小寡聚体膜蛋白的沉降平衡研究：组氨酸质子化对五聚体稳定性的影响

摘要

沉降平衡（SE）可用于在生理环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用。本论文描述了该技术的应用，以确定 pH 值对人呼吸道合胞病毒（hRSV）编码的小疏水性（SH）蛋白形成的同源五聚体稳定性的影响。

摘要

分析型超速离心（AUC）可用于在广泛的相互作用强度范围及生理条件下研究大分子之间可逆的相互作用。这使得 AUC 成为定量评估生化过程中瞬时且可逆的同源和异源缔合的化学计量比与热力学特性的首选方法。在沉降平衡（SE）模式中，扩散与沉降达到平衡，形成依赖于特定缔合模型的径向距离分布曲线。本文详细描述了一种利用分析型超速离心仪测定小膜蛋白寡聚体大小及其单体-单体缔合能的 SE 实验方案。AUC-ES 无需标记，仅基于物理原理，既可用于水溶性蛋白，也可用于膜蛋白。本文以人呼吸道合胞病毒（hRSV）中的小疏水性（SH）蛋白为例进行说明，该蛋白是由 65 个氨基酸组成的多肽，含有单一 α-螺旋跨膜（TM）结构域，可形成五聚体离子通道。基于核磁共振（NMR）的结构数据显示，SH 蛋白的跨膜区含有两个可质子化的组氨酸残基，其朝向通道腔内。本研究设计了 SE 实验，以确定 pH 如何影响 SH 蛋白的缔合常数及其寡聚体大小。结果表明，在所有情况下均保持五聚体形式，但在低 pH 下其缔合常数降低。这些数据与 SH 通道活性所观察到的类似 pH 依赖性一致，支持 SH 蛋白中两个组氨酸残基朝向腔内的取向。后者在低 pH 下可能经历静电排斥，导致寡聚体稳定性下降。综上所述，该方法适用于需要在生理条件下定量测量蛋白质-蛋白质相互作用细微变化的研究。

引言

分析型超速离心^1-5是研究大分子在生理条件下相互作用的最重要方法之一，适用于弱相互作用和强相互作用。该方法无需标记，利用光吸收或干涉，甚至可结合荧光光学系统，检测浓度范围跨越多个数量级⁶。

该方法尤为有用，因为大多数生物化学过程都依赖于可逆的相互作用。为了理解生物学过程，必须对这些相互作用的化学计量比和结合强度进行定量表征，目前已有多种方法可用于此目的^7,8。然而，短暂的相互作用难以研究⁹。

表征大分子相互作用的方法选择取决于其静态或动态特性。在第一种情况下，使用沉降速度（SV）方法，通过测量径向迁移速率，并根据浮力质量和形状的差异对复合物进行分级分离。

相比之下，在实验时间尺度上可逆的动态相互作用无法通过物理方法分离。在这种情况下，由自身或异源相互作用引起的非共价结合处于依赖于总蛋白浓度的平衡状态。这类动态相互作用可通过沉降平衡（SE）和沉降速度（SV）两种方法进行研究¹⁰。然而，前一种方法操作更为简便，本文将对此进行描述。在沉降平衡（SE）中，以足够低的转速进行离心，使扩散与沉降之间达到平衡。此时，可利用预设的热力学模型，分析光学信号（紫外-可见光，UV-VIS）随径向距离变化的平衡分布曲线，从而研究分子间的缔....

方案

本方案基于以下资源，更多详细信息和特殊注意事项请参考这些文献^3,25-28。

1. 去垢剂胶束与²H₂O的密度匹配

注意：缓冲液的密度需要与去垢剂胶束的密度相匹配。常用的密度调节剂包括 ²H₂O, H₂¹⁸O, ²H₂¹⁸甘油和蔗糖²⁹. H₂¹⁸O 与 的密度相同 ²H₂O，如果不需要对蛋白质中可交换的质子进行氘代，则可能是更合适的选择。在此方案中，将使用3-(N,N-二甲基肉豆蔻酰氨基)丙烷磺酸盐（C14SB）去垢剂，在50 mM Tris pH 7.3、100 mM NaCl条件下的密度匹配 ²H₂O. 作为初步估计，以下浓度的 ²H₂O 将使用以下体积分数：10%、30% 和 50%。

1.1. 样品制备

1. 配制以下贮存液，并通过 0.2 μm 针头滤器过滤除菌：50 mL 500 mM ....

结果

C14SB 去垢剂胶束在 50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.3 条件下的径向分布曲线呈非常平缓的指数形式，可拟合为线性模型（图7A。该分布的斜率与 D 呈负相关₂O浓度（图7B斜率为零的点， 即， 匹配的 D₂O浓度被发现为32.3%。

参见 图7 下方.

采用不同的缓冲液重复该实验：50 mM 磷酸钠、100 mM NaCl、pH 5.5，以及 50 mM 磷酸-柠檬酸、100 mM NaCl、pH 3，以分别获得 D₂O 浓度为 30.3% 和 41.0% 的匹配条件。

将SH野生型（wt）在去垢剂中的样品分别暴露于pH值为3、5.5和7.3的条件（共6个样品），随后在15,000、19,000、23,000、28,000、34,.......

讨论

本文提供了一种利用平衡沉降法对去垢剂溶液中小型膜蛋白寡聚化的样品制备与分析的实验方案。该方案同样适用于可溶性蛋白，且操作更为简便，因为无需进行密度匹配步骤。实际上，该体系由去垢剂与蛋白的混合物构成。为开展沉降实验，需使去垢剂在重力场中“不可见”，从而避免其对颗粒浮力产生影响。因此，必须通过添加D来精确匹配去垢剂的密度。₂O 加入缓冲液，但需注意，如果所用去垢剂密度过高， 例如，SDS，甚至不是100% D₂O 可以与之匹配。当处理水溶性蛋白时，由于样品不含去垢剂，因此无需进行密度匹配步骤。

在我们的应用中，使用了一种可形成离子通道的小型病毒蛋白。与其他病毒孔蛋白一样，SH蛋白具有α-螺旋跨膜结构域，因此必须在不会破坏其天然寡聚体大小的去污剂中进行研究。

因此，在进行这些研究之前，必须筛选合适的去垢剂。例如，在此前的SE研究中，SH蛋白在DPC、C8E5和C14-甜菜碱中均形成五聚体寡聚物，且在温和去垢剂PFO中进行电泳时也观察到五聚体²²。所有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-(N,N-二甲基十四烷基氨基)丙烷磺酸盐	Sigma	T0807
氘代水 99.8%	Cambridge Isotope	DLM-4-99.8
An-50 Ti 转子，分析型，8 孔位	Beckman Coulter	363782
An-60 Ti 转子，分析型，4 孔位	Beckman Coulter	361964
样品池外壳	Beckman Coulter	334784
12 mm 六通道中心件，环氧树脂炭填充	Beckman Coulter	331376
窗片夹持器	Beckman Coulter	305037
窗片密封圈	Beckman Coulter	327021
窗片衬套	Beckman Coulter	362329
蓝宝石窗片	Beckman Coulter	307177
石英窗片	Beckman Coulter	301730
螺环垫圈	Beckman Coulter	362328
螺环	Beckman Coulter	301922
Spinkote	Beckman Coulter	306812
扭矩支架组件	Beckman Coulter	361318
平衡管	Beckman Coulter	360219
样品池对准工具	Beckman Coulter	362340
SEDNTERP			http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis			http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm
SEDPHAT			http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm