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方法文章

小寡聚体膜蛋白的沉降平衡研究：组氨酸质子化对五聚体稳定性的影响

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DOI：

10.3791/52404

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2015年4月2日

 , 
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

沉降平衡（SE）可用于在生理环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用。本论文描述了该技术的应用，以确定 pH 值对人呼吸道合胞病毒（hRSV）编码的小疏水性（SH）蛋白形成的同源五聚体稳定性的影响。

摘要

分析型超速离心（AUC）可用于在广泛的相互作用强度范围及生理条件下研究大分子之间可逆的相互作用。这使得 AUC 成为定量评估生化过程中瞬时且可逆的同源和异源缔合的化学计量比与热力学特性的首选方法。在沉降平衡（SE）模式中，扩散与沉降达到平衡，形成依赖于特定缔合模型的径向距离分布曲线。本文详细描述了一种利用分析型超速离心仪测定小膜蛋白寡聚体大小及其单体-单体缔合能的 SE 实验方案。AUC-ES 无需标记，仅基于物理原理，既可用于水溶性蛋白，也可用于膜蛋白。本文以人呼吸道合胞病毒（hRSV）中的小疏水性（SH）蛋白为例进行说明，该蛋白是由 65 个氨基酸组成的多肽，含有单一 α-螺旋跨膜（TM）结构域，可形成五聚体离子通道。基于核磁共振（NMR）的结构数据显示，SH 蛋白的跨膜区含有两个可质子化的组氨酸残基，其朝向通道腔内。本研究设计了 SE 实验，以确定 pH 如何影响 SH 蛋白的缔合常数及其寡聚体大小。结果表明，在所有情况下均保持五聚体形式，但在低 pH 下其缔合常数降低。这些数据与 SH 通道活性所观察到的类似 pH 依赖性一致，支持 SH 蛋白中两个组氨酸残基朝向腔内的取向。后者在低 pH 下可能经历静电排斥，导致寡聚体稳定性下降。综上所述，该方法适用于需要在生理条件下定量测量蛋白质-蛋白质相互作用细微变化的研究。

引言

分析型超速离心1-5是研究大分子在生理条件下相互作用的最重要方法之一，适用于弱相互作用和强相互作用。该方法无需标记，利用光吸收或干涉，甚至可结合荧光光学系统，检测浓度范围跨越多个数量级6。

该方法尤为有用，因为大多数生物化学过程都依赖于可逆的相互作用。为了理解生物学过程，必须对这些相互作用的化学计量比和结合强度进行定量表征，目前已有多种方法可用于此目的7,8。然而，短暂的相互作用难以研究9。

表征大分子相互作用的方法选择取决于其静态或动态特性。在第一种情况下，使用沉降速度（SV）方法，通过测量径向迁移速率，并根据浮力质量和形状的差异对复合物进行分级分离。

相比之下，在实验时间尺度上可逆的动态相互作用无法通过物理方法分离。在这种情况下，由自身或异源相互作用引起的非共价结合处于依赖于总蛋白浓度的平衡状态。这类动态相互作用可通过沉降平衡（SE）和沉降速度（SV）两种方法进行研究10。然而，前一种方法操作更为简便，本文将对此进行描述。在沉降平衡（SE）中，以足够低的转速进行离心，使扩散与沉降之间达到平衡。此时，可利用预设的热力学模型，分析光学信号（紫外-可见光，UV-VIS）随径向距离变化的平衡分布曲线，从而研究分子间的缔合行为11。

本文介绍了一项关于形成离子通道的病毒膜蛋白自缔合的沉降平衡研究。由于该蛋白具有疏水性，实验需在去垢剂存在下进行，此时需要将溶剂密度与去垢剂密度相匹配。然而，对于水溶性蛋白而言，所描述的实验方案完全相同，唯一的区别是无需进行溶剂密度匹配。

所用蛋白由人类呼吸道合胞病毒（hRSV）编码，该病毒是一种有包膜的副黏病毒科肺病毒，可在全球范围内的婴儿、老年人和免疫功能低下人群中引起下呼吸道疾病12。每年报告的hRSV感染病例高达6400万例，导致约16万人死亡。

人呼吸道合胞病毒（hRSV）基因组可转录出11种蛋白，包括三种膜蛋白F、G和小型疏水性（SH）蛋白。SH蛋白参与RSV感染的致病过程。缺失SH基因的RSV（RSVΔSH）仍具有活性，能够形成合胞体，其生长能力与野生型（WT）病毒相当13-16。然而，RSVΔSH病毒在上呼吸道中的复制效率比野生型病毒低10倍15,16。此外，RSVΔSH病毒在in vivo小鼠和黑猩猩模型中表现出减毒特性13,17。

SH蛋白是一种II型整合膜蛋白，长64个（呼吸道合胞病毒A亚组）或65个（呼吸道合胞病毒B亚组）氨基酸，  主要在高尔基体区室的膜上积累 18.  SH蛋白具有一个预测的α螺旋跨膜（TM）结构域 19 高度保守的 20,21C端和N端的膜外结构域分别朝向腔内/胞外和胞质。

合成的跨膜区（残基18-43）和全长SH蛋白均已被证实可在多种去垢剂中形成同源五聚体。该同源五聚体形式在平面脂双层中具有通道活性22,23。跨膜单体在脂双层中的正确取向最初通过位点特异性红外二色性技术确定23，结果显示His-22位于管腔侧，接近螺旋间取向。核磁共振（NMR）研究进一步验证了该跨膜区取向，该研究在十二烷基磷胆碱（DPC）胶束中重构了全长蛋白的五聚体α-螺旋束结构22。在此“胶束”模型中，单个α-螺旋跨膜区的N端前接一段α-螺旋，C端后接一段延伸的β-发夹结构。SH蛋白的两个可质子化残基His-22和His-51分别位于跨膜区（朝向管腔侧）以及膜外C端β-发夹的顶端（远离通道孔）。然而，在双胶束环境中，跨膜α-螺旋 延伸至His-51，且两个His残基均可暴露于通道管腔24。通道结构呈现 漏斗状构型22，其中较窄区域（Ser-29至Cys-45）22由疏水侧链（Ile-32、Ile-36、Ile-40和Leu-44）构成，Ile-36定义了通道管腔的最窄点。His-22位于该漏斗最大开口处，而His-51位于最小开口的顶端。

在本研究中，采用沉降平衡模式的分析型超速离心法，检测组氨酸质子化是否影响SH蛋白五聚体的稳定性。在此情况下，SH蛋白溶解于C14-甜菜碱去垢剂中，此前已利用该去垢剂证明SH蛋白可形成五聚体寡聚物22。

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方案

本方案基于以下资源，更多详细信息和特殊注意事项请参考这些文献3,25-28。

1. 去垢剂胶束与2H2O的密度匹配

注意：缓冲液的密度需要与去垢剂胶束的密度相匹配。常用的密度调节剂包括 2H2O, H218O, 2H218甘油和蔗糖29. H218O 与 的密度相同 2H2O，如果不需要对蛋白质中可交换的质子进行氘代，则可能是更合适的选择。在此方案中，将使用3-(N,N-二甲基肉豆蔻酰氨基)丙烷磺酸盐（C14SB）去垢剂，在50 mM Tris pH 7.3、100 mM NaCl条件下的密度匹配 2H2O. 作为初步估计，以下浓度的 2H2O 将使用以下体积分数：10%、30% 和 50%。

1.1. 样品制备

  1. 配制以下贮存液，并通过 0.2 μm 针头滤器过滤除菌：50 mL 500 mM Tris（pH 7.3）和 1 M NaCl（10X 缓冲液）；1 mL 250 mM C14SB（50X 去垢剂溶液）。
  2. 通过混合 20 μl 10X 缓冲液、4 μl 50X 去垢剂溶液、20 μl 2H2O（99.9%）和 156 μl 去离子 H2O，配制 200 μl 的样品溶液。另通过混合 20 μl 10X 缓冲液、20 μl 2H2O（99.9%）和 160 μl 去离子 H2O，配制 200 μl 的参考溶液。
  3. 对其他 2H2O 浓度（即 30% 和 50%）重复步骤 1.1.2，相应调整 2H2O 与 H2O 的体积。

1.2. 6通道AUC样品池的组装及样品加样。

注意：根据样品加样方法的不同，AUC 有两类转头细胞。无外置加样装置的细胞必须在密封细胞前完成加样，而带有外置加样装置的细胞可在细胞密封后进行加样。此前已有文献描述了带有外置加样装置的 AUC 细胞的组装方法3。本方案中描述的是无外置加样装置的 6 通道 AUC 细胞的组装。其主要区别在于该细胞两侧均带有需分别拧紧的螺纹环，且不需要外壳塞（图 1）。下文将突出说明组装步骤中的差异。

光谱仪外壳组件的爆炸图，包含螺钉环、垫圈和中心部件。
图 1. 无外置填充的6通道AUC分析池爆炸示意图。 本图改编自Beckman Coulter An-50 Ti和An-60 Ti分析转子、分析池及配重用户手册。

  1. 为每个AUC细胞准备两个窗片组件，使用蓝宝石窗片代替石英窗片（图2）。将窗片垫圈放入窗片支架中。轻轻弯曲窗片衬垫，并将其置入窗片支架内，使缝隙位于与窗片支架键槽相对的一侧。将蓝宝石窗片放入窗片衬垫内，使其标记与窗片支架的键槽对齐。
    注意：石英窗片具有可压缩性，因此在高速下会产生更强的光折射28, 30。因此，在转速超过30000 rpm的干涉测量中（例如本密度匹配实验），需使用蓝宝石窗片。蓝宝石窗片比石英窗片更重，其侧面刻有“X”标记。

带石英/蓝宝石透镜和键槽的光学组件示意图；对准和组件细节。
图2. 窗口组件的爆炸图。 本图修改自Beckman Coulter An-50 Ti和An-60 Ti分析转子、离心池及配平块用户手册

  1. 将细胞培养盒放置 货号 倒置将键槽与外壳的键对齐后，滑入细胞培养外壳 首先将一个六区中心部件斜面朝下放置，随后安装一个窗式组件 窗口朝下放置（图 1，左）。
  2. 在螺纹环螺纹和螺纹环垫圈上薄薄地涂一层Spinkote。将一个螺纹环垫圈置于窗口组件上方。将螺纹环安装到窗口外壳中，使“OUT”字样朝向外侧。使用细胞对准工具手动拧紧螺纹环。
  3. 使用扭矩扳手将螺钉环拧紧至 仅 60 英寸-磅.
  4. 将细胞置于 部件编号 直立并定位在12点钟方向. 加载 120 μl 参考放入左侧行中 110 μl 将样本加入相应的孔中。确保每个样本与参照物正确配对。
    注意：样品体积无需精确，但参比样品的体积需略大于待测样品（5-10 μl以便样品的弯月面清晰可见。
  5. 小心地将一个窗口组件（窗口朝下）滑入细胞室中（图1，右）。注意不要过度扰动细胞室，以免洒出内容物。
  6. 重复步骤 1.2.3 和 1.2.4，拧紧第二个螺纹环至 120 英寸-磅倒置细胞，并重新拧紧第一个螺纹环以 120 英寸-磅.
  7. 将细胞加入转子中，按照制造商的说明将转子安装到离心机中，并安装单色器 28.
    注：此步骤的详细信息也可参见该参考文献 3.

1.3. 设置干涉测量

  1. 启动 AUC 仪器的用户界面软件，并根据制造商的说明（以下步骤将简要概述）对每个样品池在 3000 rpm 条件下进行激光设置和径向校准。
  2. 1.3.1.1 在达到足够的真空度（< 100 微米）后，以 3000 rpm 运行离心机。在用户界面软件中预览干涉图样，并调节激光参数以获得最高对比度。
  3. 创建一个新的设置文件（文件 | 新建文件），选择“平衡”和“干涉”测量模式。设置一个沉降平衡方法（“方法”按钮），以 45000 rpm 或预计用于蛋白质样品的最高转速（取较高者）运行，运行温度设为 20°C，每 15 分钟采集一次扫描数据。在 HeteroAnalysis 中打开数据文件并选择“匹配”功能，以监测平衡进程（至少 12 小时后，约过夜，图 3）。
    注意：SEDFIT 中也提供类似功能（选项 | 加载选项 | 测试平衡进程）。

RMSD 与时间关系图；数据分析；蛋白质稳定性；生物信息学；科学图表。
图3. HeteroAnalysis 匹配功能的结果。 匹配功能可用于通过比较连续扫描之间与最后一次扫描的RMSD来监测平衡进程。本示例显示，经过8小时后RMSD值趋于X轴渐近线，表明已达到平衡状态。

1.4. 数据分析

  1. 针对每组样本，将径向分布曲线的斜率相对于2H2O 浓度作图。
    注意：分布曲线为接近线性的极浅指数曲线。X轴截距对应匹配的2H2O 浓度。
  2. 为获得更准确的结果，应进行多次重复实验。或者，在更窄的2H2O 浓度范围内重复实验。

2. C14SB 胶束中 SH 的沉降平衡

2.1. 运行参数

  1. 使用 SEDNTERP 计算缓冲液密度和黏度、蛋白质偏比容以及离心速度。在“Buffer Data Select”部分选择“Compute”以计算缓冲液密度和黏度，并根据缓冲液组分输入相应信息，包括 D2O 浓度。
  2. 2.1.1.1 要计算蛋白质偏比容，在“V-bar”部分选择“Compute”，并输入蛋白质的氨基酸序列。在“Make an oligomer from this monomer: N=”字段中指定预期的最大寡聚体大小，本例中 N = 5。在主窗口的 RPM 字段中输入数值以计算转速，直至 σ ≈ 1；这是一种经验法则，用于确保径向分布曲线具有良好的指数形状25。
    注意：本实验计算得到的参数值如下：ρ = 1.03839 g/ml，η = 1.0267 cP = 0.7569 ml/g，ω1 = 16000 rpm。
  3. 计算后续应采用的转速，以确保不同转速下的分布曲线之间存在足够差异25。
    注意：此步骤也可通过 SEDFIT 中的“Estimate equilibrium rotor speeds function”功能完成，该功能会考虑溶液柱（填充体积）的影响。

2.2. 样品制备

  1. 准备 1 ml 参考文献 含 5 mM C14SB 和 32.3% 的溶液 2H2通过密度匹配实验（第1节）确定的O，通过混合 100 μl 10X 缓冲液（步骤 1.1.1）， 20 μl 50倍浓度洗涤剂溶液（步骤1.1.1）， 323 μl 2H2O (99.9%) 和 527 μl 去离子水2O.
  2. 溶解冻干的、经HPLC纯化的SH肽（其表达与纯化方法此前已有描述）31) 溶于适当的溶剂中，如甲醇或50%（v/v）水-乙腈溶液。使用微升量程紫外/可见光分光光度计测定溶解肽的A280值，并分装成三份样品，使A280，12毫米 = 0.3、0.5 和 0.8（A280，10 毫米 = 0.25、0.417 和 0.67）各自稀释至 130 μl. 将样品冻干过夜，然后重悬于 130 μl 参考溶液（步骤 2.2.1）以得到 样本 溶液
    注意：由于SH蛋白含有色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基，可通过280 nm处的紫外/可见光吸收检测。不含芳香族残基的蛋白质可通过标记合适的发色团、使用含Trp的突变体，或采用干涉测量代替吸光度进行检测。
  3. 按照第1.2节中的步骤组装一个6通道AUC细胞 带有石英窗口. 加入最高浓度的样品（A280，12毫米 = 0.8）在靠近转子中心的通道中，且为浓度最低的样品（A280, 12毫米 距离转子中心最远（= 0.3）。

2.3. 设置吸光度测量

  1. 创建一个新的设置文件（文件 | 新建文件），选择“平衡”和“吸光度”测量模式，并将检测波长设定为 280 nm。
  2. 在 3000 rpm 条件下进行径向校准：在扫描选项中勾选“首次扫描前进行径向校准”，设置低分辨率数据采集参数，例如径向步长 = 0.01 cm，重复次数 = 3（低分辨率，快速），然后执行一次单次扫描。扫描完成后，取消勾选该选项。
  3. 建立一个沉降平衡方法（点击“方法”按钮），以步骤 2.1.3 中计算出的第一个转速运行，温度设为 20°C，每 30 分钟采集一次扫描数据。在每个样品池的“详细设置”中，按照步骤 2.3.2 的方式设定低分辨率数据采集。至少 18 小时后（约过夜，见图 4），在 HeteroAnalysis 中打开数据文件并使用“匹配”功能监测平衡进程。
    注意：在第一个转速下达到平衡可能需要较长时间，而后续转速所需的平衡时间将较短。

显示科学实验中数据分析趋势的四个均方根误差（RMSE）随时间变化的图表。
图4. 异源分析匹配函数（HeteroAnalysis Match function）的结果。第一和第二速度（左上和右上）似乎已达到平衡，但最好再等待数小时以确认。相比之下，第三和第四速度（左下和右下）明显在更短时间内达到了平衡。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 达到平衡后，以高分辨率采集单次扫描数据，例如，径向步长 = 0.001 cm，重复次数 = 10（高分辨率，慢速）。
  2. 扫描完成后，对下一个转速重复步骤 2.3.3 和 2.3.4。
  3. 可选：当已知每个转速下达到平衡所需时间（通过计算或经验获得）时，可设置沉降平衡方法的扫描程序，包含步骤 2.1.3 中计算出的所有转速，并在每个转速的平衡时间结束后采集一次扫描。在此情况下，应在每个样品池的“Detail”中指定高分辨率数据采集。

2.4. 在 SEDFIT 和 SEDPHAT 中进行数据分析

注意：有关数据分析的更多细节和注意事项，读者可参考以下网站：www.analyticalultracentrifugation.com。

  1. 在 SEDFIT 中打开高分辨率扫描文件（数据 | 载入沉降平衡数据），并将数据拆分为 3 个通道（这些通道对应每个样品的不同浓度；选项 | 载入选项 | 将 6 通道原始数据保存为 3 个子集）。
  2. 在 SEDFIT 中重新打开属于同一样品、相同浓度但不同转速的数据文件。调整弯月面（垂直红色线）、细胞底部（垂直蓝色线）和拟合范围（垂直绿色线），然后导出数据以供 SEDPHAT 使用（数据 | 导出数据至 SEDPHAT）。输入步骤 2.1.1 中计算得到的参数，以及所需的转子类型和中心部件类型。对每个样品和每个浓度重复此步骤。
  3. 在 SEDPHAT 中打开同一样品的所有数据（所有浓度和转速），并填写实验参数；示例见图 5。
    注意：当缓冲液中添加 D2O 时，可交换质子的氘化可能显著改变蛋白质的分子量，尤其是水溶性蛋白质。膜蛋白（特别是像 SH 蛋白这样的小蛋白）受影响较小，因为嵌入膜内的区域可避免发生交换。为校正此效应，请输入“缓冲液中 D 的摩尔分数”。
    注意：建议在此步骤中通过选择菜单 数据 | 复制全部数据并另存为新配置，将编辑后的数据集单独保存。
  4. 选择一个模型，并填写该模型的全局参数。
    注意：例如，“单体-n-聚体自关联”模型及其参数如图 6 所示。

多速度吸光度平衡实验的参数输入界面，显示数据输入和设置。
图5. 填写实验参数的示例。

平衡分析软件界面；显示浓度和平衡常数等参数。
图6. 填写单体-n-聚体自关联模型全局参数的示例。

  1. 通过选择菜单“拟合 | 全局拟合”执行全局拟合，并等待拟合收敛。记录（或截屏保存）拟合结果，特别是全局约化卡方值和 log Ka 值。从“复制和显示 | 显示热力学信息”菜单中提取其他数据，如拟合数据和拟合残差。
  2. 返回“全局参数”，勾选 M(1) 以拟合单体分子量，并重复步骤 2.4.5。记录拟合得到的分子量及全局约化卡方值。
  3. 对每个待检验的模型重复步骤 2.4.3 至 2.4.6，通过比较各模型的全局约化卡方值及拟合残差来评估拟合质量。
    注意：较小且随机分布的拟合残差通常表明拟合效果良好，最佳拟合模型应具有最小的全局约化卡方值。拟合得到的单体分子量及其卡方值不应与固定（理论）分子量有显著差异。
  4. 通过以下步骤计算所得 log Ka 值的置信区间：首先选择“统计 | 误差曲面投影的临界卡方值”，输入所需的置信水平；然后进入“统计 | 生成一维误差曲面投影”，在“全局参数”对话框中取消选中 log Ka，以获得对应于 log Ka 的卡方值。
    注意：建议读者参考以下资源（http://www.analyticalultracentrifugation.com/sedphat/statistics.htm）以获取有关该方法32的更多细节及其示例说明33。

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结果

C14SB 去垢剂胶束在 50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.3 条件下的径向分布曲线呈非常平缓的指数形式，可拟合为线性模型（图7A。该分布的斜率与 D 呈负相关2O浓度（图7B斜率为零的点， 即， 匹配的 D2O浓度被发现为32.3%。

参见 图7 下方.

采用不同的缓冲液重复该实验：50 mM 磷酸钠、100 mM NaCl、pH 5.5，以及 50 mM 磷酸-柠檬酸、100 mM NaCl、pH 3，以分别获得 D2O 浓度为 30.3% 和 41.0% 的匹配条件。

将SH野生型（wt）在去垢剂中的样品分别暴露于pH值为3、5.5和7.3的条件（共6个样品），随后在15,000、19,000、23,000、28,000、34,...

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讨论

本文提供了一种利用平衡沉降法对去垢剂溶液中小型膜蛋白寡聚化的样品制备与分析的实验方案。该方案同样适用于可溶性蛋白，且操作更为简便，因为无需进行密度匹配步骤。实际上，该体系由去垢剂与蛋白的混合物构成。为开展沉降实验，需使去垢剂在重力场中“不可见”，从而避免其对颗粒浮力产生影响。因此，必须通过添加D来精确匹配去垢剂的密度。2O 加入缓冲液，但需注意，如果所用去垢剂密度过高， 例如，SDS，甚至不是100% D2O 可以与之匹配。当处理水溶性蛋白时，由于样品不含去垢剂，因此无需进行密度匹配步骤。

在我们的应用中，使用了一种可形成离子通道的小型病毒蛋白。与其他病毒孔蛋白一样，SH蛋白具有α-螺旋跨膜结构域，因此必须在不会破坏其天然寡聚体大小的去污剂中进行研究。

因此，在进行这些研究之前，必须筛选合适的去垢剂。例如，在此前的SE研究中，SH蛋白在DPC、C8E5和C14-甜菜碱中均形成五聚体寡聚物，且在温和去垢剂PFO中进行电泳时也观察到五聚体22。所有...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由国家研究基金会资助，项目编号为 NRF-CRP4-2008-02（J.T.）和第一层级资助项目 RG 51/13。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-(N,N-二甲基十四烷基氨基)丙烷磺酸盐SigmaT0807
氘代水 99.8%Cambridge IsotopeDLM-4-99.8
An-50 Ti 转子，分析型，8 孔位Beckman Coulter363782
An-60 Ti 转子，分析型，4 孔位Beckman Coulter361964
样品池外壳Beckman Coulter334784
12 mm 六通道中心件，环氧树脂炭填充Beckman Coulter331376
窗片夹持器Beckman Coulter305037
窗片密封圈Beckman Coulter327021
窗片衬套Beckman Coulter362329
蓝宝石窗片Beckman Coulter307177
石英窗片Beckman Coulter301730
螺环垫圈Beckman Coulter362328
螺环Beckman Coulter301922
SpinkoteBeckman Coulter306812
扭矩支架组件Beckman Coulter361318
平衡管Beckman Coulter360219
样品池对准工具Beckman Coulter362340
SEDNTERPhttp://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIThttp://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedfit.htm
SEDPHAThttp://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedphat/default.htm

参考文献

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