变化的测量。为了深入理解这些病理过程中特定的分子机制，必须进行能够反映疾病进展的功能性测量。尽管存在多种测量肺弹性的方法，经典方法仍是覆盖全肺容积范围的全肺压力-容积（PV）曲线测定法。该测量方法已应用于几乎所有哺乳动物成年肺组织的研究，历史近百年；此外，此类PV曲线在发现和理解肺表面活性物质在胎儿肺发育中的功能方面也发挥了重要作用。然而，尽管全肺PV曲线可提供有关肺结构改变宏观效应的有用信息，但其在小鼠中的应用却鲜有报道。尽管有时会报告仅测量肺容积变化的部分PV曲线，但由于缺乏绝对容积的测定，而全肺PV曲线本身具有非线性特征，因此这些部分曲线极难解释。在本研究中，我们描述了一种标准化的全肺PV曲线测量方法，并进一步检验该方法在两种常见肺部病理状态——肺气肿和纤维化中检测小鼠肺结构变化的能力。结果显示，多个变量发生了显著改变，且这些变化与预期的病理结构改变一致。因此，对小鼠肺PV曲线的测量为动态监测病理生理变化的进展以及评估治疗干预的潜在效果提供了一种简便而有效的方法。

引言

小鼠现已成为多种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，关键的表型变化最好通过测量肺弹性变化来评估。尽管存在多种测量弹性的方法，经典方法仍是测量从残气量（RV）到肺总量（TLC）的全肺压力-容积（PV）曲线。该测量方法已应用于几乎所有哺乳动物成年肺组织，历史几乎长达100年1-3。此类PV曲线在发现和理解肺表面活性物质在胎儿肺发育中的功能方面也发挥了重要作用4-7。尽管PV曲线作为肺表型的重要测量指标，但至今尚无标准化的操作方法。该测量通常通过分步向肺内充气和放气（每步后等待不同时间以达到平衡）或使用可连续充气和放气的泵来完成。PV曲线通常在零至某一用户定义肺容量的范围内进行，但不同实验室报告的每个压力-容积循环的时间跨度差异极大，从数秒8到数小时2不等。一些研究者将此全肺PV曲线称为静态或准静态，但这些为定性术语，提供的信息有限，本文中不采用此类表述。此外，尽管PV曲线可提供有关肺结构变化宏观效应的有用信息，但在小鼠中的报道仍不广泛。

多个因素导致了PV曲线获取过程中的变异性，包括：1）充气和放气速率；2）充气和放气过程中的压力变化范围；以及3）确定绝对肺容积测量值的方法。在本方法中，选择3 ml/min的速率作为折中方案，该速率既不会过快而反映与正常通气相关的动态弹性，也不会过慢而导致测量不切实际，尤其是在研究大样本群体时。由于C57BL/6健康小鼠的名义总肺容量约为1.2 ml9，该速率通常可在约1.5分钟内完成两次完整的闭合PV环。

在已发表的文献中，报道肺容积-压力（PV）曲线时所采用的峰值充气压力差异极大，范围从低至20 cm H₂O到超过40 cm H₂O不等。2O. 这种变异性部分可能与物种有关，但设定PV曲线压力上限的主要目的是将肺充气至总肺容量（TLC），即最大肺容积。人类的TLC由个体所能达到的最大自主努力决定，但遗憾的是，这在任何动物模型中都无法复制。因此，实验PV曲线中的最大容积由研究者任意设定的最大压力决定。目标是设定一个使PV曲线趋于平坦的压力值，但遗憾的是，哺乳动物肺PV曲线的充气支永远不会完全平坦。因此，大多数研究者会设定一个充气曲线开始显著变平的压力值，通常为30 cm H₂O。2在小鼠中，压力-容积（PV）曲线则更为复杂，其充气支上存在双峰，且该充气支在30 cm H₂O时通常仍处于急剧上升阶段。2O10，因此30并非PV曲线的理想终点。基于此，我们采用35 cm H2O 作为小鼠 PV 曲线的压力上限，即我们检测过的所有品系在充气支开始变平的压力值。

由于压力-容积（PV）曲线本身具有很强的非线性，PV环的形态将取决于曲线起始时的容积。一些商用呼吸机允许用户进行从功能残气量（FRC）开始的大范围PV环测定，但如果FRC容积未知，则无法对PV曲线在不同病理状态下的变化进行解释，因为这些变化可能仅仅是由于起始容积的改变所致，而非肺部结构本身的改变。因此，在缺乏绝对容积测量的情况下，PV曲线几乎无法解读，临床应用价值有限。尽管目前有多种测量肺容积的方法，但这些 方法通常繁琐且需要特殊设备。本文所述的简化方法中，PV曲线是在体内去气（in vivo degassing）处理后从零容积开始测定的。

综上所述，本文展示了一种在小鼠肺脏中标准化肺部压力-容积（PV）曲线测量的简便方法，并定义了若干可从该曲线计算得出且与肺结构相关的参数指标。因此，PV曲线提供了一种肺功能检测方法，可直接用于检测患有常见肺部疾病（如肺气肿和纤维化）的小鼠所出现的表型结构改变。

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方案

约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准了所有动物实验方案。

1. 仪器设备

用于测量 PV 曲线的复合系统装置设置如图 1 所示。

  1. 体积测量：
    1. 使用带有切换开关的注射泵，使用户在达到压力极限后可快速反转泵的方向，从而产生恒定速率的充气和放气。对于小鼠压力-容积（PV）曲线实验，使用一个涂有极少量润滑脂的5 ml玻璃注射器，并将初始容积（充气前）设为3 ml空气。3 ml的初始容积足够大，可准确测量几乎所有小鼠PV曲线中的容积变化。
    2. 通过将线性差动变压器连接到泵外壳，并将小型传感器杆连接至移动的注射器活塞，测量泵输送的体积。
      注意：系统中气体压缩的实证校正方法在PV曲线记录部分有所描述。
  2. 压力测量：
    1. 使用标准的低成本压力计，量程为 0-60 cm H2O（0-1 PSI）。
  3. 记录测量值：
    1. 使用具备XY记录功能的任意数字记录仪来记录PV曲线（例如， PowerLab）。设置一个通道记录校正后的容积信号，另一个通道记录跨肺压（Ptp），以绘制压力-容积（PV）曲线。使用连接至主PowerLab的桥式前置放大器测量压力。将压力通道校准范围设为0-40 cm H₂O。2O，并将体积通道校准为0-3 ml。

2. 气体压缩校正

注意：这是实验设置中的一个关键初始步骤，因为随着压力的增加，气体体积会减小，因此输送给小鼠的空气体积将逐渐小于注射器筒的位移体积。

  1. 关闭连接PV系统与肺部的旋塞，以防止气体逸出系统。开始灌注，并观察记录仪上校正后的体积通道是否显示出可测量的变化，随着压力升高至约40 cm H₂O。2O. 如果是，则按以下步骤进行校正。
    1. 通过从活塞位移测量值中减去气体压缩的实测校正值来校正气体压缩效应即， 未校正容积）与膨胀压成正比的一项。在Powerlab通道（称为Vc）上进行此操作，以显示容积信号减去一个系数乘以压力的值。
    2. 确定方程中的系数。首先进行初始估计，开启图表记录，然后启动泵。由于充气管路处于封闭状态，调节压力系数乘数，使当压力从 0-40 cm H₂O 上升时，Vc 通道读数为零。2O. 如果曲线上升或下降，只需调整校正因子，直至在此压力范围内保持平稳。只要注射器中的起始体积保持为 3 ml 不变，该校正因子将始终相同。

3. 小鼠实验测试

  1. 小鼠 PV 曲线测定步骤。所有动物实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。
    1. 使用氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）对小鼠（6–12 周龄 C57BL/6 小鼠）进行麻醉，并通过反射运动消失确认麻醉状态。
      注意：PV 曲线测定可在麻醉小鼠中于 10 分钟内完成，且为终末性操作。 
    2. 使用 18 G 钝头针套管对小鼠进行气管切开。操作方法为：在气管上方皮肤做一小切口，暴露气管，然后在气管上切开一小裂口，插入钝头针，再用缝线固定套管。
    3. 让小鼠吸入 100% 氧气至少 4 分钟。可通过呼吸球囊自主呼吸或使用呼吸机，呼吸机通常设定潮气量为 0.2 ml，呼吸频率为 150 次/分钟。
    4. 关闭气管套管，静置 3–4 分钟，使小鼠完全吸收肺内氧气。此吸氧过程将导致动物死亡，并实现肺组织几乎完全脱气11。通过心电图电极或直接观察心跳停止来确认小鼠死亡。
    5. 当肺脱气完成且肺容积为零时，开始以 3 ml/min 的速率通过注射泵向肺内注入室温空气 。在数字记录仪上监测压力变化，当压力达到 35 cm H2O 时，反转泵的方向。
    6. 沿呼气支曲线继续监测，直至压力降至 -10 cm H2O。此时气道已塌陷，肺泡内空气被滞留，阻止进一步容积减小。立即再次反转泵的方向，使塌陷的气道重新开放，肺组织重新充气。这种非均一性开放通常在第二次充气初期表现为波动明显的充气支曲线。
    7. 当压力再次达到 35 cm H2O 时，反转泵的方向，继续放气直至第二次呼气支曲线降至 0 cm H2O，随后停止泵运行。
    8. 查看 PowerLab 记录仪上的压力与流量图表及 PV 曲线，并分析 PV 曲线以检测不同肺部病理状态下肺实质发生的表型改变。

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结果

尽管视频中仅展示了对照组健康小鼠的PV曲线操作过程，但我们评估了PV曲线在两种常见病理模型小鼠中检测功能和病理变化的能力，这两种病理分别为肺气肿和肺纤维化。这些传统模型的详细信息见其他文献12,13。简而言之，在使用3%异氟烷麻醉后，通过气管内给予3或6 U猪胰弹性蛋白酶以建立肺气肿模型，并在3周后进行检测；通过气管内给予0.05 U博来霉素以建立肺纤维化模型，并在损伤后2周进行检测。

图2 显示了一只对照小鼠典型的肺顺应性（PV）曲线。通过此类PV曲线，可测量一些易于量化、在不同小鼠之间具有可重复性、并能代表肺部疾病中发生的结构变化的变量。这些变量列于表1，并在图2中以图示方式展示。表1列出了这些变量，图2则说明了如何从PV曲线中测量它们。每项变量背后的原理将在后文讨论。

图3 分别展示了代表性对照组、...

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讨论

本文描述了一种简单且可重复的方法，用于在小鼠中测量经典的肺弹性表型分析方法——全肺压力-容积（PV）曲线。此类曲线在肺表面活性物质的发现及其对维持肺稳定性重要性的阐明中起到了关键作用。本文还展示了PV曲线在测量成年小鼠肺组织多种与肺弹性相关变量方面的实用价值。在两种常用的小鼠肺部病理改变模型中，所有测量变量均表现出高度显著的变化。下文将简要讨论各测量变量变化的意义。

肺总量（TLC）是最大肺容积的度量，更准确地说，是指在某一特定最大压力下容积开始趋于平缓时的肺容积，即压力-容积（PV）曲线的充气支开始变平的点。如前所述，PV曲线的充气支实际上永远不会完全变平，而小鼠在这一行为上表现得尤为显著10。尽管在人类中，TLC被定义为最大自主吸气末的肺容积，但在所有动物模型中，TLC均被定义为某一由使用者任意设定的压力下的容积。在本文所展示的病理模型中，随着肺气肿的加重，TLC呈进行性升高，而在肺纤维化时则出现下降。这些观察结果反映了上述每种疾病状态下的临床表现，因此也是在一种有实用价值的小鼠模型中所预期的结果。

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披露

所有作者均无任何与本文所述内容存在利益冲突的财务关系。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）HL-1034项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
注射泵Harvard Apparatus55-2226推注/回吸式注射泵
Pump 22 反向开关Harvard Apparatus552217随泵附带
线性位移变压器Trans-Tek, Inc.0244-0000
5 ml 玻璃注射器Becton Dickenson其他多个供应商亦可
数字记录仪ADInstrumentsPL3504其他多个供应商亦可
桥式放大器信号调节器ADInstrumentsFE221
气体钢瓶，100% 氧气Airgas, Inc任何供应商或医院气源均可使用
压力传感器：0 - 1 psi mV 输出Omega EngineeringPX-137量程 ≈ 0 - 60 cm H2O

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