使用膜片钳技术在暗适应小鼠视网膜切片制备中记录神经元的光诱发突触后反应

摘要

我们将演示如何从小鼠眼球制备视网膜切片，并记录视网膜神经元的光反应。整个操作均在暗适应条件下进行。

摘要

视网膜是视觉系统的信息入口。为了理解视觉信号处理机制，我们研究视网膜神经网络的功能。视网膜神经网络中的神经元包含多种亚型。形态学研究已鉴定出超过10种双极细胞、神经节细胞和无长突细胞亚型。多种视网膜神经元亚型被认为可编码视觉信号的不同特征，例如运动和颜色，并形成多条神经通路。然而，每种神经元在视觉信号处理中的具体功能尚未完全阐明。膜片钳技术有助于解答这一基本科学问题。本文提供了一种在暗适应条件下，通过膜片钳记录小鼠视网膜神经元光诱发突触反应的实验方案。小鼠眼睛经整夜暗适应后，在暗室中使用红外照明和红外观察设备进行视网膜切片制备。红外光不会激活小鼠的光感受器，因而可保持其对光的响应能力。采用膜片钳技术记录视网膜神经元的光诱发反应。在记录过程中注入荧光染料，以鉴定神经元的形态学亚型。该方法使我们能够确定小鼠视网膜中各类神经元的生理功能。

引言

视网膜是神经系统中一个独特的部分。作为大脑中可及的一部分，其突触结构已被充分表征。此外，该神经网络的功能可以通过一种生理刺激——光——进行检测。如果在暗室中采用适当的方法分离视网膜组织，组织中的神经元将对光产生反应。这种制备方法已被用于研究视觉信号处理，阐明多种突触机制和神经网络功能，以及疾病的发生机制。

数十年来，研究人员一直记录视网膜神经元对光的反应。早期研究采用尖锐电极对泥狗（mudpuppy）视网膜神经元进行细胞内记录¹。20世纪80年代，膜片钳技术被发明²，并很快成为视觉研究领域广泛使用的方法^3,4。对包括泥狗和鱼类在内的低等脊椎动物视网膜神经元进行单细胞记录，是当时流行的技术手段，为阐明视觉信号处理机制作出了重要贡献^5,6。

在基因突变技术发展之后，小鼠视网膜成为视觉研究领域更受欢迎的模型^7-9。相比低等脊椎动物，哺乳动物的视网膜更具吸引力，因其在进化上更接近人类视网膜，并且可以利用疾病模型进行研究。然而，小鼠视网膜细胞体积小且脆弱¹⁰，在暗室中制备视网膜样本并进行膜片钳记录具有较大挑战性。随着技术的进步，现已发展出多种研究视觉信号机制的方法，例如成像研究¹¹和视网膜电图（ERG）¹²。尽管如此，膜片钳技术的单细胞记录仍然至关重要，因为与其他方法相比，它在时间和空间分辨率上均具有更高的敏感性。因此，我们持续开展膜片钳记录，并不断改进方法，以研究小鼠视网膜切片中的视觉信号处理过程^13-15。

在本视频教程中，介绍了相关实验方案及重要提示。只有通过充分准备才能获得良好的记录结果。练习动物解剖并搭建稳定的膜片钳装置，将使大多数研究人员能够成功获得记录数据。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 实验溶液的配制

1. 在正式实验前1天至1周内配制解剖液。由于HEPES缓冲液在较低温度下具有较强的缓冲能力，因此用于视网膜解剖¹⁶。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：115 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl₂、1.0 MgCl₂、10 HEPES、28 葡萄糖。用NaOH调节pH至7.4。溶液可置于冰箱中保存最多1周。
2. 记录液为Ames培养基，这是一种专为视网膜制备设计的人工脑脊液（aCSF）¹⁷。在实验当天，称取Ames粉末（500 ml溶液需4.4 g）于离心管中。同时称取NaHCO₃（500 ml溶液需0.95 g），并与Ames粉末混合。
3. 在实验当天配制用于膜片钳记录的细胞内电极液。按以下浓度（单位：mM）混合所有试剂：111 K-葡萄糖酸盐、1.0 CaCl₂、10 HEPES、1.1 EGTA、10 NaCl、1.0 MgCl₂、5 ATP-Mg 和 1.0 GTP-Na。用KOH调节pH至7.2。使用常规注射器滤器过滤电极液。分装成约500 µl每份，储存于冷冻或超低温冰箱中。

2. 实验当天的准备工作

1. 实验前一晚，将一只小鼠（C57BL/6J 或类似背景，4–8 周龄，雄性）放入笼中，置于黑暗环境中过夜进行暗适应。
2. 解剖前准备：
   1. 在玻璃烧杯中加入解剖液（100–200 ml），置于冰上，并持续通氧至少 10 分钟。
   2. 开始对用于视网膜制备物保存的暗盒进行氧气供应。
   3. 准备带有油脂轨道的塑料盖玻片用于视网膜切片制备，并将每张盖玻片放入一个 35 mm 塑料培养皿中。
   4. 在切片机（组织切片器）上安装新的剃须刀片。
   5. 将滤膜切成两半，用于视网膜切片。
   6. 将解剖工具和移液器整齐排列在解剖显微镜附近。工作区域必须井然有序，以便在黑暗中能方便地取用每一件工具。
3. 膜片钳记录前准备：
   1. 将 Ames’ 粉末和 NaHCO₃ 溶解于蒸馏水中（Ames 4.4 g 和 NaHCO₃ 0.95 g/500 ml ddH₂O）。将 Ames’ 培养基在加热至记录温度（约 35 °C）的同时，用混合气体（95% O₂ 和 5% CO₂）持续通气至少 30 分钟。在持续通气过程中，用 NaHCO₃ 将 pH 调整至 7.4。
   2. 在解剖过程中将内液移液管溶液解冻。解冻后，加入 0.01% 的硫罗丹明 B 用于细胞内染色。

3. 视网膜分离

1. 在暗室中，使用二氧化碳和双侧气胸法处死小鼠。使用二氧化碳 2 - 3 分钟后，小鼠将失去意识。
2. 当小鼠对尾部夹捏不再有反应时，迅速摘除眼球，并将其放入塑料培养皿中的冷解剖液中。实施双侧气胸以确认动物死亡。立即将眼球置于暗盒中的培养皿内保存。使用红外观察仪在暗环境中进行操作。
   注：也可采用异氟烷、断头或颈椎脱位法进行安乐死。安乐死方法应遵循美国国立卫生研究院（NIH）和/或机构动物护理与使用委员会的指南。
3. 在暗室中，调节解剖显微镜和红外照明装置。在显微镜下，将眼球从原培养皿转移至盛有冷解剖液的 10 cm 塑料培养皿中。通过置于塑料皿底部的导管持续通入氧气。调节气体流量，使其不过低，但也不过高以致干扰解剖操作。
4. 角膜和晶状体的去除：
   1. 使用显微外科刀在角膜顶部做一切口。握住眼球另一端的视神经可防止眼球移动。用手术剪延长切口，并连同周围部分巩膜一起切除角膜。
   2. 用精细镊子夹住晶状体，缓慢将其拉出。若玻璃体过于黏稠而难以取出晶状体，则可用剪刀剪断玻璃体。
   3. 形成眼杯后，用小型移液器轻轻将冰冷、充氧的解剖液滴入眼杯中。
      注：角膜切开后眼球会迅速塌陷。保持眼球形态至关重要，因为在操作过程中变形会损伤视网膜并导致视网膜脱离。
5. 识别视网膜的背侧与腹侧：
   注：由于绿色和紫外（UV）视锥细胞分布不均¹⁸，为光反应记录确定特定视网膜区域非常重要。
   1. 识别穿过视网膜眼杯、经过视盘附近的一条线。该线主要穿过视神经的腹侧；包含视神经的一侧为背侧，另一侧为腹侧¹⁹。使用红外观察仪清晰辨识此解剖标志。
   2. 根据实验目的，在不需要的一侧做切口。此操作在从眼杯分离视网膜后将更为便利。
6. 去除玻璃体：
   1. 可选步骤：将眼杯用透明质酸酶（0.5 mg/ml）孵育 15 分钟。
   2. 用超细镊子去除玻璃体。玻璃体主要附着于眼杯底部及外缘。操作时应轻柔，避免接触或刺破视网膜。由于玻璃体可能紧密附着于眼杯，需小心剥离以防止视网膜从眼杯脱离。持续轻拉直至无张力感。
      注：此步骤对小鼠视网膜解剖尤为关键；但对于大鼠或蝾螈等其他物种的视网膜则通常无需此步骤。
7. 从眼杯中分离视网膜。夹住巩膜，用镊子背面轻轻剥离视网膜。
   注：可从分离的视网膜制备全片标本。在边缘做三至四个切口后展平视网膜，或将其切成若干小片。
8. 修剪视网膜并弃去不需要的一半（步骤 3.5）。在同一塑料培养皿中，将剩余视网膜切成两片。对每一片视网膜，剪去边缘以制成视网膜薄片，并修整折叠的边缘。
9. 使用大容量移液器（约 2 ml）将一片视网膜薄片转移至玻璃载片上。用小型移液器吸去多余液体，用一小片滤纸轻压展平薄片，然后迅速在其上方覆盖一片滤膜。
   1. 使用小型移液器，在滤膜上滴加一滴解剖液。等待约 15 秒，使液体在膜上扩散。在此期间，视网膜组织将黏附于滤膜上。
   2. 在滤膜下方及周围加入更多冷解剖液，使带滤膜的视网膜组织浮起。用镊子夹取滤膜并将其放入切片室中。向组织上倾注解剖液，并将标本存于暗盒中。
      注：此处所述操作至关重要。必须迅速完成这些步骤，以确保视网膜组织牢固黏附于滤膜且不干燥。
10. 使用切片器将视网膜组织切成薄片。用于膜片钳研究时，厚度约为 200 μm 较为适宜。
11. 在切片室中放置带有油脂导轨的塑料盖玻片。将一片视网膜切片转移至塑料盖玻片的油脂导轨上。旋转切片 90°，使其横切面可见。将滤膜压紧至盖玻片上，然后用油脂封住滤膜四周。
    1. 待切片在塑料盖玻片上固定后，夹取盖玻片并转移至 35 mm 塑料培养皿中。向视网膜标本上加入冷解剖液并完全浸没。将每个培养皿存于应持续供氧的暗盒中。
       注：整个操作过程需谨慎进行，避免滤膜变形，否则视网膜切片易从滤膜上脱落。

4. 视网膜切片制备的膜片钳记录

1. 记录准备：
   1. 用Ames培养基预灌注灌流管。填充管道时，确保所有气泡均通过。
   2. 使用拉制仪制备膜片钳记录电极。将电极后端浸入电极内液中约1分钟，使电极尖端完成回填。随后，使用微量移液器填充工具将电极内液填充至电极体积的约1/3。将每根电极存放于湿润的电极盒中。
   3. 打开用于膜片钳记录的设备，包括计算机、放大器、CCD相机和显微镜。
2. 关闭房间光源。使用红外观察仪将视网膜切片样本置于显微镜载物台灌流腔内。待样本固定后，开始持续灌流。将灌流液温度设定在33至37 °C。
3. 使用CCD相机观察切片表面，聚焦于目标细胞类型所在的目标位置，选择一个形态健康的细胞进行膜片钳记录（即， 表面应光滑，细胞形态良好。
4. 将记录电极放入电极夹持器中。将电极推进至脑片制备物处。当电极接近脑片制备物（约在上方 2 mm 处）时，通过显微镜找到电极尖端。一旦在显微镜下可见电极尖端，即将尖端向下移动至目标细胞。
5. 设置放大器。将移液电极调至 0 mV/0 pA（归零），并开始施加约 5 mV、频率约 10 Hz 的连续电脉冲。检测移液电极电阻；对于大多数视网膜神经元，理想的电阻范围为 5 至 10 MΩ。
6. 从尖端开始吹出。当移液管浸入浴液时，使用吹嘴或注射器施加正压。持续吹出内部溶液，直至移液管尖端到达目标细胞表面。
   1. 当正压在细胞表面形成微小凹陷时，略微推进尖端并停止吹气。检查移液管的阻抗，其值应有所增加。如果阻抗持续上升，则保持当前位置并持续监测阻抗，直至达到 >1 GΩ（千兆封接）。如果电阻未自发增加，可轻轻施加负压，直至形成千兆封接。
7. 形成吉欧姆封接后，将钳制电位调整至 -70 mV。随后间歇施加负压，以破裂移液管尖端内的细胞膜。当形成全细胞记录构型时，移液管电阻通常介于 500 MΩ 至 1 GΩ 之间，并可观察到电容电流。有时可记录到自发性突触后电流。
8. 记录 -80 至 +40 mV 范围内的电流-电压关系。不同类型的电压门控通道会根据细胞类型的不同而被激活。
9. 记录光诱发的突触电流或电压。

结果

典型的切片制备如图1所示。切片处于平直位置，感光细胞至神经节细胞呈平坦的表面排列，且未从滤纸上脱落。若切片倾斜，则仅部分制备区域处于焦平面内，这将难以识别适合进行膜片钳记录的细胞。在记录过程中，选择一个良好的细胞胞体至关重要，其通常具有光亮的表面、均匀的圆形轮廓，且无可见的暗斑。在形成全细胞记录构型后，切片先暴露于背景光，随后接受阶跃光刺激（图2）。光刺激诱发的兴奋性突触后电位（L-EPSPs）由阶跃光刺激引发（时序以黄色表示）。其峰值幅度和衰减时间因细胞类型及亚型而异。神经节细胞在强光刺激下可产生动作电位（图2 D&E）。生理记录完成后，通过磺酰罗丹明标记揭示细胞类型及其形态学亚型（图2，右侧）。

讨论

只有通过良好的视网膜制备和精心设计的膜片钳装置，才能获得高质量的记录。尽管上述所有步骤都很重要，但本讨论重点强调了在解剖和记录过程中一些关键的步骤。

解剖过程中，有两个因素尤为重要：冷却和供氧。摘除眼球后，应迅速在含有充氧且已冷却的解剖液的解剖皿中去除眼球前部结构，并将冷的解剖液注入眼杯中。当视网膜组织置于解剖皿中时，应每隔10分钟向组织上添加冷的解剖液。在解剖过程中，应快速进行组织切片，避免牵拉或戳刺视网膜组织，以免对其结构造成损伤。使用优质的解剖工具（锋利的镊子和剪刀）也至关重要。切割器与振动切片机同样有效，因其操作迅速。应使用超细镊子尽可能高效地清除玻璃体物质，因为残留的玻璃体会在切片过程中破坏视网膜结构。

初学者在移除晶状体时容易损伤视网膜。视网膜可能从眼杯上脱落，甚至可能随晶状体被意外一并移除。为避免此问题，可在靠近眼外肌附着点的锯齿缘周围剪开巩膜。具有较大开口的眼杯更便于晶状体的移除。此外，在移除眼前部结构时，避免对眼球施加形变也十分重要。另一个关键步骤是将视网膜切片固定在盖玻片上。可通过练习在不扭曲滤纸的情况下旋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠（28-60天龄，雄性）	Jackson laboratory	C57BL/6J品系
Ames培养基粉末	Sigma	A1420	极佳
体视显微镜	Nikon	SMZ745	极佳
解剖工具：镊子	Dumont	#4, #5, #55	极佳
解剖工具：剪刀	Roboz	RS-5605	极佳
解剖工具：手术刀	Surgistar	7514	极佳
剃须刀片（用于切片机）	EMS	71970	极佳
切片机	自制
红外成像仪	Night Owl Optics	NOBG1	成像明亮清晰，但聚焦微小物体存在困难。
拉管仪	Sutter	P-1000	性能优异，可制备一致性良好的玻璃微电极。
暗箱	Pelican	dark box	极佳
膜片钳系统	Scientifica	slice scope 2000	系统配置优秀，大多数关键组件均集成于同一套件中。显微操作器性能出色。
放大器	Molecular Devices	multiclamp 700B	性能优异，操作简便。
数据采集软件	Molecular Devices	pClamp软件	性能优异，操作简便。
光源（LED）	Cool LED	pE-2 4通道系统	极佳
CCD相机	Q-imaging	Retiga 2000	极佳
法拉第笼	自制