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方法文章

一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案

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DOI：

10.3791/52392

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2014年12月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了对新鲜人体组织碎片进行快速非酶解离的方法，用于定性和定量评估存在于多种正常及恶性人体组织中的CD45+细胞（淋巴细胞/白细胞）。此外，可收集并保存来源于原代组织匀浆的上清液，用于后续分析或实验。

摘要

恶性细胞逃避免疫系统的能力，即肿瘤逃逸先天性和适应性免疫应答的现象，现已被公认为癌症的重要特征之一。我们对乳腺癌的研究聚焦于肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤进展和患者预后中的主动作用。为实现这一目标，我们建立了一种快速分离正常与异常组织中完整淋巴样细胞的方法，以评估其接近天然状态下的特性。使用机械解离器制备的组织匀浆相比酶消化组织，细胞活力和回收率均更高，同时保留了表面受体的表达。此外，对剩余不溶性物质进行酶消化并未回收到额外的CD45+细胞。+ 细胞，表明在原代匀浆液中进行的定性和定量检测很可能真实反映了组织碎片中浸润的亚群。这些匀浆液中的淋巴细胞可通过免疫学方法（表型、增殖）轻松表征。 等等。）或分子（DNA、RNA 和/或蛋白质）方法。CD45+ 细胞也可用于亚群纯化， 体外 扩增或冷冻保存。该方法的另一优势在于，组织匀浆后的上清液可用于表征和比较正常及恶性组织中存在的细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白和抗原。本方案在人乳腺组织中效果极佳，且应适用于多种正常与异常组织。

引言

肿瘤微环境由多种细胞类型组成，大量研究表明，这些细胞在肿瘤发生过程中各自发挥着独特而重要的作用1,2。其中包括但不限于浸润性免疫细胞、间质细胞、内皮细胞和肿瘤细胞3。由于浸润性淋巴细胞（TIL；CD45+ 细胞或白细胞，在乳腺肿瘤中主要为淋巴细胞）在新鲜人体组织样本中的频率较低、可用于研究的样本量通常较小，以及提取过程中细胞活力可能丧失，使得对这些细胞进行离体（ex vivo）研究较为困难。由于浸润肿瘤的免疫细胞通常以“过客”形式存在，而非组织中的常驻细胞，因此它们通常更容易从组织基质中释放出来。

在维持细胞完整性的前提下解离肿瘤组织在技术上具有挑战性，传统方法通常结合机械处理与酶解步骤来制备单细胞悬液4-8。该方法需要长时间孵育，常导致细胞活力显著下降，并因酶切作用造成细胞表面受体丢失。使用经酶消化的肿瘤组织更难实现高质量的流式细胞术分析，以表征肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），也难以通过流式细胞术或抗体包被的磁珠对CD45+亚群进行高效纯化。此外，由于酶解过程中可能存在蛋白质降解，所得肿瘤匀浆的上清液（SN）无法用于进一步分析，例如分泌蛋白（细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白或肿瘤抗原）的定量检测，或对正常细胞进行实验性处理。

在寻找一种无需酶消化即可制备乳腺组织（包括肿瘤组织、非邻近非肿瘤组织（NANT）以及来自乳房缩小术的正常乳腺组织）单细胞匀浆的方法过程中，我们测试了多种机械匀浆技术。使用机械解离仪制备的匀浆显示出更高的细胞活力（提高2倍）和总细胞回收率（提高2倍），同时保留了表面受体的表达。对剩余不溶性物质进行酶消化并未回收到更多的CD45+细胞，表明这些细胞已在初始匀浆过程中全部释放。因此，这种快速而简单的方法可实现对存在于各种正常及恶性人类组织中的CD45+亚群进行定性和定量评估。该方法的另一优势在于，初始匀浆所得的上清液（原始组织上清液）可被收集并保存，用于后续分析或实验。

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方案

注意：所有标本均根据布鲁塞尔朱勒·博尔代研究所医学伦理委员会批准的方案获取，并已获得每位患者的书面知情同意。

1. 组织匀浆的制备

  1. 解剖来自手术室的切除组织（恶性组织及正常组织）由经过培训的人员在病理实验室进行即时取材。肿瘤组织、癌旁非肿瘤组织（NANT，尽可能取距肿瘤最远的区域）以及正常组织碎片通常在手术切除后1至3小时内，在BSL2级实验室中按照人源组织的标准生物安全操作规程进行处理。本方案的流程图如下所示： 图1.
  2. 称重所有组织碎片（正常组织、NANT 和肿瘤组织），并测量其长度、宽度和高度（长度 × 宽度 × 高度）。此步骤对于后续细胞亚群及提取 RNA 的标准化至关重要。 等等。
    注意：样本尺寸范围为100至10,000 mm3 尽可能不含脂肪。
  3. 将肿瘤碎片印在玻璃载玻片上进行 H&E 染色以确认该组织确实属于肿瘤部分。
    1. 通过将一块玻璃载玻片压在肿瘤碎片上，并用手指轻轻按压数秒钟来完成此操作。
    2. 用异丙醇固定载玻片 2 分钟，随后用水洗涤。用 Mayer 苏木精对组织复染 30 秒。
    3. 将载玻片在六缸水中清洗。用2% 氯化双苯噁嗪（Phloxine B）染色15秒。
    4. 用一浴水洗涤，随后用四浴异丙醇洗涤，最后再用一浴水洗涤。
    5. 在异丙醇中孵育1分钟，然后沥干。在两缸二甲苯中透明。
    6. 用二甲苯基封片剂封片。观察肿瘤细胞密度（图2).
      注意：肿瘤细胞主要黏附于印迹载玻片上，间质细胞、淋巴样细胞或脂肪细胞很少残留，从而在肿瘤细胞之间留下空隙（图2).
  4. 将组织碎片置于含有1 ml化学成分明确的无血清造血细胞培养基（以下简称培养基）的小型培养皿中，在室温下将其切成小块（约1–2 mm）2使用无菌手术刀。
  5. 将所有物质（组织碎片 + 培养基）转移至机械解离器C管中。
  6. 用巴斯德移液管将2 ml培养基冲洗培养皿和手术刀，然后加入C管中（解离用培养基总体积 = 3 ml）。
  7. 使用机械解离仪程序 A.01（针对 C 管的最温和程序）将组织碎片匀浆成单细胞悬液。将 C 管放入仪器中，连续运行程序两次（一个循环 = 25 秒）。
    注意：该匀浆程序已针对人乳腺组织建立并验证，其他肿瘤或组织类型可能需要使用不同的程序，应先进行测试。
  8. 从装置上取下 C 管，将匀浆液直接倾入置于 50 ml 管上的 40 μm 细胞滤器中。使用与之前相同的巴斯德吸管继续操作 步骤 1.6将C管中残留的任何液体转移至细胞滤筛中。
  9. 使用1 ml移液枪头将过滤后的液体转移至15 ml离心管中。暂时保留细胞滤器及其配套的50 ml离心管。
  10. 用同一支巴斯德吸管，另取 3 ml 培养基冲洗 C 管，并将冲洗液转移至 步骤 1.6，将细胞滤器仍置于50 ml离心管上。用一支洁净的巴斯德吸管或1 ml吸头轻轻搅动滤器中的未均质组织，尽可能挤出残留液体至50 ml离心管中，随后丢弃该吸管或吸头，以避免污染流出液。
  11. 将细胞滤网倒置在原始的C管上，用3 ml培养基冲洗，使未均质化的组织重新落入C管中。
  12. 重新匀浆，步骤同前 步骤1.7 A.01 程序循环两次。
  13. 将第二次制备的匀浆液通过置于50 ml离心管上的细胞筛过滤，再用3 ml培养基冲洗C管（同前） 步骤 1.10）并用巴斯德吸管将液体转移至置于50 ml离心管上的细胞筛中，再次挤压细胞筛中残留的结缔组织，尽可能挤出最大量的液体。
  14. 此时，15 ml 管中体积约为 2.5 ml，50 ml 管中体积约为 9 ml。

2. 组织上清液与细胞的分离

  1. 将15 ml和50 ml离心管中的匀浆在室温下以600 × g离心15分钟。
  2. 将15 ml管中的上清液（SN）倒入洁净的离心管中，并暂时在4 °C下保存。此上清液（最终体积为2.5 ml）为原发性肿瘤、NANT或正常组织的上清液，后续需进一步澄清并分装，然后在-80 °C下储存以备将来分析（见下文）。
  3. 弃去50 ml管中的上清液。
  4. 用最终体积为1 ml的培养基轻柔重悬两个细胞沉淀。简而言之，首先通过轻敲离心管（在硬质表面上）轻柔地打散两个管中的细胞沉淀。用500 µl培养基重悬50 ml管中的细胞沉淀，并将此细胞悬液转移至15 ml管中以重悬第二个沉淀。再用另500 µl培养基重复此步骤一次，以最大程度回收细胞。
  5. 取10 µl细胞悬液转移至小离心管中，加入10 µl台盼蓝（1:1稀释），用血细胞计数板计数活细胞数量。
    注意：在此阶段，也可取部分细胞悬液进行流式细胞术分析，以评估细胞大小、颗粒度，以及根据需要检测少量亚群标记物，从而在进行深入分析或实验前更精确地评估匀浆中细胞的相对分布情况。所有流式细胞术分析均包含CD45标记，用于亚群归一化。
  6. 在室温下以300 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。来自肿瘤、NANT或正常组织的细胞现可进行进一步纯化或分析。这些额外步骤最好在手术当天完成。
    注意：对于流式细胞术分析（但不包括细胞分选），在抗体标记后应裂解残留的红细胞，方法是向细胞沉淀中加入0.4 ml红细胞裂解缓冲液，立即涡旋震荡1秒，并在室温下避光孵育至少10分钟，然后进行分析。

3. 组织上清液的澄清

  1. 将含有组织上清液（SN）的1.5 ml离心管在4 °C条件下以15,000 × g离心15分钟。
  2. 小心移除上清液，避免接触或扰动沉淀。根据所需分装的数量和体积，转移至干净的离心管（或多个离心管）中。
  3. 将上清液于-80 °C保存，以备后续使用。

4. 患者血液

  1. 在手术前一天，通过静脉穿刺采集每位患者的血液样本作为对照，收集至含肝素的试管中。在20 °C下以400 × g离心10分钟（关闭刹车），以获得血浆和白细胞层（buffy coat）。
  2. 移除血浆后，在20 °C下以10,000 × g离心15分钟以澄清血浆。分装后于-80 °C保存，以备后续使用。用培养基稀释白细胞层（buffy coat）。
  3. 采用标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，随后立即进行分析、亚群分离、DNA/RNA/蛋白质提取或冷冻保存。

5. 流式细胞术

  1. 根据制造商说明书，在 4 °C 避光条件下对细胞进行标记。在抗体标记后，向组织碎片细胞悬液的细胞沉淀中加入 0.4 ml 细胞裂解缓冲液，以裂解红细胞。
  2. 立即涡旋震荡 1 秒，并在室温下避光孵育至少 10 分钟。将标记后的细胞直接上机流式细胞仪进行数据采集，无需洗涤。

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结果

使用市售的组织解离溶液或含有胶原酶、DNase 和/或透明质酸酶抑制剂的各种实验室混合物对组织碎片进行酶消化时，会切割细胞表面多种受体。我们最初的研究集中于浸润乳腺肿瘤的 CD4+ T 细胞，但很快遇到了一个重大的技术问题：采用标准的酶消化方案会导致细胞表面 CD4 受体被切割4-8。我们测试了多种含有或不含 DNase 和透明质酸酶抑制剂的胶原酶，发现胶原酶 I 和 II 会完全去除细胞表面的 CD4，尽管此时淋巴细胞的存活率很高（图 3A）。在较短的孵育时间（1–2 小时）下使用胶原酶 IV 时，对 CD4 的影响较为温和，与同一位患者未消化的血液和骨髓相比，消化后的淋巴结和肿瘤组织中检测到的 CD4 抗体标记水平较低（图 3B；需注意，由于我们所获得组织样本的限制，无法直接比较同一组织来源的消化与未消化的淋巴结和肿瘤组织）。通过比较来自健康供体血液中未经消化和经消化处理的 CD4+ T 细胞，证实 CD4 的丢失是胶原酶 IV 消化过程的技术副产物（数据未显示）。尽管可通过磁珠从经胶原酶 IV 消化...

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讨论

本研究描述了一种优化方法，可快速制备正常及恶性乳腺组织匀浆，无需酶消化步骤，适用于后续的细胞分选、提取、冷冻保存和/或CD45的表型分析+ 亚群。该实验方法的目标是获得能够真实反映肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的图像 体内 状态，并与来自手术室且经过最少处理的正常组织进行比较。迄今为止，本实验室已采用该方案分析 >250 例新鲜乳腺癌组织（肿瘤组织和癌旁正常组织）， >35 例来自乳房缩小术的正常乳腺组织。原则上，本方案应可直接适用于其他肿瘤或组织类型；然而，可能需要进行一些优化（即， 机械解离程序、循环次数、培养基体积 等等。）。对于淋巴细胞浸润较少的组织，可能需要使用较大的组织片段，这正是我们在淋巴细胞数量较低的正常组织中所采用的方法。或者，可增加密度梯度离心步骤以富集白细胞悬液。本项针对乳腺肿瘤中浸润的T细胞和B细胞亚群的分析包括对 >通过流式细胞术检测100种标志物（Gu-Trantien补充数据中提供了74种标志物的流式细胞术数据） 等.9以及特定淋巴细胞亚群的纯化，用于后续的免疫学和分子分...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了比利时科学研究中心（FNRS）基金、Bordet研究所之友基金会、FNRS- Télévie行动基金、比利时癌症计划、Lambeau-Marteaux基金、J.C. Heuson基金以及Barsy基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GentleMacs 组织解离器Miltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine 在某种程度上是等效的
Centrifuge 5810 REppendorf或其他标准台式离心机
Centrifuge 5417 REppendorf或其他标准微量离心机
Esco 二类 A2 型生物安全柜ESCO 全球或其他标准的BSL2生物安全柜
倒置显微镜Nikon eclipse TS100或适用于血细胞计数板的其他显微镜
Bürker 室Marienfield 640210或其他标准血细胞计数板
Navios 流式细胞仪贝克曼库尔特或其它流式细胞仪（推荐 8-10 色）
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine 使用 Filcon
细胞培养皿Sarstedt72,710或其他非致热原性塑料器皿
一次性手术刀Swann-Morton0510或标准一次性无菌手术刀
BD 细胞滤网 40 µmBecton Dickinson734-0002或其他非致热原性塑料器皿
BD Falcon 50 ml 离心管Becton Dickinson352070或其他非致热性塑料器皿
BD Falcon 15 ml 离心管Becton Dickinson352097或其他非热原性塑料器皿
BD FACS 管 5 mlBecton Dickinson352008或其他非致热性塑料器皿
无菌巴斯德吸管 5 mlVWR612-1685或其他无热原塑料制品
1.5 ml 微型离心管Eppendorf7805-00或其他无热原塑料制品
X-Vivo 20LonzaBE04-448Q推荐的无血清培养基
磷酸盐缓冲液LonzaBE17-516F标准生理磷酸盐缓冲液（PBS）
台盼蓝VWR17942E或其他活体染料
VersaLyse贝克曼库尔特A09777用于流式细胞术实验
可固定的活率染料 eFluor 780eBioscience65-0865-14用于流式细胞术实验
抗CD3 FITCBD 生物科学345763用于流式细胞术实验
抗CD3 Vio蓝Miltenyi Biotec130-094-363用于流式细胞术实验
抗CD4 PEBD生物科学345769用于流式细胞术实验
抗CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232用于流式细胞术实验
抗CD8 ECD贝克曼库尔特737659用于流式细胞术实验
抗-CD8 PerCPBD 生物科学345774用于流式细胞术实验
抗CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643用于流式细胞术实验
抗CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906用于流式细胞术实验

参考文献

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