使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

摘要

我们将演示如何从小鼠眼球制备视网膜切片，并记录视网膜神经元的光反应。整个操作均在暗适应条件下进行。

摘要

视网膜是视觉系统的信息入口。为了理解视觉信号处理机制，我们研究视网膜神经网络的功能。视网膜神经网络中的神经元包含多种亚型。形态学研究已鉴定出超过10种双极细胞、神经节细胞和无长突细胞亚型。多种视网膜神经元亚型被认为可编码视觉信号的不同特征，例如运动和颜色，并形成多条神经通路。然而，每种神经元在视觉信号处理中的具体功能尚未完全阐明。膜片钳技术有助于解答这一基本科学问题。本文提供了一种在暗适应条件下，通过膜片钳记录小鼠视网膜神经元光诱发突触反应的实验方案。小鼠眼睛经整夜暗适应后，在暗室中使用红外照明和红外观察设备进行视网膜切片制备。红外光不会激活小鼠的光感受器，因而可保持其对光的响应能力。采用膜片钳技术记录视网膜神经元的光诱发反应。在记录过程中注入荧光染料，以鉴定神经元的形态学亚型。该方法使我们能够确定小鼠视网膜中各类神经元的生理功能。

引言

视网膜是神经系统中一个独特的部分。作为大脑中可及的一部分，其突触结构已被充分表征。此外，该神经网络的功能可以通过一种生理刺激——光——进行检测。如果在暗室中采用适当的方法分离视网膜组织，组织中的神经元将对光产生反应。这种制备方法已被用于研究视觉信号处理，阐明多种突触机制和神经网络功能，以及疾病的发生机制。

数十年来，研究人员一直记录视网膜神经元对光的反应。早期研究采用尖锐电极对泥狗（mudpuppy）视网膜神经元进行细胞内记录¹。20世纪80年代，膜片钳技术被发明²，并很快成为视觉研究领域广泛使用的方法^3,4。对包括泥狗和鱼类在内的低等脊椎动物视网膜神经元进行单细胞记录，是当时流行的技术手段，为阐明视觉信号处理机制作出了重要贡献^5,6。

在基因突变技术发展之后，小鼠视网膜成为视觉研究领域更受欢迎的模型^7-9。相比低等脊椎动物，哺乳动物的视网膜更具吸引力，因其在进化上更接近人类视网膜，并且可以利用疾病模型进行研究。然而，小鼠视网膜细胞体积小且脆弱¹⁰，在暗室中制备视网膜样本并进行膜片钳记录具有较大挑战性。随着技术的进步，现已发展出多种研究视觉信号机制的方法，例如成像研究¹¹和视网膜电图（ERG）¹²。尽管如此，膜片钳技术的单细胞记录仍然至关重要，因为....

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 实验溶液的配制

1. 在正式实验前1天至1周内配制解剖液。由于HEPES缓冲液在较低温度下具有较强的缓冲能力，因此用于视网膜解剖¹⁶。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：115 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl₂、1.0 MgCl₂、10 HEPES、28 葡萄糖。用NaOH调节pH至7.4。溶液可置于冰箱中保存最多1周。
2. 记录液为Ames培养基，这是一种专为视网膜制备设计的人工脑脊液（aCSF）¹⁷。在实验当天，称取Ames粉末（500 ml溶液需4.4 g）于离心管中。同时称取NaHCO₃（500 ml溶液需0.95 g），并与Ames粉末混合。
3. 在实验当天配制用于膜片钳记录的细胞内电极液。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：111 K-葡萄糖酸盐、1.0 CaCl₂、10 HEPES、1.1 EGTA、10 NaCl、1.0 MgCl₂、5 ATP-Mg 和 1.0 GTP-Na。用KOH调节pH至7.2。使用常规注射器滤器过滤电极液。分装成约500 µl每份，储存于冷冻或超低温冰箱中。

结果

典型的切片制备如图1所示。切片处于平直位置，感光细胞至神经节细胞在平面上清晰可见，且未从滤纸上脱落。若切片倾斜，则仅部分样本处于焦平面内，难以识别适合进行膜片钳记录的细胞。在记录过程中，应选择形态良好的胞体，其通常具有光亮的表面、均匀的圆形轮廓，且无可见的暗斑。建立全细胞记录模式后，切片先暴露于背景光，随后接受阶跃光刺激（图2）。阶跃光刺激可诱发光诱发出兴奋性突触后电位（L-EPSPs）（刺激时序以黄色表示）。其峰值幅度和衰减时间因细胞类型及亚型而异。神经节细胞在强光刺激下可产生动作电位（图2 D&E）。生理记录完成后，通过磺酰罗丹明染色揭示细胞类型及其形态学亚型（图2，右侧）。

讨论

只有通过良好的视网膜制备和精心设计的膜片钳装置，才能获得高质量的记录。尽管上述所有步骤都很重要，但本讨论重点强调了在解剖和记录过程中一些关键的步骤。

解剖过程中，有两个因素尤为重要：冷却和供氧。摘除眼球后，应迅速在含有充氧且已冷却的解剖液的解剖皿中去除眼球前部结构，并将冷的解剖液注入眼杯中。当视网膜组织置于解剖皿中时，应每隔10分钟向组织上添加冷的解剖液。在解剖过程中，应快速进行组织切片，避免牵拉或戳刺视网膜组织，以免对其结构造成损伤。使用优质的解剖工具（锋利的镊子和剪刀）也至关重要。切割器与振动切片机同样有效，因其操作迅速。应使用超细镊子尽可能高效地清除玻璃体物质，因为残留的玻璃体会在切片过程中破坏视网膜结构。

初学者在移除晶状体时容易损伤视网膜。视网膜可能从眼杯上脱落，甚至可能随晶状体被意外一并移除。为避免此问题，可在靠近眼外肌附着点的锯齿缘周围剪开巩膜。具有较大开口的眼杯更便于晶状体的移除。此外，在移除眼前部结构时，避免对眼球施加形变也十分重要。另一个关键步骤是将视网膜切片固定在盖玻片上。可通过练习在不扭曲滤纸的情况下旋.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠（28-60天龄，雄性）	Jackson laboratory	C57BL/6J品系
Ames培养基粉末	Sigma	A1420	极佳
体视显微镜	Nikon	SMZ745	极佳
解剖工具：镊子	Dumont	#4, #5, #55	极佳
解剖工具：剪刀	Roboz	RS-5605	极佳
解剖工具：手术刀	Surgistar	7514	极佳
剃须刀片（用于切片机）	EMS	71970	极佳
切片机	自制
红外成像仪	Night Owl Optics	NOBG1	成像明亮清晰，但聚焦微小物体存在困难。
拉管仪	Sutter	P-1000	性能优异，可制备一致性良好的玻璃微电极。
暗箱	Pelican	dark box	极佳
膜片钳系统	Scientifica	slice scope 2000	系统配置优秀，大多数关键组件均集成于同一套件中。显微操作器性能出色。
放大器	Molecular Devices	multiclamp 700B	性能优异，操作简便。
数据采集软件	Molecular Devices	pClamp软件	性能优异，操作简便。
光源（LED）	Cool LED	pE-2 4通道系统	极佳
CCD相机	Q-imaging	Retiga 2000	极佳
法拉第笼	自制