逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

摘要

我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。

摘要

我们报道了一种对径向单层细胞迁移实验的新型改进方法。该方法最初用于测量贴壁肿瘤细胞在细胞外基质蛋白上的径向迁移，现被改造用于测定荧光标记的非贴壁人源或鼠源效应免疫细胞的运动能力。本技术采用不锈钢多联管装置和带有10个孔的聚四氟乙烯（Teflon）载玻片，将非贴壁T细胞定点加入预先铺有融合肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白的孔中。通过明场和/或多通道荧光显微镜，随时间追踪效应细胞的移动与行为。利用荧光染料和/或编码荧光报告基因的病毒载体对不同细胞类型进行差异化标记，以便成像。该方法不同于其他类似类型的 体外 利用载玻片培养室、琼脂或Transwell板检测细胞水平或垂直迁移/侵袭的实验方法。该实验可采集详细的成像数据，并通过特异性荧光标记区分不同类型的细胞；甚至可识别细胞的特定亚群即可监测转导/非转导细胞的迁移情况。通过使用对应于迁移细胞类型的特定荧光通道生成表面强度荧光图，从而更清晰地可视化特定时间点非黏附性免疫细胞的运动情况。该方法还可收集其他效应细胞功能的证据，例如细胞毒性作用或效应细胞向靶细胞转移病毒载体等。因此，该技术可使研究人员在显微镜下记录不同类型的不同荧光标记的非黏附性细胞与黏附性细胞之间的细胞间相互作用。此类信息在评估经生物修饰或激活的免疫细胞类型时尤为重要，特别是在将其用于癌症治疗前，需要获得其与肿瘤靶细胞之间功能活性的直观证据。

引言

径向单层细胞迁移实验最初被开发用于测量贴壁肿瘤细胞的侵袭特性^1-4 在涂有细胞外基质（ECM）蛋白的载玻片上^5-7 或与单个细胞外基质成分（如纤连蛋白或层粘连蛋白）^1,2. 该技术涉及使用不锈钢细胞沉降多通管（CSM）将肿瘤细胞的单细胞悬液接种至孔板中央。细胞沉降后，肿瘤细胞会贴附于孔底，通过测量初始细胞群体直径随时间的变化，计算出水平迁移速率。与采用transwell小室评估细胞迁移的其他现有方法相比，径向单层细胞迁移实验具有更直观的视觉优势 体外 细胞的迁移能力；这些检测方法不适合成像⁸此外，该方法在选择评估迁移的时间点方面也提供了极大的灵活性，研究人员可在沉降后根据需要选择任意数量的时间点进行成像，不受限制。

由于迁移能力对于非贴壁细胞而言是一项重要功能，尤其在免疫治疗领域或当其被用作病毒载体递送工具时，我们改进了细胞迁移检测法（CSM），以评估非贴壁细胞在肿瘤细胞单层以及细胞外基质（ECM）蛋白上的迁移行为。该检测方法的额外优势在于，可在显微镜下直接观察非贴壁细胞在活体肿瘤细胞单层、来源于肿瘤的复杂ECM，或单一ECM组分上的迁移过程，因而具有较高的灵活性。而仅使用单一细胞外蛋白包被孔板的检测方法，无法准确模拟细胞在体内实际迁移所经历的ECM组织环境或肿瘤微环境。 体内.

在此，我们采用同种....

方案

1. 载玻片制备

1. 将细胞沉降微流控芯片载玻片放入灭菌袋中，并用高压灭菌胶带密封。将载玻片的聚四氟乙烯（Teflon）涂层面向灭菌袋的纸面一侧，以避免塑料残留物沉积在孔中。
2. 在121 °C下高压灭菌15分钟。
3. 在生物安全柜内从灭菌袋中取出载玻片，并置于无菌的150 × 15 mm无菌培养皿中。每个培养皿最多可放置四张载玻片。在载玻片旁放置一个35 × 10 mm的培养皿，并加入2–3 ml无菌H₂O以提供湿度。
4. 使用足量的聚-D-赖氨酸（100 µg/ml）对载玻片进行预包被，确保完全覆盖整个孔。室温孵育1小时后，吸除溶液，并用移液枪吸取1× PBS反复冲洗孔表面两次。
5. 可选：添加纤连蛋白或其他细胞外基质（ECM）组分，以增强肿瘤细胞的黏附性。将纤连蛋白以5 µg/ml的浓度加入足量体积中，确保在室温下短时间内孔内不会干燥。
   1. 1小时后，吸除剩余溶液，并用1× PBS反复吹打冲洗两次。
6. 在准备接种肿瘤细胞前，始终保持孔内有PBS覆盖。载玻片应在同一天内使用。
7. 收获所需贴壁肿瘤细胞类型的一瓶融合细胞。使用台盼蓝染色排除法在光学显微镜下计数活细胞，并将细胞重悬于适当缓冲的生长培养基中，浓度为5 × 10⁶ 个细胞/ml，例如含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的杜氏必需培养基（DMEM）。....

结果

除了使用荧光染料外，也可使用编码荧光蛋白的病毒载体。病毒转导应在运动性检测之前提前进行。贴壁和非贴壁细胞类型均可进行差异标记。转导的具体方案取决于所采用的载体类型。本研究中，我们在检测前至少两天，按照文献¹²所述方案，使用 RRV-EMD 对异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）进行转导（见图3、图5和图6）。此外，我们还使用慢病毒载体 CMV-Strawberry-IRES-FLUC2 对肿瘤细胞进行转导，使其表达 mStrawberry 红色荧光蛋白（见图4）。该转导操作通过将载体加入细胞培养瓶中孵育48小时完成，随后更换新鲜培养基。细胞继续培养两天以恢复生长后，进行有限稀释培养，以获得转导率为100%的细胞群体。

通过混合淋巴细胞肿瘤反应（MLTR），使用灭活的13-06-MG人源恶性胶质瘤细胞作为刺激细胞制备人同种异体细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）。随后，将alloCTL用编码EMD的RRV（RRV-EMD）进.......

讨论

将单细胞悬液中的肿瘤细胞用移液器接种至聚四氟乙烯掩膜载玻片的孔中。细胞经孵育使其贴壁，并在含5% CO₂、37°C的湿化培养箱中形成单层细胞（图1A）。可收获已建立的单层细胞或由该单层细胞衍生的细胞外基质（ECM）蛋白用于后续检测（图1B）。将经活体荧光染料标记或转导了编码EMD载体的效应性T淋巴细胞，使用细胞接种模具（CSM）接种于孔的中央。随后通过明场和荧光显微镜评估并量化非贴壁效应性T淋巴细胞在单层细胞或ECM蛋白上随时间推移的迁移能力。本文中，我们评估了非贴壁效应性同种反应性细胞毒性T淋巴细胞（alloCTL）在部分相关靶细胞U-87MG胶质瘤细胞单层上的迁移及细胞毒性作用（图3和图5）。这些靶细胞仅表达原始刺激细胞所具有的部分人类白细胞抗原（HLA）分子（HLA-A2、B44），旨在降低alloCTL对完全匹配的13-06-MG靶细胞（HLA-A1,2和B44,57）所表现出的强烈裂解活性。我们还观察了alloCTL在从MDA-MB-231BR乳腺肿瘤细胞单层收获的ECM.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特氟龙掩膜载玻片	Creative Scientific Methods	CSM002
细胞沉降装置	Creative Scientific Methods	CSM001
培养皿，150 mm	Corning	430597
培养皿，35 mm	Corning	430588
磷酸盐缓冲液（PBS）	Mediatech	21-040
20 μl 移液器	Gilson	F123600
200 μl 移液器	Gilson	F123601
200 μl 移液枪头	VWR	89003-060
去离子蒸馏水（无菌）	Mediatech	25-055
胰蛋白酶	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express（可选）	Gibco	12604
肿瘤细胞培养基（例如 DMEM）	Mediatech	10-013
AIM-V 无血清培养基	Invitrogen	12055-083
胎牛血清	Omega Scientific	FB-02
倒置显微镜
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
多聚-D-赖氨酸	Millipore	A-003-E
纤连蛋白	BD	354008
31/2 × 51/4 高压灭菌袋	Crosstex	SCXS2
台盼蓝	Mediatech	25-900-CI
细胞增殖 eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH