传播疟疾的蚊子具有一些重要的流行病学特征，这些特征只能通过分子技术进行检测。我们利用基于 MALDI-TOF 的 SNP 基因分型平台，开发了一种可同时检测疟疾媒介多种关键性状（种类、杀虫剂抗性、寄生虫感染和宿主选择）的检测方法。
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摘要
摘要
的 Anopheles gambiae 复合种包含非洲主要的疟疾传播蚊虫。由于这些蚊种具有重要的医学意义，通常需通过分子检测方法对多个性状进行表征，以辅助流行病学研究。这些性状包括物种鉴定、杀虫剂抗性、寄生虫感染状态以及宿主偏好。由于该复合种的种群 Anopheles gambiae 复合体在形态上难以区分，传统上使用聚合酶链式反应（PCR）来鉴定物种。一旦确定物种，通常会进行多项后续检测以进一步阐明其特征。例如，para基因中被称为KDR的突变可导致对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性。此外，酶联免疫吸附试验（ELISAs）或 疟原虫 寄生虫DNA检测PCR实验用于检测蚊虫组织中存在的寄生虫。最后，结合PCR与限制性内切酶消化的方法可用于阐明寄生虫的宿主偏好性例如，通过筛选蚊子血餐中宿主特异性的DNA来区分人血与动物血。我们开发了一种多重检测分析法（MDA），将上述所有检测方法整合到一个单一的多重反应中，可同时对96或384个样本进行33个SNP位点的基因分型。由于该MDA包含了多个物种特异性标记， 疟原虫 检测和宿主血液识别，与以往仅使用单一标记物检测每种性状的方法相比，本方法极大降低了假阳性或假阴性结果的产生概率。该检测方法稳定且操作简便，能够以更低的成本和远少于现有方法的时间，高效检测这些关键的蚊虫性状。
引言
Anopheles arabiensis，Anopheles coluzzii 和 Anopheles gambiae 是非洲疟疾传播的主要媒介1这三种物种在形态上无法区分2 只能通过分子检测方法加以区分3-9此外，还有许多常规的下游检测方法可用于辅助流行病学和群体遗传学研究。这些方法包括：（1）用于物种形成岛的基因分型检测10-12，（2）一种基因分型检测方法，可识别1014位点的非同义SNPth 氨基酸密码子位置 para 基因（the 击倒抗性，或 kdr, SNP13-18，（3）寄生虫检测 PCR19-23，以及（4）对蚊虫中肠内宿主特异性DNA进行筛查24,25.
我们开发了一种多检测分析法（MDA），将所有这些检测方法整合到一个单一的多重反应中，旨在分析非洲疟疾媒介中具有流行病学重要意义的特征。MDA 分析包含多个用于检测（1）物种的标记冈比亚按蚊、埃及伊蚊、科卢齐按蚊 或其他（三种均无），（2）杀虫剂抗性表现于 kdr SNPs（包括L1014F）和 L1014S）， (3) 两种主要疟原虫的存在, 恶性疟原虫
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方案
1. PCR 扩增
- 将所有PCR引物（参见补充表S1）混合于一个1.5 ml微量离心管中。每个SNP包含两条引物（正向和反向）。确保每条PCR引物的储备浓度为100 μM。配制足够用于500–1,000次反应的引物混合液，以减少移液误差和实验台操作时间（参见补充表S2）。如需要，可将混合液分装为每管100–200次反应的量，并于-20°C保存。
- 按照试剂生产商提供的说明书配制PCR预混液（见表1）。配制96次反应的总体积需额外增加20%的余量。轻轻涡旋混匀含有PCR预混液的离心管，并在2,000 × g条件下离心30秒 。
- 使用排液器将3 μl PCR预混液加入非裙边96孔板的每一孔中。使用多通道移液器可显著节省此步骤的时间。
- 向每孔中加入2 μl相应的蚊虫基因组DNA。
注：从蚊虫组织（头部/胸部、腹部或整体）提取基因组DNA的方法详见其他文献29–32。应选择合适的DNA提取方案，以区分血液中含Plasmodium（腹部）的个体与具有感染性的蚊虫（Plasmodium位于头部/胸部）。我们通常使用从蚊虫身体部位（头部/胸部或腹部）提取的DNA，因此DNA浓度范围为0.05–2 ng/μl。尽管总DNA投入量低于生产商推荐值（5–10 ng/反应），但在未进行全基因组扩增的情况下，我们通常仍能从98%的DNA样本中获得可靠的SNP分型结果。
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结果
物种鉴定：
以下5个SNP共同用于鉴定三种物种（A. arabiensis、A. coluzzii 和 A. gambiae）（表4）。如果样本不属于这三种物种之一，则三个SNP位点（01073-213、04679-157 和 10313-052）无法扩增。
通过 kdr 基因型推断杀虫剂抗性：
1014th 密码子的 用于 电压门控钠通道对应于 kdr. 染色体2上的两个SNPnd 和 3rd 1014 的底部th 密码子决定三种可能的氨基酸。各种基因型的可能组合列于 表5该SNP适用于三种非洲疟疾传播媒介物种： A. arabiensis, A. coluzzii 和
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讨论
多重等位基因特异性扩增（MDA）包含五个主要步骤：PCR扩增、虾碱性磷酸酶（SAP）反应、SNP延伸、延伸产物纯化以及基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱分析33-37。第一步PCR扩增用于扩增每个SNP位点侧翼的DNA序列，以确保在SNP延伸步骤中有足够的模板DNA。SAP反应可中和未使用的dNTPs，防止其干扰后续的SNP延伸步骤。SNP延伸步骤针对每个SNP位点使用一条特异性延伸引物以及质量修饰的终止核苷酸。3’端修饰的核苷酸可阻止后续核苷酸继续掺入延伸引物中，因此通过测定单个碱基的质量即可确定相应SNP的基因型。
确保本方法成功最关键的一步是拥有目标生物体中已知多态性的一个优质数据集。我们采用了特征明确的单核苷酸多态性（SNP）用于物种鉴定（N>900）10,12,38-40 和 kdr 基因（N>1,000）15,18。恶性疟原虫（Plasmodium）的物种特异性SNP是通过比对来自非洲的123个P. falciparum
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
我们感谢加州大学戴维斯分校的 Anthony Cornel 博士和 Laura Norris 博士以及格拉斯哥大学的 Katharina Kreppel 博士提供来自坦桑尼亚的蚊类标本。我们感谢女士 我们感谢约翰斯·霍普金斯大学公共卫生学院的 Smita Das 和 Douglas Norris 博士分享来自赞比亚的蚊子样本。我们还感谢兽医遗传学实验室的 Lee V. Millon 先生在检测设计方面的培训。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01AI 078183 和 R21AI062929 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | 用于基因组学应用中分析核酸的 MALDI-TOF 质谱仪 |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | 将完成的 iPLEX 反应产物转移至 SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | 用于 iPLEX 检测的试剂，包括 SAP 试剂盒 |
参考文献
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
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