三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

摘要

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA PCR阵列评估microRNA表达变化的实验流程，以及利用生物信息学分析预测miRNA靶点，并通过双荧光素酶报告基因实验验证靶点的策略。

摘要

神经干细胞（NSCs）能够在特定的局部微环境中进行自我更新，并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。本文介绍了一套用于克隆性人源神经干细胞（hNSC）系三维（3D）分化及miRNA分析的方法，该细胞系目前正处于针对中风后残疾的临床试验阶段（NCT01151124 和 NCT02117635，Clinicaltrials.gov）。这些hNSC来源于经伦理批准的妊娠早期人胎儿大脑皮层组织，并通过逆转录病毒介导的方式，整合单拷贝的c-mycER^TAM构建体实现条件性永生化。我们描述了如何在3D支架上诱导hNSC分化后，检测其轴突突起的生长情况，以及如何利用PCR阵列定量分析相关miRNA表达的变化。此外，我们还举例说明了计算分析方法，旨在筛选miRNA的潜在靶基因。SOX5 和 NR4A3 被鉴定为在分化后的hNSC中显著下调的miRNA的合适潜在靶点。通过双荧光素酶报告质粒转染及双荧光素酶检测，对SOX5和NR4A3的3’非翻译区（3’UTR）进行了miRNA靶向验证。

引言

干细胞研究在再生医学中发挥着核心作用，该领域还涵盖了组织工程、发育细胞生物学、细胞治疗、基因治疗以及生物材料（支架和基质）等多个学科。干细胞在器官发育和组织修复中均具有重要意义；了解干细胞的作用机制对于开发新的基于干细胞的治疗方法至关重要¹。CTX0E03 是一种克隆性、条件性永生化的人类神经干细胞（hNSC）细胞系² ，源自妊娠第一孕期的人类胎儿大脑皮层。CTX0E03具有明确的质量特征，符合药品生产质量管理规范（GMP）下临床细胞库建立的关键要求³。人类神经干细胞可自发分化为神经元、胶质细胞和少突胶质细胞，并已在局灶性脑缺血的啮齿类动物模型中被证实能够改善神经功能缺陷^2,4,5。目前，CTX0E03人类神经干细胞正在进行针对中风后残疾的临床试验（NCT01151124⁶ 和 NCT02117635，Clinicaltrials.gov）。

miRNA 平均长度为 22 个核苷酸，是已被证实的调控分子⁷，它们不编码蛋白质，而是结合到 mRNA 的 3' 非翻译区（3’UTR），调控其稳定性及翻译成蛋白质的过程。研究表明，miRNA 参与调控多种细胞过程，包括发育、增殖和分化⁸。已有多个 miRNA 被发现参与调控神经干细胞的命运决定与特化⁹。

在二维（2D）标准培养环境中，其复杂性 体内 环境不匹配，因此无法实现人神经干细胞分化的最佳诱导与调控。 体内，细胞被其他细胞和细胞外配体构成的三维（3D）微环境所包围，其中包括多种胶原蛋白、层粘连蛋白及其他基质蛋白（细胞外基质，ECM）。已有研究报道，模拟ECM的材料的结构形貌及其几何特征会影响细胞表型与细胞命运^10-15市面上有多种商用3D支架可供选择；我们采用了一种高度多孔的聚苯乙烯支架，其结构经过精心设计，具有明确且均一的架构，形成厚度为200 µm的膜，可为细胞侵入和分化提供三维空间^16-18.

本文采用二维和三维分化实验来评估轴突突起的生长。此外，我们描述了一种方法，用于分析临床级人神经干细胞系中miRNA的表达谱，以进一步研究miRNA对其分化的影响。本文所展示的方法基于文献¹⁹中最初描述的方法。

方案

1. 三维（3D）培养中HNSC的分化

注意：人神经干细胞（hNSCs）的分离与获取来自先前出版物中描述的经伦理批准的组织²。在执行本实验方案时，请严格遵守相关伦理与机构指南。

1.1）使用三维培养 12孔板

1. 整个操作过程中均需使用无菌技术。在生物安全柜中，通过沿每孔孔壁加入 2 ml 使用冲洗用水（WFIr）配制的 70% 乙醇来重新水化支架，避免直接接触支架。
2. 小心吸除 70% 乙醇，并立即用每孔 2 ml DMEM:F12 溶液洗涤支架 1 分钟。重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，小心吸除 DMEM:F12 溶液。
3. 在每孔中加入含有层粘连蛋白（10 µg/ml）的 DMEM:F12 溶液 2 ml，对支架进行包被。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育至少 2 小时。用预热的 DMEM:F12 溶液洗涤培养板。
4. 在每个支架中接种约 500,000 个 hNSCs，接种体积为 150 µl RMM+GFs 溶液。
5. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育 3 小时，使细胞沉降并进入支架内部。
6. 向每孔中加入 3.5 ml RMM 溶液，注意避免将细胞从支架上冲起。
7. 继续孵育培养板 7 天；在接种后第 1 天（首次换液）更换培养基（每孔 3.5 ml RMM），并在首次换液后 2–3 天再次更换。
8. 7 天后，移除培养基，加入 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞用于免疫细胞化学（ICC）检测；或每孔加入 500 µl 裂解试剂用于总 RNA 提取（将培养板储存于 ≤ -80 °C 条件下，或直接进行总 RNA 提取）。

1.2）轴突突起生长的测量

1. 根据标准的免疫细胞化学（ICC）方案²⁰，使用β3-微管蛋白（TUBB3）一抗及荧光染料偶联的二抗对4%多聚甲醛固定的分化后人神经干细胞（hNSCs）进行染色。用Hoechst（1 µM）对细胞核进行复染。
2. 使用荧光显微镜拍摄β3-微管蛋白染色细胞的代表性图像；将图像保存为tiff或jpeg格式。使用 软件 测量工具（例如 Image-Pro Plus）测量轴突突起的生长情况。
3. 打开图像，在工具栏中选择“测量”选项，并选择“轨迹”功能。
4. 开始轨迹测量时，通过单击鼠标在轴突突起上选择起点。沿轴突突起的全长进行轨迹追踪；单击右键结束每条轨迹。重复上述操作，测量视野内所有轴突突起的长度。
5. 以像素或µm为单位表示测量结果（取决于校准设置）。将长度测量数据导出至电子表格程序，用于样本间的比较和统计分析。

2. 使用聚焦于干细胞与发育通路的miRNA PCR阵列检测miRNA表达

2.1）miRNA 总 RNA 提取

1. 对支架材料以及二维培养的样本（分化与未分化的hNSC对照）进行miRNA提取。
2. 如需要，将置于12孔板中的支架材料解冻。将两个孔中的裂解试剂（各500 µl）合并至同一个1.5 ml离心管中，最终裂解试剂体积为1 ml。注意保留支架材料在原孔中。
3. 对于先前收集并干燥沉淀的二维培养样本（分化的hNSC二维培养物及未分化的对照），加入1 ml裂解试剂，并将内容物转移至1.5 ml微量离心管中。
4. 使用1 ml注射器和短的20至25号针头对每个测试样本进行匀浆处理。用1 ml注射器将裂解液反复通过针头推注最多5次，直至获得均一的裂解液。
5. 向每个离心管中加入200 µl氯仿，盖紧管盖。颠倒并涡旋混匀管内液体。
6. 将含有匀浆液的每个1.5 ml微量离心管在≥12,000 × g条件下离心15分钟。
7. 将每个样本的上层水相（避免转移任何中间相或粉红色液体）转移至含有750 µl 100%乙醇的新鲜1.5 ml微量离心管中。通过反复颠倒充分混匀。
8. 吸取最多700 μl的每个测试样本（包括任何沉淀物）加入2 ml收集管中的小柱内。盖好盖子，在≥8,000 × g条件下室温离心约30秒。弃去穿流液。使用剩余样本重复此步骤。
9. 进行15分钟的DNA消化处理。
10. 向小柱中加入700 μl RWT缓冲液，并在≥8,000 × g条件下离心约30秒。弃去穿流液。
11. 加入500 μl RPE缓冲液洗涤小柱，在≥8,000 × g条件下离心约30秒。弃去穿流液。重复洗涤一次。在≥12,000 × g条件下离心1分钟，进一步干燥膜。
12. 向小柱中加入40 μl无RNase水，在≥8,000 × g条件下离心1分钟，将总RNA洗脱至1.5 ml离心管中。使用适当的分光光度计测定总RNA浓度。

2.2）miRNA cDNA 的制备

1. 配制反转录主混合液。每个样品需要 4 µl 的 5x miScript HiSpec 缓冲液、2 µl 的 10x 核酸混合液和 2 µl 的 miScript 反转录酶混合液。
2. 取 8 µl 主混合液分装至 PCR 管中，加入所需体积的总 RNA（250 ng），再用无 RNase 水补足至终体积 20 µl。
3. 在 37 °C 下孵育 60 分钟。然后在 95 °C 下孵育 5 分钟以灭活 miScript 反转录酶混合液。
4. 向每 20 µl 反转录反应体系中加入 200 μl 无 RNase 水，–20 °C 保存，或立即进行实时 PCR。

2.3）聚焦干细胞与发育通路的miRNA PCR芯片

1. 在15 ml离心管中配制PCR反应体系：加入1375 µl的2x SYBR Green主混合液、100 µl miRNA cDNA样品、275 µl的10x miScript通用引物和1000 µl无RNase的水（总体积为2,750 µl）。
2. 将PCR反应体系转移至PCR加样储液槽中。小心地从密封袋中取出96孔板PCR阵列。
3. 使用8通道移液器或仅装8个吸头的12通道移液器，向PCR阵列的每个孔中加入25 μl PCR反应体系。每次移液后更换吸头，以避免孔间交叉污染。
4. 用光学粘性密封膜封板，并在室温（15–25 °C）下以1,000 × g离心1分钟以去除气泡。从底部目视检查，确保各孔中无气泡存在。
5. 将96孔板PCR阵列放入实时荧光定量PCR仪中。
6. 按照以下程序设置实时荧光定量PCR仪：95 °C预变性10分钟（1个循环），随后进行45个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和60 °C退火延伸1分钟，并在每个循环的退火延伸阶段采集一次荧光数据。 
7. 将所有孔的Ct值导出至空白Excel工作表，以便使用PCR阵列数据分析模板Excel文件及基于网络的分析软件进行后续分析。
   注：相关软件可从以下网址获取：www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php。

3. miRNA靶基因预测的计算分析及通过报告质粒转染与双荧光素酶检测验证靶mRNA。

3.1）miRNA 靶标预测的计算分析

1. 浏览 PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）²¹，这是一个在线可获取的算法，用于鉴定 miRNA 靶标预测的 mRNA。
2. 点击 "点击此处获取脊椎动物的 PicTar 预测结果"。 将打开一个新页面 。
3. 在新页面的 PicTar 网络界面中，从下拉菜单中选择物种，并在 miRNA ID 输入框中输入感兴趣的 miRNA。点击“搜索该 miRNA 的靶标”。
4. 查看按 PicTar 评分排序的靶标 mRNA 列表。
   注意：PicTar 计算一个评分，用于反映特定 UTR 被所选 miRNA 靶向的可能性，该评分基于种子区互补性、热力学参数以及共表达 miRNA 集合中共同靶标的组合预测²²。
5. 类似地，使用 DIANA-LAB（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/）²³ 和 TargetScan（http://www.targetscan.org/）²⁴ 这两种可在线获取的替代算法，获取靶标 mRNA 列表。
6. 根据使用不同软件工具获得的排序结果，编制 miRNA 的比较表格。PicTar 按评分排序，DianaLab 按精确度排序（基于信噪比及用于评估预测结果显著性的精确度评分），TargetScan 按综合 PCT 排序（基于种子区互补性、结合的热力学自由能、在不同物种间的保守性），见 表 1。

3.2）通过报告质粒转染和双荧光素酶检测验证靶 mRNA。

注意：用于验证靶标 mRNA 的 3’ 非翻译区荧光素酶报告系统此前已有描述²⁵。

1. 转染
   1. 以每孔 10⁵ 个细胞的密度将 HeLa 细胞接种于 24 孔板中。
   2. 24 小时后，每孔使用 1.5 µl 转染试剂共转染 HeLa 细胞，同时加入 100 ng 的 NR4A3 3’ UTR 或 SOX5 3’ UTR 质粒，以及 20 nM 的 miRNA 模拟物（针对 SOX5 3’ UTR 使用 hsa-miR-96-5p，针对 NR4A3 3’ UTR 分别使用 hsa-miR-7-5p 和 hsa-miR-17-5p）。
   3. 对照孔共转染 NR4A3 3’ UTR 或 SOX5 3’ UTR 质粒以及荧光标记的阴性对照 siRNA。通过转染荧光标记的阴性对照 siRNA 可评估转染效率，并排除模拟 miRNA 与 3’ UTR 结合的非特异性效应。
2. 双荧光素酶活性检测
   1. 转染后 24 小时测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。移除细胞培养基。
   2. 通过将 50 µl 底物 I 加入 10 ml 溶液 I 中配制工作液 I，充分混匀。每孔 24 孔板加入 300 µl 工作液 I。
   3. 将每个 24 孔中的内容物分别转移至 96 孔白色板中的 3 个孔，每孔 100 µl。静置 10 分钟后，在设定为检测发光信号的光度计上测定萤火虫荧光素酶活性。
   4. 通过将 50 µl 底物 II 加入 10 ml 溶液 II 中配制工作液 II，充分混匀。向已含有 100 µl 工作液 I 的每个 96 孔中加入 100 µl 工作液 II。
   5. 静置 10 分钟后，在设定为检测发光信号的光度计上测定海肾荧光素酶活性。计算萤火虫荧光素酶发光值与海肾荧光素酶发光值的比值。

结果

在图1中展示了人神经干细胞（hNSC）在三维支架（3D）上分化情况的观察与定量结果，并与传统的二维平面培养（2D）进行比较，以轴突突起生长的测量值表示。在图2中展示了利用针对干细胞及发育通路相关miRNA的PCR芯片对miRNA进行定量的研究流程与结果，旨在分析miRNA在2D和3D条件下分化的人神经干细胞（hNSC）与未分化对照组之间的差异表达。在对分化与未分化hNSC进行miRNA比较分析，并结合靶基因预测的生物信息学计算分析后，发现SOX5和NR4A3（NOR1）为潜在的靶mRNA。为研究miRNA与其在3'非翻译区（3'UTR）mRNA上潜在结合位点的直接相互作用，我们使用了两种 commercially available 质粒，分别在萤光素酶报告基因下游插入了SOX5或NR4A3的3′UTR序列，且同一质粒中包含海肾萤光素酶基因用于标准化。3'UTR萤光素酶活性下调的代表性结果见于图3。

图 1：人神经干细胞在三维支架上的分化及轴突突起生长的测量。（A）经标准免疫细胞化学染色标记 β3-微管蛋白（绿色），细胞核用 Hoechst 复染（蓝色），采集代表性显微照片，并借助图像分析软件对轴突突起进行测量。（B）图示在二维和三维条件下分化的人神经干细胞培养 1 周（1W）或 3 周（3W）后轴突突起生长的测量结果。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：分化 hNSCs 中 miRNA 表达谱分析的示意图工作流程。 从 3D 支架上分化的 hNSCs、标准 2D 培养物或未分化的对照组中提取总 RNA（包括 miRNA）。取 250 ng 总 RNA，采用一种可选择性地将成熟 miRNA 高效逆转录为 cDNA 的方法进行逆转录，所得 cDNA 适用于利用人细胞分化与发育相关的 miScript miRNA PCR 芯片进行 miRNA 定量分析。数据分析采用 SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A 和 RNU6-2 的几何均值，基于 2^-ΔΔct 法进行。显著变化定义为在统计学上显著地上调或下调 ±1.5 倍。数据通过网站提供的分析软件进行处理，结果以聚类图（clustergram）形式展示。改编自图 3¹⁹。请点击此处查看此图的高清版本。

图3：利用双荧光素酶报告基因检测验证miRNA靶向预测的mRNA。（A）用于验证3'非翻译区（3'UTR）序列为miRNA直接靶点的双荧光素酶报告基因质粒的代表性示意图。（B）显示转染效率的代表性显微图像。（C） SOX5 和 NR4A3 基因的人源3'UTR报告基因信号（以相对荧光素酶活性表示）在分别存在 hsa-miR-96、hsa-miR-7 和 17 miRNA 模拟物时显著降低。修改自图5¹⁹。请点击此处查看该图的高清版本。

		DIANALAB		PicTar	TargetScan
miRNA	靶基因	发现的靶位点/基因	精确度	评分	综合 PCT
hsa-miR-96	SOX5	1214/763	1	6.74	0.94
hsa-miR-183	DUSP10	302/190	0.72	4.75	0.85
hsa-miR-302a	NR4A3	863/473	0.84	3.05	NF
hsa-miR-182	FOXN3	1358/794	0.94	NF	0.96
hsa-miR-7	NR4A3	NF	NF	1.61	0.17
hsa-miR-7	FOXN3	399/136	0.17	NF	0.88
hsa-miR-20a	NR4A3	1650/841	0.85	5.87	0.63
hsa-miR-20b	NR4A3	1955/973	0.9	5.87	0.63
hsa-miR-17	NR4A3	1928/961	0.9	5.38	0.63+0.37
hsa-miR-20a	EIF4G3	1650/841	0.97	NF	NF
hsa-miR-20b	EIF4G3	1955/973	0.94	NF	NF
hsa-miR-17	EIF4G3	1928/961	0.94	NF	NF

表1：miRNA靶标预测mRNA列表。miRNA、靶基因预测结果及算法分析的代表性表格（分别使用Diana Lab、PicTar和TargetScan提供的预测/评分/综合结果）。修改自表3¹⁹。

讨论

新方法的开发 体外 评估和改进干细胞分化能力的检测方法，对其功能及治疗潜力的研究始终构成挑战。人神经干细胞（hNSCs）的长期稳定附着，是构建稳健三维结构所必需的 体外 分化实验通过测试多种在材料和结构上具有不同特性的3D基质来开展。作为实验方案开发的一部分，我们还评估了最佳细胞接种浓度，并确定了支架需经层粘连蛋白包被的要求。尽管我们的hNSCs在去除4-OHT和生长因子后可自发分化，但与标准2D培养分化的hNSCs相比，采用3D培养系统显著提高了其分化能力，这一点通过轴突突起生长情况得以验证。

为了研究三维诱导分化对人神经干细胞（hNSC）miRNA表达的影响，我们采用PCR芯片技术。与标准芯片微阵列相比，PCR芯片具有对目标miRNA进行直接定量和验证的优势。尽管PCR芯片在每张芯片可检测的miRNA总数方面存在限制（例如本实验中少于96个），但可根据研究需求定制，专门包含特定的miRNA。在本研究中，我们选择了此前在干细胞发育过程中已有报道的miRNA。通过该技术，我们对三维（3D）和二维（2D）分化的hNSC以及未分化的hNSC中通路相关miRNA的表达进行了谱型分析。筛选出表达显著下调的miRNA，并利用在线可用的算法（DIANA Lab、PicTar和TargetScans）分析其潜在靶标mRNA，以评估其功能并进行生物学意义的解读。

单个 miRNA 可识别数百个靶标，因此我们验证了 miRNA 与可能参与轴突调控的 3’ 非翻译区（UTR）mRNA 之间的相互作用。NR4A3 是 hsa-miR-7 和 miR-17 家族的靶基因，属于 NR4A 家族核受体，其根据表达水平的不同，参与海马体轴突导向的分化、存活、凋亡及调控²⁶。同样，hsa-miR-96 的靶基因 SOX5 被报道可调控神经前体细胞的细胞周期进程²⁷、轴突长度²⁸、细胞迁移、迁移后分化以及神经元投射²⁹。通过双荧光素酶报告基因检测，SOX5 和 NR4A3 分别被确认为 hsa-miR-96 以及 hsa-miR-7 和 hsa-miR-17 的直接靶向 mRNA。双荧光素酶（萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶）系统依赖于同一质粒中的两个不同报告基因，相较于单一荧光素酶质粒系统，能够通过归一化校正转染效率不佳和细胞毒性所造成的影响，从而提供更优的检测体系。在本实验方案开发过程中，我们也优化了转染条件，以实现高转染效率。

本文所述方案可用于进一步优化和表征 体外 hNSC 分化可应用于临床前研究及未来临床应用的移植方案中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM:F12	Invitrogen	21331-020	用于RMM培养基的制备
人血白蛋白溶液	Baxter健康护理有限公司	1501052	用于RMM培养基的最终浓度  0.03%
转铁蛋白，人重组	Sigma	T8158	用于RMM培养基的最终浓度  5 µg/ml
腐胺二盐酸盐	Sigma	P5780	用于RMM培养基的最终浓度  16.2 µg/ml
胰岛素，人重组	Sigma	I9278	用于RMM培养基的最终浓度  5 µg/ml
孕酮	Sigma	P6149	用于RMM培养基的最终浓度  60 ng/ml
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-24	用于RMM培养基的最终浓度  2 mM
亚硒酸钠	Sigma	S9133	RMM 培养基，使用终浓度为 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	添加至 RMM 培养基中，终浓度为 10 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-188	添加至RMM培养基中，终浓度为20 ng/ml
4-OHT	Sigma	H7904	添加至 RMM 培养基中，终浓度为 100 nM
层粘连蛋白	AMS生物技术	3400-010-10
TrypZean/EDTA	Lonza	BE02-034E
用于灌溉的水	Baxter Healthcare	UKF7114
定义的胰蛋白酶抑制剂 (DTI)（储存于 -20）°C)	Invitrogen	R007-100
Alvetex 12孔板	Reinnervate Ltd	AVP002
乙醇	默克	1.00986.1000
βIII 微管蛋白抗体	Sigma	T8660
Hoechst	Sigma	B2261
miRNeasy mini试剂盒	Qiagen	217004
无RNase的DNase	Qiagen	79254
氯仿	Sigma	C7559-5VL
miScript II RT试剂盒	Qiagen	218160
SYBR Green PCR试剂盒	Qiagen	218073
细胞发育 &扩增与分化 miScript miRNA PCR 芯片阵列	Qiagen/SABiosciences	MIHS-103Z
Lightcycler 480 白色 96 孔板	罗氏	4729692001
Lightcycler 480  封口膜	罗氏	4729757001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
NR4A3 miRNA 3'非翻译区靶向克隆载体	GeneCopeia	HmiT019538-MT0
载体 SOX5 miRNA 3' UTR 靶向克隆	GeneCopeia	HmiT017632-MT01
Allstars 阴性对照 siRNA AF 488（Qiagen）	Qiagen	1027284	miRNA 转染对照
Luc-Pair miR 荧光素酶检测	GeneCopeia	LPFR-M010
Lightcycler 480	罗氏
GloMax 96 微孔板发光仪	Promega