一种简单快速议定书非酶离解新鲜人组织的浸润淋巴细胞的分析

摘要

该方案描述了新鲜人体组织片段的快速非酶解离，用于定性和定量评估存在于各种正常和恶性人体组织中的 CD45 ⁺ 细胞（淋巴细胞/白细胞）。此外，可以收集和储存从原代组织匀浆中获得的上清液，以用于进一步分析或实验。

摘要

恶性细胞逃避免疫系统，从先天性和适应性免疫应答特征为肿瘤逃逸的能力现在被接受为癌症的重要标志。我们对乳癌的研究主要集中在积极的作用，肿瘤浸润淋巴细胞肿瘤进展和患者预后发挥。为了实现这一目标，我们制定了正常和异常组织完整淋巴样细胞的快速分离的方法，努力以评估他们接近他们的原生状态。匀浆用机械离解秀既增加了活力和细胞的恢复，同时保持表面受体的表达相比，酶消化的组织准备。另外，剩余的不溶物的酶消化未恢复额外的CD45 ⁺细胞表示在初级匀浆的定量和定性测量可能真正反映在组织fragm浸润亚耳鼻喉科。在淋巴样细胞中这些匀浆可以容易地使用免疫（表型，细胞增殖等 ）或分子（DNA，RNA和/或蛋白质），其特征接近。 CD45 ⁺细胞也可以用于亚群纯化， 体外扩增或冷冻保存。这种方法的一个额外的好处是，从匀浆主组织上清液可用于表征和比较细胞因子，趋化因子，免疫球蛋白和抗原存在于正常和恶性组织。这个协议功能非常好为人类乳房组织和应适用于各种各样的正常和异常组织。

引言

肿瘤微环境由各种细胞类型组成，大量研究表明，它们在肿瘤发生中发挥着不同且重要的作用^1,2。这些包括但不限于浸润免疫细胞、基质细胞、内皮细胞和肿瘤细胞³。肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL;新鲜人体组织样本中的 CD45⁺ 细胞或白细胞（主要是乳腺肿瘤中的淋巴细胞）因其频率低、通常可用于研究的小样本量以及提取过程中可能失去活力而变得困难。因为浸润肿瘤的免疫细胞通常以乘客而不是永久居民的形式存在，所以它们更容易从组织基质中释放出来。

在保持细胞完整性的同时解离肿瘤组织在技术上具有挑战性，传统上是使用机械和酶促步骤的组合来制备单细胞悬液^4-8。这种方法涉及较长的潜伏期，并且与细胞活力的显着降低以及酶切割导致细胞表面受体的损失有关。从酶消化的肿瘤组织中更难实现表征肿瘤微环境中 TIL 的高质量流式细胞术研究，以及通过流式细胞术或抗体包被的珠子对 CD45 ⁺ 亚群进行清洁纯化。此外，由于酶消化物中蛋白质降解的可能性，来自所得肿瘤匀浆的上清液 （SN） 不适合进一步分析，包括分泌蛋白（细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白或肿瘤抗原）的定量或正常细胞的实验处理。

在我们寻找一种无需酶消化即可从乳腺组织 [包括肿瘤、非相邻非肿瘤 （NANT） 和正常（来自乳腺缩小）乳腺组织] 制备单细胞匀浆的方法时，我们测试了各种机械匀浆技术。使用机械解离剂制备的匀浆提高了细胞活力（2 倍）和总细胞回收率（2 倍），同时保持了表面受体表达。剩余不溶性物质的酶消化没有恢复额外的 CD45 ⁺ 细胞，表明它们都在初始匀浆中释放。因此，这种快速简单的方法可以对存在于各种正常和恶性人体组织中的 CD45 ⁺ 亚群进行定性和定量评估。这种方法的另一个优点是可以收集和储存来自初始匀浆（原代组织 SN）的 SN 以供进一步分析或实验。

方案

注：使用经研究所朱尔·博尔代的医学伦理委员会与每个病人获得书面知情同意的协议被收购所有标本。

1.制备组织匀浆

1. 解剖手术切除组织（恶性和正常组织从手术室切除）是在病理实验室由受过训练的人员立即拾取。肿瘤，NANT（取最远的距离肿瘤的可能），并在1个正常组织碎片常规处理 - 3小时手术切除使用标准的生物安全程序，人体组织在BSL2实验室。该协议的流程图被示于图1。
2. 权衡所有组织碎片（正常，NANT和肿瘤），测量的长度，宽度，和高度（长度×宽度×高度）。这对于细胞亚群的随后正常化的一个重要步骤，提取的RNA， 等等。
   NOTE：样本量的范围为100至10,000 mm ³的无脂 ​​肪如果可能的话。
3. 印上与H＆E染色载玻片的肿瘤片段，以验证该组织实际上是肿瘤的一部分。
   1. 通过按肿瘤片段显微镜载玻片和应用温和的压力，用手指几秒钟做到这一点。
   2. 修复用异丙醇进行2分钟，随后在水中的洗涤步骤的幻灯片。染液组织30秒，Mayer的苏木。
   3. 在水6浴洗幻灯片。在桃红B染色的2％，持续15秒。
   4. 在水一浴跟四个浴池异丙醇和完成与水一浴洗。
   5. 孵育在异丙醇1分钟和漏。清除二甲苯的两个浴室。
   6. 安装用二甲苯基于安装中。检查对肿瘤细胞结构（ 图2）。
      注：主要，肿瘤细胞坚持印记幻灯片 - 间质，淋巴或广告ipose细胞很少残留，而使肿瘤细胞之间的空间（ 图2）。
4. 放置在含有1ml的化学上确定的，无血清造血细胞培养基的小培养皿所述组织片段（以下简称为培养基）在室温和切块成小块（约1 - 2平方^毫米 ），使用无菌的手术刀。
5. 转让的一切（组织碎片+介质）的机械离解Ç管。
6. 冲洗培养皿并手术刀用2ml使用巴氏吸管介质的，这增加了C管（培养基体积为离解= 3毫升）中。
7. 使用机械离解程序A.01对于C管（最温和的程序），以均匀的组织碎片成单细胞悬浮液。放置了C管中的装置和连续运行该程序两次（一个周期= 25秒）。
   注意：此均质过程已经建立和验证人类乳房组织，其它匝或者或组织类型可能需要使用不同的程序，应首先进行测试。
8. 从装置删除C管，并直接倒出匀浆成40μm的细胞过滤器安置在一个50ml管中。使用相同的巴斯德吸管如在步骤1.6，转移剩余在C管的细胞过滤的任何液体。
9. 过滤后的液体转移到一个15毫升的管中，使用1毫升微量移液器尖端。暂时保持细胞过滤和50ml管中。
10. 冲洗了C管与另外3毫升培养基并传送此，再次使用相同的巴斯德吸管如在步骤1.6，该细胞过滤仍然落座于50ml管中。通过轻轻地移动它周围的过滤器，用干净巴斯德吸管或1毫升提示，随后丢弃，以避免污染洗脱液挤被困在unhom​​ogenized组织进50毫升管中的残留液体的最大量。
11. 将细胞过滤对T倒挂他原来的C管和漂洗用3ml培养基，使得unhom​​ogenized组织降回到C管。
12. 再均匀化作为用于A.01程序的两个周期的步骤1.7。
13. 倾通过细胞过滤网落座于50ml管中该第二匀浆，再次冲洗了C管用3ml培养基（如在步骤1.10），并使用巴斯德吸管转移到细胞过滤落座于50ml管中再次挤压的最大从残留的结缔组织截留在细胞过滤的液体量。
14. 在这一点上，约2.5毫升的体积是在15ml试管和〜9毫升50毫升管。

2.分离的组织上清和细胞

1. 离心在15毫升匀浆和50ml试管15分钟，在600×g离心，在室温下进行。
2. 滗从15毫升管中的SN到干净的管中并暂时储存在4℃。这上清=原发肿瘤，NANT或正常TIssue SN（最终体积2.5ml）中，随后澄清并在-80℃下以供将来分析（见下文）在存储之前等分。
3. 丢弃从50ml管中的上清液。
4. 在1毫升培养基中的终体积轻轻悬浮两种细胞粒料。简要地说，首先轻轻（轻敲管上的硬表面）打破在两个管中的细胞沉淀。重悬松散细胞沉淀在50ml的用500μl培养基中，该细胞悬浮液转移到15毫升管重新悬浮所述第二颗粒。与第二500μl的培养基中对细胞的最大回收重复此步骤一次。
5. 转移10微升细胞悬浮液至小管中，混合10微升台盼蓝（稀释1：1），并计算使用血球存活细胞的数目。
   注意：在这一点上的细胞悬浮液的一小部分，也可以通过流式细胞术分析来评估细胞大小，粒度并且如果需要的亚群的标记有限数量的更多PREC在匀浆中相对细胞分布之前广泛分析或实验伊势评估。所有的分析流式细胞仪结合CD45标签的亚正常化。
6. 通过离心沉淀细胞，在300×g离心10分钟，在室温下。从肿瘤，NANT，或正常组织的细胞是现在已准备好用于进一步纯化或分析。这些额外的步骤是最好在同一天进行的外科手术时。
   注：对于流式细胞仪分析，但不是细胞分选的残余红细胞应抗体标记后，加入0.4红血细胞裂解缓冲液，以细胞沉淀，立即为1秒涡旋并温育至少10分钟，在室温进行裂解温度（避光）分析之前。

3.澄清组织的上清液

1. 离心1.5 mL管与组织SN在15000 XG为15分钟，在4℃。
2. 小心地取出吨他上清液不接触或干扰球。转移到一个干净的试管（或管），这取决于所述数量和期望的等分试样的体积。
3. 存储上清液在-80℃下以供将来使用。

4.患者血

1. 收集从每个病人作为对照通过静脉穿刺到肝素化管中的前一天，以外科手术的血液样品。离心血液于400×g离心10分钟，在20ºC与制动切断以获得血浆和血沉棕黄层。
2. 取出血浆，并通过离心，在20ºC澄清它以10,000×g离心15分钟。等分试样并储存血浆在-80℃下以供将来使用。淡化捉鬼外套中等
3. 分离使用标准聚蔗糖 - 泛影葡胺密度梯度离心之前立即进行分析，亚群分离，DNA / RNA /蛋白质的提取或超低温保存的单核细胞。

5.流式细胞仪

1. 根据制造标签的细胞的r指令在4℃，避光。裂解红血细胞在从抗体标记后的组织碎片的细胞悬浮液通过加入0.4毫升的细胞裂解缓冲液，以细胞沉淀。
2. 涡旋立即1秒和孵化至少在室温下10分钟，避光。通过在流式细胞仪进行数据采集，而不洗涤标记的细胞。

结果

组织碎片用可商购的组织离解的溶液或胶原酶的各种实验室的混合物，DNA酶和/或透明质酸酶抑制剂酶消化，切割各种各样的受体的细胞的表面上。我们的研究中，最初集中在CD4 ^{+ T}细胞浸润乳腺肿瘤，很快出现一个主要的技术问题，是由于使用标准酶消化协议^4-8表面的CD4受体的裂解。我们测试了多种胶原酶的酶有或无DNA酶和透明质酸酶抑制剂，发现胶原酶I和II完全从细胞表面除去的CD4，尽管高淋巴细胞活力（ 图3A）。上观察到的CD4适度效果用胶原酶IV在短的温育时间 - 以较低的CD4抗体标记在消化淋巴结和肿瘤组织中检测到（1 2小时）相比，来自同一患者未消化血液和骨髓（图3B;注意，由于在组织上的限制，我们得到我们无法比较消化和未消化的淋巴结和肿瘤组织）。这个损失的CD4被证实是胶原酶IV消化通过比较未消化和消化的CD4 ^{+ T}细胞从健康供体的血液中分离出来的技术副产物（数据未示出）。虽然这些CD4 ^LO T细胞可以从胶原酶IV消化的组织片段使用磁珠进行分离，纯化的群体经常含有来自肿瘤微环境变...

讨论

该研究描述了在正常和恶性乳腺组织匀浆中迅速地制备无酶消化用于随后的细胞分选，提取，冷冻保存和/或CD45 ⁺亚群的表型分析的优化方法。本实验方法的目标是产生紧密反映其在体内的状态，将它们与从手术室新鲜组织的最低限度的操作比较正常组织的TIL的图像。到今天为止，我们的实验室已使用此协议分析> 250新鲜BC组织（肿瘤和NANT），> 35正常乳腺组织，从乳腺减少。原则上，这个协议应直接适用于其它肿瘤或组织类型;然而，一些优化可能是必要的（ 即，机械解离方案，周期数，介质体积等 ）。对于组织具有低淋巴细胞浸润，使用较大的组织片段可以是necess元，这是我们做的正常组织，其中淋巴细胞计数低。或者，密度梯度离心步骤可以被添加，以丰富的白细胞悬浮液中。人T细胞和B细胞亚群浸润乳腺肿瘤的这种分析包括> 100标记通过流式细胞术评估（流式细胞术数据为74的标记可在谷-Trantien的等人 ⁹的补充数据，），以及特异性淋巴细胞纯化亚群对随后的免疫和分子分析。此外，我们已评估细胞因子，趋化因子，免疫球蛋白和肿瘤抗原在原...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GentleMacs 解离器	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine 在某种程度上等同
离心机 5810 R	Eppendorf		或其他标准台式离心机
离心机 5417 R	Eppendorf		或其他标准微量离心机
Esco II 级 A2 生物安全柜	ESCO 全球		或其他标准 BSL2 罩
倒置显微镜	Nikon eclipse TS100		或其他与血细胞计数器
Bü 兼容的显微镜;rker Chamber	Marienfield	640210	或其他标准血细胞计数器
Navios 流式细胞仪	Beckman Coulter		或其他流式细胞仪（推荐 8-10 种颜色）
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine 使用 Filcon
细胞培养皿	Sarstedt	72,710	或其他非热原塑料器皿
手术刀	Swann-Morton	0510	或标准一次性使用无菌手术刀
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	或其他非热原塑料器皿
BD Falcon 管 50 ml	Becton Dickinson	352070	或其他非热原塑料器皿
BD Falcon 管 15 ml	Becton Dickinson	352097	或其他非热原塑料器皿
BD FACS 管 5 ml	Becton Dickinson	352008	或其他非热原塑料器皿
无菌巴斯德移液管 5 ml	VWR	612-1685	或其他非热原塑料器皿
微量离心管 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	或其他非热原塑料器皿
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	推荐无血清培养基
磷酸盐缓冲盐水	Lonza	BE17-516F	标准生理 PBS
台盼蓝	VWR	17942E	或其他重要污渍
用于流式细胞术实验	VersaLyse	Beckman Coulter	A09777
的可固定活性染料 eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	流式细胞术实验
的抗 CD3 FITC	BD Biosciences	345763
CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	流式细胞术实验
抗CD4 PE	BD Biosciences	345769	用于流式细胞术实验
抗CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	流式细胞术实验
抗CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	流式细胞术实验
抗CD8 PerCP	BD Biosciences 345774		流式细胞术实验
抗CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	用于流式细胞术实验
抗 CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	用于流式细胞术实验