径向移动性和逆转录病毒复制的载体转导，非粘附Alloresponsive T细胞的杀伤功能

Summary

我们描述了一种使用细胞沉降歧管/载玻片装置在体外监测非贴壁免疫细胞径向移动的方案。在肿瘤细胞的单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过光学和荧光显微镜检查可以观察细胞迁移率和细胞毒性功能。

Abstract

我们报告的径向单层细胞迁移测定法的一个新颖的适应，首次报道以测量粘附的肿瘤细胞的细胞外基质蛋白的径向迁移，用于测量荧光标记，非粘附人或鼠效应免疫细胞的运动性。这种技术采用一个不锈钢歧管和10以及特氟隆滑动灶性沉积非贴壁的T细胞变成制备与任一汇合的肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白的孔中。光和/或多信道荧光显微镜被用于随时间跟踪效应细胞的移动和行为。荧光染料和/或荧光的转基因编码用于差异标记的细胞类型进行成像的病毒载体。这种方法是从类似型的体外测定该跟踪水平或垂直的迁移/侵袭利用滑动室，琼脂或Transwell小板明显。该法允许详细的影像数据，以BË与特定的荧光标记区分不同类型的细胞收集;即使特定的细胞亚群（ 即 ，转导/ nontransduced）可以被监控。使用对应于所述转移的小区类型特定的荧光通道中产生的表面强度的荧光曲线。这允许在特定时间更好的可视化的非粘附免疫细胞迁移的。因此能够收集的其他效应细胞的功能，如细胞毒性或从效应器病毒载体的转移证据到靶细胞，以及。因此，该方法允许研究人员用显微镜记录差异标记的，非粘附的细胞 - 细胞间的相互作用与各种类型的贴壁细胞。这样的信息可以是在生物-操纵或激活免疫细胞类型，其中的功能性的视觉证据期望与肿瘤靶细胞将其用于癌症治疗前的评估特别相关。

Introduction

径向单层细胞迁移测定法最初开发到载玻片上涂覆有细胞外基质（ECM）蛋白^5-7或具有单个ECM组分，如纤连蛋白或层粘连蛋白^1,2-测量粘附的肿瘤细胞^1-4的浸润特性。该技术涉及接种肿瘤细胞的单细胞悬浮液在使用不锈钢细胞沉降支管（CSM）的孔的中心。沉淀后，将肿瘤细胞将附着在井和在初始细胞群随时间的直径的改变的底物用于建立横向运动的速率。径向单层细胞迁移测定法提供了一种视觉优势所采用的transwell板，以测定细胞的体外迁徙功能等现有的方法;这些测定法是非利于成像^8。同时，它也是在选择时间点所提供的自由量很大■当迁移评估，对时间点的数量没有限制的研究员能沉淀后，选择图像。

因为迁移的能力是对非贴壁细胞的一个重要的功能，特别是在免疫治疗或者它们可以用作递送载体为病毒载体领域，我们适于使用CSM来评价非粘附细胞的迁移类型对肿瘤细胞单层，除了ECM蛋白。的显微镜可视化上存活的肿瘤细胞单层非粘附细胞的迁移，在复杂的ECM从肿瘤，或单个ECM组分分离的额外的好处，使该测定的通用性。雇用孔涂有单一胞外蛋白分析不准确地反映ECM组织基质或肿瘤的细胞将通过迁移体内 。

这里，我们使用同种异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL），敏感地认识到主要histocomp使用单向混合淋巴细胞肿瘤细胞反应（MLTR）或混合淋巴细胞反应^{（MLR）9，}作为我们的代表性非粘附细胞类型atibility复合体（MHC）蛋白。我们测试了人和鼠源的细胞。当迁移测定肿瘤单层，采用的肿瘤细胞或者部分相关指标，显示一些对用于敏感的效应，还是完全相关的目标，拥有全套MHC分子的细胞群发现了同样的MHC蛋白质的效应已被致敏对。在一些实验中，我们使用了荧光CellTracker红色CMPTX或细胞增殖染料eFluor 670效应细胞和靶细胞之间进行区分。我们还使用转用病毒载体编码荧光蛋白作为可视化细胞的另一种方式。对于某些分析，我们转了alloCTL与逆转录病毒的复制载体（RRV）编码翡翠绿（EMD）荧光蛋白^10,11;对于超视距器，肿瘤细胞被转导的慢病毒载体编码mStrawberry。

所述alloCTL被通过歧管的一个通道进入任一肿瘤细胞单层或ECM从肿瘤细胞单层收获的中心接种。粘附和非粘附细胞相互作用显现由光和/或通过在一段时间的荧光显微镜。中断在肿瘤细胞单层在低功率，或肿瘤细胞具有片段化的细胞核在高功率是细胞损伤的由裂解和细胞凋亡的指标，分别。我们创建数字表面强度荧光地图显示非粘附荧光T细胞在单层培养的迁移。我们还注意到毒性集群的形成叠加的非贴壁alloCTL之后主义及其对贴壁胶质瘤细胞单层。同时，观察RRV-EMD从alloCTL到胶质瘤单层水平传导。

Protocol

1.将准备

1. 将细胞沉淀歧管滑入杀菌袋和密封用高压灭菌胶带。面对滑板袋的纸侧，以避免在井中塑料沉积物的特氟隆涂层的一面。
2. 高压釜袋15分钟，在121℃。
3. 在无菌的150×15毫米的无菌培养皿中取出的幻灯片从生物安全柜和地点内杀菌袋。多达四个幻灯片每盘可以容纳。广场旁边的幻灯片35×10毫米的培养皿。加入2-3毫升无菌H ₂澳提供加湿。
4. 预涂载玻片用聚-D-赖氨酸，在100微克/毫升用足够体积，以覆盖整个井。 1小时，在室温之后，吸出溶液，并通过移液的1×PBS在孔的表面冲洗井两次的表面上。
5. （可选）添加纤维连接蛋白或其他ECM组件，以确保更强的肿瘤细胞的粘附。添加纤维连接蛋白在5微克/毫升足够量塔吨的井不会时间在RT在短时间内干燥。
   1. 1小时后，吸剩的解决方案，并通过上下吹打与1X PBS洗两次澡。
6. 保持PBS的井，直到肿瘤准备电镀。使用滑动的同一天。
7. 收获的所需粘附的肿瘤细胞类型的汇合烧瓶中。在适当缓冲的生长培养基，例如计数通过光学显微镜和重悬使用台盼蓝染料排斥的活细胞以5×10 ⁶个细胞/ ml，Dulbecco氏最小基本培养基（DMEM）中，用10％胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。
8. 如果粘附细胞群的荧光成像是期望的，以一个重要的荧光染料或细胞增殖的染料由以下由制造商提供的协议标签的粘附细胞群。
9. 顺利吸取10微升完全培养基到滑动照顾的每个孔中，以避免在WEL产生气泡LS，因为这些可以预防均匀肿瘤细胞的粘附。
10. 添加2.5-5.0×10 ⁴细胞（5-10微升的细胞悬浮液），以在各孔中（ 图1A）的介质。调整取决于肿瘤细胞类型和生长的天所需的数目的最佳数目。较大的肿瘤细胞或快速成长的细胞可能需要较少的细胞开始。通过加入培养基和吸管上下，以确保均匀分布的细胞带来良好体积多达40微升。
11. 毕竟井种子，使肿瘤细胞附着在RT，然后将盖体上的150×15毫米培养皿中并小心地将皿在37℃/ 5％CO ₂的加湿培养箱中在至少24小时。
12. 每日更换培养基。小心吸取从单层废介质的一部分，并替换为新鲜的完全培养基。
    注意：由于蒸发，更容积将需要比取出要添加。井将准备测定时为偶数，confluent层细胞的存在。这通常是初始播种后1-3天。
13. 如步骤1.4中所述并继续到步骤2，如果单层需要的话，或以下面的步骤1.13从单层提取ECM蛋白用PBS洗单层轻轻一次。
14. 使0.5％的Triton-X（V / V）在完全培养基中的溶液，并添加30微升至每个孔中。让在引擎盖单层消化2分钟，然后用完全培养基通过移液如上所述洗涤两次。
    注：细胞外基质层可以是通过光学显微镜（ 图2）可见。使用幻灯片马上，或保持在完全培养基中的加湿的CO ₂培养箱中培养1-2天。不要让水井干涸。

2.沉淀非附着性T细胞上的滑动

1. 如果所述非粘附细胞群的荧光成像是期望的，标记的非粘附细胞群与重要的荧光染料，如CFSE，细胞追踪红CMPTX或eFluor670按照预先测定的由制造商提供的至少1小时的协议。替代地，操纵细胞以表达由病毒载体编码的荧光蛋白质。
2. 如上面1.2中描述的高压釜的细胞沉淀歧管在高压釜中袋。
3. 删除包含从孵化器和地方生物安全柜Teflon涂层幻灯片加湿室。
4. 移液器向上洗井用1×PBS和向下，然后加入45微升完全培养基中含有至少10％的血清。
5. 从消毒信封移除歧管，小心地将在过孔中，直到“钩”在歧管的端部接触的滑动（ 图1B）的底部。
6. 确保该培养基是在每一个信道的可见。如果没有看到，起飞歧管，并添加更多的媒体到对应得很好，然后更换并再次检查。
7. 每个陈重复步骤2.5歧管的NEL，或尽可能多的水井所需。
8. 计数非粘附细胞，并重新悬浮于不低于1.0-2.0×10 ⁵个/微升。制定1微升的细胞并缓慢吸取他们进入通道（ 图1C）。做到这一点的每口井所需。
9. 离开，整个电池装载装置中， 即 ，歧管和滑动，生物罩内20-30分钟以使细胞在通道沉降。
10. 通过触摸两端并轻轻提起它垂直向上从滑动，以便不打扰灶性接种于孔中（ 图1D）的中心的细胞移除歧管。
11. 检查各孔，以确保非粘附细胞已经成​​功地接种在井停留在歧管通道的圆周内的中心。非粘附细胞将理想地稍微粘附在单层或ECM和对方，因此轻轻移动滑动周围不会导致细胞PELLE吨驱散。不要挤的幻灯片。

3.荧光显微镜

1. 通过适当的实验设备，进行拍摄沉淀被确认之后。理想情况下，使用配有CO ₂的湿度室中的显微镜。要采取更大的面积的图像在低功率， 即 ，4X或10X，以允许多个图像，使得井的整体可以看出来。
2. 获得使用图像捕捉软件的数字图像。执行明和/或多通道荧光成像。
3. 如果需要的话，设置了一个时间推移在给定区域，以记录不同频道的图像，或保持在滑动加湿，并在37℃/ 5％CO ₂培养箱并手动取出到图像在所需的时间点（ 图1E＆F，建议在较长的时间点）。

4.分析和显示

1. 使用图像编辑软件，合并轻，FLuorescent图​​像转化成1层，使多种细胞类型和标记物可以看出，在相同的图像。拖放图像文件为每个单独的颜色到程序中，出现提示时，选择“添加图层”选项来创建具有多个图层的图像文件。
   1. 在更高的放大倍率，拿，对齐和缝合跨越以及图像组合在一起数字。通过观察两个图像之间的保守的区域，并覆盖在另一个的顶部的一个图像，直到产生一个完整的画面对准的文件。
2. 使用采集软件来确定距离单个细胞迁移收购过程中添加微米酒吧的图像。
3. 以确定在不同时间的细胞的迁移，使表面强度荧光地图与图像软件， 即 ImageJ的，量化荧光T细胞聚集或分布在时间。
   1. 要生成表面图，采取步骤4.1和图层窗口下产生分层图像，取消除对应​​所需的通道之外的所有图层。例如，如果一个面积希望可视EMD表达，只有“绿色”对应于用于该标记的过滤层应该是可见的。
   2. 拼合图像并将其保存在识别的文件格式（ 例如 ，.png格式），并加载图像到程序中。要生成曲面图，改变图像类型为8位，根据需要减少背景更改亮度/对比度，并选择“分析/曲面图”选项。通过检查“阴影”，“绘制轴”，“一个多边形每行'和'平滑”复选框中生成图5中的图像。
   3. 可替代地，采取利用从焦点细胞存半径或直径的测量，在时间零，并比较所述的细胞在最外点在不同的时间。特氟隆孔的直径为6.0毫米。

Results

对于荧光蛋白编码病毒载体可以除了，或代替，荧光染料可以使用。病毒转导应提前运动检测来进行。既粘附和非粘附的细胞类型可以是差异标记。的协议转导将取决于载体的使用的类型。在这里，我们转导在图3，图5和图6与RRV-EMD至少两天的alloCTL提前使用协议测定的描述^12。我们还使用的慢病毒载体，CMV-草莓-IRES-FLUC2，转导的肿瘤细胞以表达mStrawberry红色荧光蛋白（ 图4）。这种转导通过加入载体，以细胞的烧瓶48小时，在这一点上，加入新鲜培养基来实现。使细胞恢复两天，有限稀释后进行，以产生100％的转导的细胞群。

13-06-MG（图3和5）。荧光显微镜显示单元，最初接种井的中...

Discussion

肿瘤细胞中的单个细胞悬浮液移液到特氟隆掩模滑动的孔中。使细胞附着，然后在湿润的5％CO _2，37℃培养箱（ 图1A），形成单分子膜。从单层衍生既定单层或ECM蛋白可收获这些测定（ 图1B）。标记有重要的荧光染料或转导的载体编码的EMD效应T淋巴细胞接种到使用CSM阱的中央。然后非粘附效应T淋巴细胞的迁移上的单层或ECM蛋白随时间的能力进行了评估和量化的光及荧光显微镜。这里，我们评估非粘附效应alloCTL的迁移和细胞毒性上的部分相关的目标的U-87MG胶质瘤细胞单层（ 图3和5）。这些靶细胞，只显示某些人类白细胞抗原（HLA）分子（HLA-A2，B44）上的原始刺激发现，被用来减少将由alloCTL到相关13-06-MG的靶细胞（HLA-A1,2和B44被显示在有效的溶解活性，57）。我们还观察到alloCTL上的ECM从MDA-MB-231BR乳腺肿瘤细胞的单层（ 图6）收获的流动性。该alloCTL通过单向MLTR根据以前出版的⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
特氟龙遮罩显微镜载玻片	创新科学方法	CSM002
细胞沉降歧管	创新科学方法	CSM001
培养皿，150mm	康宁	430597
培养皿，35mm	康宁	430588
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Mediatech	21-040
20 &亩;l Pipetman	Gilson	F123600
200 μl Pipetman	Gilson	F123601
200 μl 移液器吸头	VWR	89003-060
蒸馏去离子水（无菌）	Mediatech	25-055
胰蛋白酶	Mediatech	25-054-CL
Celltracker 红色 CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express（可选）	Gibco	12604
肿瘤细胞培养基（例如 DMEM）	Mediatech	10-013
AIM-V 无血清培养基	Invitrogen	12055-083
胎牛血清	Omega Scientific	FB-02
倒置显微镜
SPOT 高级	诊断仪器
Poly-D-赖氨酸	Millipore	A-003-E
纤连蛋白	BD	354008
31/2 x 51/4 高压灭菌袋	Crosstex	SCXS2
台盼蓝	Mediatech	25-900-CI
细胞增殖 eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH