我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。
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逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
我们报道了一种对径向单层细胞迁移实验的新型改进方法。该方法最初用于测量贴壁肿瘤细胞在细胞外基质蛋白上的径向迁移，现被改造用于测定荧光标记的非贴壁人源或鼠源效应免疫细胞的运动能力。本技术采用不锈钢多联管装置和带有10个孔的聚四氟乙烯（Teflon）载玻片，将非贴壁T细胞定点加入预先铺有融合肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白的孔中。通过明场和/或多通道荧光显微镜，随时间追踪效应细胞的移动与行为。利用荧光染料和/或编码荧光报告基因的病毒载体对不同细胞类型进行差异化标记，以便成像。该方法不同于其他类似类型的 体外 利用载玻片培养室、琼脂或Transwell板检测细胞水平或垂直迁移/侵袭的实验方法。该实验可采集详细的成像数据，并通过特异性荧光标记区分不同类型的细胞；甚至可识别细胞的特定亚群即可监测转导/非转导细胞的迁移情况。通过使用对应于迁移细胞类型的特定荧光通道生成表面强度荧光图，从而更清晰地可视化特定时间点非黏附性免疫细胞的运动情况。该方法还可收集其他效应细胞功能的证据，例如细胞毒性作用或效应细胞向靶细胞转移病毒载体等。因此，该技术可使研究人员在显微镜下记录不同类型的不同荧光标记的非黏附性细胞与黏附性细胞之间的细胞间相互作用。此类信息在评估经生物修饰或激活的免疫细胞类型时尤为重要，特别是在将其用于癌症治疗前，需要获得其与肿瘤靶细胞之间功能活性的直观证据。
引言
径向单层细胞迁移实验最初被开发用于测量贴壁肿瘤细胞的侵袭特性1-4 在涂有细胞外基质（ECM）蛋白的载玻片上5-7 或与单个细胞外基质成分（如纤连蛋白或层粘连蛋白）1,2. 该技术涉及使用不锈钢细胞沉降多通管（CSM）将肿瘤细胞的单细胞悬液接种至孔板中央。细胞沉降后，肿瘤细胞会贴附于孔底，通过测量初始细胞群体直径随时间的变化，计算出水平迁移速率。与采用transwell小室评估细胞迁移的其他现有方法相比，径向单层细胞迁移实验具有更直观的视觉优势 体外 细胞的迁移能力；这些检测方法不适合成像8此外，该方法在选择评估迁移的时间点方面也提供了极大的灵活性，研究人员可在沉降后根据需要选择任意数量的时间点进行成像，不受限制。
由于迁移能力对于非贴壁细胞而言是一项重要功能，尤其在免疫治疗领域或当其被用作病毒载体递送工具时，我们改进了细胞迁移检测法（CSM），以评估非贴壁细胞在肿瘤细胞单层以及细胞外基质（ECM）蛋白上的迁移行为。该检测方法的额外优势在于，可在显微镜下直接观察非贴壁细胞在活体肿瘤细胞单层、来源于肿瘤的复杂ECM，或单一ECM组分上的迁移过程，因而具有较高的灵活性。而仅使用单一细胞外蛋白包被孔板的检测方法，无法准确模拟细胞在体内实际迁移所经历的ECM组织环境或肿瘤微环境。 体内.
在此，我们采用同种异体反应性细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）作为代表性的非贴壁细胞类型，这些细胞通过单向混合淋巴细胞肿瘤细胞反应（MLTR）或混合淋巴细胞反应（MLR）9 对主要组织相容性复合物（MHC）蛋白致敏。我们测试了人源和鼠源的细胞。当在肿瘤单层细胞上测量迁移时，所使用的肿瘤细胞为部分相关靶细胞（表达与效应细胞致敏时所用细胞群中部分相同的MHC蛋白）或完全相关靶细胞（表达效应细胞所致敏的全套MHC分子）。在部分实验中，我们使用荧光染料CellTracker Red CMPTX或细胞增殖染料eFluor 670来区分效应细胞与靶细胞。我们还采用编码荧光蛋白的病毒载体转导作为可视化细胞的另一种方法。在某些检测中，我们将编码Emerald Green（EMD）荧光蛋白的逆转录病毒复制型载体（RRV）转导至alloCTL中10,11；而在其他实验中，将编码mStrawberry的慢病毒载体转导至肿瘤细胞中。
将同种异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）通过多通道装置接种至肿瘤细胞单层或从肿瘤细胞单层收获的细胞外基质（ECM）中心区域。通过明场显微镜和/或荧光显微镜随时间观察贴壁细胞与非贴壁细胞之间的相互作用。低倍镜下观察到的肿瘤细胞单层破坏，或高倍镜下观察到的具有核碎裂的肿瘤细胞，分别提示细胞因裂解和凋亡而受损。我们通过数字成像生成荧光表面强度图，显示非贴壁的荧光标记T细胞在单层培养物上的迁移情况。此外，我们还观察了非贴壁alloCTL在贴壁胶质瘤细胞单层上形成簇状结构后所引发的细胞毒性效应。同时，也观察到RRV-EMD从alloCTL水平转导至胶质瘤单层细胞的现象。
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方案
1. 载玻片制备
- 将细胞沉降微流控芯片载玻片放入灭菌袋中，并用高压灭菌胶带密封。将载玻片的聚四氟乙烯（Teflon）涂层面向灭菌袋的纸面一侧，以避免塑料残留物沉积在孔中。
- 在121 °C下高压灭菌15分钟。
- 在生物安全柜内从灭菌袋中取出载玻片，并置于无菌的150 × 15 mm无菌培养皿中。每个培养皿最多可放置四张载玻片。在载玻片旁放置一个35 × 10 mm的培养皿，并加入2–3 ml无菌H2O以提供湿度。
- 使用足量的聚-D-赖氨酸（100 µg/ml）对载玻片进行预包被，确保完全覆盖整个孔。室温孵育1小时后，吸除溶液，并用移液枪吸取1× PBS反复冲洗孔表面两次。
- 可选：添加纤连蛋白或其他细胞外基质（ECM）组分，以增强肿瘤细胞的黏附性。将纤连蛋白以5 µg/ml的浓度加入足量体积中，确保在室温下短时间内孔内不会干燥。
- 1小时后，吸除剩余溶液，并用1× PBS反复吹打冲洗两次。
- 在准备接种肿瘤细胞前，始终保持孔内有PBS覆盖。载玻片应在同一天内使用。
- 收获所需贴壁肿瘤细胞类型的一瓶融合细胞。使用台盼蓝染色排除法在光学显微镜下计数活细胞，并将细胞重悬于适当缓冲的生长培养基中，浓度为5 × 106 个细胞/ml，例如含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的杜氏必需培养基（DMEM）。
- 若需对贴壁细胞群体进行荧光成像，可根据制造商提供的方案，使用活细胞荧光染料或细胞增殖染料对贴壁细胞群体进行标记。
- 用移液枪将10 μl完全培养基平稳地加入载玻片的每个孔中，注意避免在孔中产生气泡，因为气泡会阻碍肿瘤细胞的均匀黏附。
- 向每个孔中的培养基加入2.5–5.0 × 104 个细胞（5–10 μl细胞悬液）（图1A）。根据肿瘤细胞类型及所需的培养天数调整最佳接种数量。较大的肿瘤细胞或生长较快的细胞初始接种数量可适当减少。通过添加培养基将孔内总体积补至40 μl，并反复吹打以确保细胞均匀分布。
- 所有孔接种完成后，在室温下静置使肿瘤细胞贴壁，然后盖上150 × 15 mm培养皿的盖子，小心地将培养皿转移至37 °C、5% CO2的湿润培养箱中，至少培养24小时。
- 每天更换培养基。小心地用移液枪吸出部分用过的培养基，并补充等量新鲜完全培养基。
注意：由于蒸发作用，补充的体积应略大于吸出的体积。当细胞形成均匀、融合的单层时，即可进行后续检测。通常在初次接种后1–3天达到此状态。 - 如步骤1.4所述，用PBS轻轻冲洗单层细胞一次，若需使用单层细胞则进入步骤2，或进入下文的步骤1.13以从单层细胞中提取ECM蛋白。
- 在完全培养基中配制0.5% Triton-X（v/v）溶液，并向每个孔中加入30 μl。在通风橱中孵育2分钟使单层细胞消化，然后如上所述用移液枪吸取完全培养基冲洗两次。
注意：细胞外基质层可能在光学显微镜下可见（图2）。应立即使用载玻片，或将其保留在完全培养基中，置于湿润的CO2培养箱中1–2天。切勿让孔内干燥。
2. 非贴壁T细胞在载玻片上的沉降
- 如果需要对非贴壁细胞群体进行荧光成像，可在实验开始前至少1小时，根据制造商提供的说明书，使用活细胞荧光染料（如CFSE、Cell Tracker Red CMPTX或eFluor 670）对非贴壁细胞群体进行标记。或者，可通过病毒载体转导使细胞表达荧光蛋白。
- 按照上述1.2中的描述，将细胞沉降歧管放入灭菌袋中进行高压灭菌。
- 从培养箱中取出装有特氟龙涂层载玻片的加湿孵育盒，置于生物安全柜中。
- 用移液器吸取1×PBS上下吹打洗涤孔板，然后加入45 μl含至少10%血清的完全培养基。
- 将多通道管从灭菌袋中取出，并小心地将其滑入各孔中，直至多通道管末端的“钩”接触载玻片底部图1B).
- 确保每个通道中均可见培养基。若未观察到培养基，取下流管，向对应的孔中添加更多培养基，然后重新安装并再次检查。
- 对歧管的每个通道或所需数量的孔重复步骤 2.5。
- 计数非贴壁细胞，并重悬于浓度不低于1.0–2.0 × 105/μl。吸取1 μl细胞，缓慢吹入通道中（图1C对每个需要的孔均进行此操作。
- 将整个装有细胞的装置放置一段时间， 即，将歧管和载玻片置于生物安全柜内 20-30 分钟 让通道中的细胞沉降。
- 通过触碰两端，将多通道移液管架从载玻片上垂直轻柔抬起，以避免扰动接种在孔中心区域的细胞图1D).
- 检查每个孔，确保非贴壁细胞已成功接种于孔中央，并位于多通道装置的环形范围内。理想情况下，非贴壁细胞会轻微黏附于单层细胞或细胞外基质（ECM）以及彼此之间，因此轻柔移动载玻片不会导致细胞团分散。切勿晃动载玻片。
3. 荧光显微镜
- 在确认沉淀后，使用适当的实验设备进行成像。理想情况下，应使用配备有 CO₂2 和湿度培养箱。低倍镜下图像， 即，4倍或10倍，以便对较大区域进行多次成像，从而观察整个孔的全貌。
- 使用图像采集软件获取数字图像。进行明场和/或多通道荧光成像。
- 如需，可设置延时成像，在指定区域的不同通道中记录图像，或保持载玻片湿润并置于37 °C/5% CO₂环境中。2 培养箱中，并在所需时间点手动取出进行成像（图1E & F，建议用于较长时间点。
4. 分析与展示
- 使用图像编辑软件，将明场图像和荧光图像合并到同一图层，以便在同一图像中同时观察多种细胞类型和标记物。将每种颜色的图像文件拖放到程序中，当系统提示时，选择“添加图层”选项，以创建包含多个图层的图像文件。
- 在更高倍镜下，对孔内样本进行数字成像，获取多张图像后进行对齐并拼接。通过观察两张图像之间的保守区域，将其中一张图像叠加到另一张图像上，逐步对齐文件，直至生成完整的图像。
- 在图像采集过程中，使用采集软件添加微米标尺，以测定单个细胞迁移的距离。
- 为确定不同时间点的细胞迁移情况，使用图像软件制作表面荧光强度图， 即，使用 ImageJ 定量分析随时间变化的荧光 T 细胞聚集或扩散情况。
- 为生成表面图，取步骤4.1中生成的分层图像，在“图层”窗口中，除保留与目标通道对应的图层外，取消选中所有其他图层。例如，若需可视化EMD表达的表面图，则仅应显示对应于该标记物所用滤光片的“绿色”图层。
- 展平图像并将其保存为受支持的文件格式例如，.png）并将其载入程序中。为生成表面图，将图像类型更改为8位，根据需要调整亮度/对比度以降低背景，然后选择“分析/表面图”选项。图像中的 图5 通过勾选“阴影”、“绘制轴”、“每行一个多边形”和“平滑”复选框生成。
- 或者，从初始时间（time zero）的焦点细胞沉积处测量半径或直径，并与不同时间点最外侧细胞的位置进行比较。特氟龙（Teflon）孔的直径为6.0 mm。
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结果
除了使用荧光染料外，也可使用编码荧光蛋白的病毒载体。病毒转导应在运动性检测之前提前进行。贴壁和非贴壁细胞类型均可进行差异标记。转导的具体方案取决于所采用的载体类型。本研究中，我们在检测前至少两天，按照文献12所述方案，使用 RRV-EMD 对异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）进行转导（见图3、图5和图6）。此外，我们还使用慢病毒载体 CMV-Strawberry-IRES-FLUC2 对肿瘤细胞进行转导，使其表达 mStrawberry 红色荧光蛋白（见图4）。该转导操作通过将载体加入细胞培养瓶中孵育48小时完成，随后更换新鲜培养基。细胞继续培养两天以恢复生长后，进行有限稀释培养，以获得转导率为100%的细胞群体。
通过混合淋巴细胞肿瘤反应（MLTR），使用灭活的13-06-MG人源恶性胶质瘤细胞作为刺激细胞制备人同种异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）。随后，将alloCTL用编码EMD的RRV（RRV-EMD）进...
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讨论
将单细胞悬液中的肿瘤细胞用移液器接种至聚四氟乙烯掩膜载玻片的孔中。细胞经孵育使其贴壁，并在含5% CO2、37°C的湿化培养箱中形成单层细胞（图1A）。可收获已建立的单层细胞或由该单层细胞衍生的细胞外基质（ECM）蛋白用于后续检测（图1B）。将经活体荧光染料标记或转导了编码EMD载体的效应性T淋巴细胞，使用细胞接种模具（CSM）接种于孔的中央。随后通过明场和荧光显微镜评估并量化非贴壁效应性T淋巴细胞在单层细胞或ECM蛋白上随时间推移的迁移能力。本文中，我们评估了非贴壁效应性同种反应性细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）在部分相关靶细胞U-87MG胶质瘤细胞单层上的迁移及细胞毒性作用（图3和图5）。这些靶细胞仅表达原始刺激细胞所具有的部分人类白细胞抗原（HLA）分子（HLA-A2、B44），旨在降低alloCTL对完全匹配的13-06-MG靶细胞（HLA-A1,2和B44,57）所表现出的强烈裂解活性。我们还观察了alloCTL在从MDA-MB-231BR乳腺肿瘤细胞单层收获的ECM...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 CA121258、R01 CA125244、R01 CA154256、NIH/NCATS UCLA临床与转化科学研究所资助编号UL1TR000124、美国陆军医学研究与材料司令部（USAMRMC）W81XWH-08-1-0734以及Joan S. Holmes纪念研究基金资助。MJH和GCO获得了加州大学洛杉矶分校（UCLA）Joan S. Holmes纪念博士后奖学金的支持。CSM设备由Creative Scientific Methods公司提供：www.creative-sci.com。慢病毒载体来自UCLA载体核心实验室，该实验室由CURE/P30 DK041301项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 特氟龙掩膜载玻片 | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| 细胞沉降装置 | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| 培养皿，150 mm | Corning | 430597 | |
| 培养皿，35 mm | Corning | 430588 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl 移液器 | Gilson | F123600 | |
| 200 μl 移液器 | Gilson | F123601 | |
| 200 μl 移液枪头 | VWR | 89003-060 | |
| 去离子蒸馏水（无菌） | Mediatech | 25-055 | |
| 胰蛋白酶 | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express（可选） | Gibco | 12604 | |
| 肿瘤细胞培养基（例如 DMEM） | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V 无血清培养基 | Invitrogen | 12055-083 | |
| 胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 倒置显微镜 | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| 多聚-D-赖氨酸 | Millipore | A-003-E | |
| 纤连蛋白 | BD | 354008 | |
| 31/2 × 51/4 高压灭菌袋 | Crosstex | SCXS2 | |
| 台盼蓝 | Mediatech | 25-900-CI | |
| 细胞增殖 eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
参考文献
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