基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

摘要

本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解所需的遗传条件。同时展示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于蛋白质印迹（western blotting）以生化手段验证降解所需的条件。这些技术可被调整用于监测多种蛋白质的降解过程。

摘要

受调控的蛋白质降解几乎对所有细胞功能都至关重要。关于真核生物蛋白质降解的分子机制和遗传需求的大部分知识，最初是在Saccharomyces cerevisiae中建立的。经典的蛋白质降解分析依赖于生物化学的脉冲-追踪（pulse-chase）和环己酰亚胺追踪（cycloheximide-chase）方法。尽管这些技术为观察蛋白质降解提供了灵敏的手段，但它们费时费力，通量较低，不适合快速或大规模筛选阻止蛋白质降解的突变。本文描述了一种基于酵母生长的简便检测方法，可用于快速鉴定蛋白质降解所需的遗传因素。在此检测中，一种在特定选择性条件下生长所必需的报告酶与一种不稳定的蛋白质融合。缺乏内源报告酶但表达融合蛋白的细胞，只有在融合蛋白被稳定时（即蛋白质降解受损时）才能在选择性条件下生长。在本研究所描述的生长检测中，将含有编码融合蛋白质粒的野生型和突变型酵母细胞进行系列稀释后，点样于选择性与非选择性培养基上。在选择性条件下生长表明特定突变导致了蛋白质降解功能的受损。蛋白质丰度的增加应通过生物化学方法进一步验证。本文还展示了一种快速提取适合电泳和蛋白质印迹（western blotting）分析的酵母蛋白的方法。基于生长的蛋白质稳定性读数，结合简便的蛋白质提取流程，有助于快速鉴定蛋白质降解所需的遗传因素。这些技术可被改造用于监测多种短寿命蛋白质的降解。在本文示例中，组氨酸生物合成所必需的His3酶与Deg1-Sec62融合。Deg1-Sec62在异常结合内质网转运子后会被靶向降解。当该融合蛋白Deg1-Sec62-His3被稳定时，携带该蛋白的细胞能够在选择性条件下生长。

引言

选择性蛋白质降解对真核生物的生命活动至关重要，而蛋白质降解的异常与多种疾病相关，包括多种癌症、神经退行性疾病、心血管疾病以及囊性纤维化^1-5。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是介导选择性蛋白质降解的关键通路，目前正成为治疗上述疾病的重要靶点^6-10。泛素连接酶可将由76个氨基酸组成的泛素分子共价连接成多聚泛素链并修饰靶蛋白¹¹。带有聚泛素链标记的蛋白质会被约2.5兆道尔顿的26S蛋白酶体识别并降解¹²。在模式真核生物Saccharomyces cerevisiae（芽殖酵母）中开展的研究，为阐明真核细胞中蛋白质降解机制奠定了基础。首个被证实的UPS生理底物是酵母转录抑制因子MATα2^13,14，而许多高度保守的UPS组分最初也是在酵母中被发现或鉴定的（例如^15-26）。在这个遗传操作便捷、功能多样的模式生物中所取得的研究发现，将继续为理解泛素介导的蛋白质降解保守机制提供重要见解。

大多数泛素-蛋白酶体系统（UPS）底物的识别与降解需要多种蛋白质的协同作用。因此，表征特定不稳定蛋白受调控降解过程的一个重要目标是确定其降解所需的遗传因素。在哺乳动物或酵母细胞中监测蛋白质降解的经典方法（例如脉冲-追踪和环己酰亚胺-追踪实验²⁷）费时且劳动强度大。尽管这类方法能够高度灵敏地检测蛋白质降解，但并不适用于对蛋白质降解进行快速分析，或大规模筛选阻止蛋白质降解的突变。本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，可用于快速鉴定不稳定蛋白降解所需的遗传条件。

在基于酵母生长的蛋白质降解分析方法中，将目标不稳定蛋白质（或降解信号）以正确的阅读框与一种在特定条件下支持酵母生长所必需的蛋白质相融合。由此产生的融合蛋白可作为人工底物，成为研究目标不稳定蛋白质降解过程所需遗传条件的有力工具。通常情况下，实验室常用的酵母菌株携带一系列基因突变，这些基因编码参与特定氨基酸或含氮碱基生物合成的代谢酶（例如e.g. ^20,28-30）。在缺乏外源提供这些酶所参与合成的代谢物时，这些酶对细胞增殖至关重要。因此，这些代谢酶可作为基于生长的报告系统，用于检测其融合的不稳定蛋白质是否发生降解。由于阻止蛋白水解的突变会使携带该降解报告系统的细胞在选择性条件下获得生长能力，因此可方便地揭示蛋白质降解所需的遗传因素。

生长优势是某种特定突变可增加目的蛋白丰度的间接证据。然而，必须通过直接的生物化学分析来确认该突变是否确实通过提高蛋白水平促进生长，而非由间接或人为假象因素所致。可通过蛋白质印迹法（western blot）检测携带或不携带该特定突变的细胞中稳态蛋白水平，以验证突变对蛋白丰度的影响。本文还介绍了一种快速高效提取酵母蛋白的方法（依次用氢氧化钠和上样缓冲液孵育酵母细胞），所获得的蛋白样品适用于后续的蛋白质印迹分析³¹。上述实验方法共同促进了蛋白降解候选调控因子的快速鉴定。

方案

1. 酵母生长实验以鉴定蛋白质降解缺陷的候选突变体

1. 将编码不稳定的蛋白与报告代谢酶在阅读框内融合的质粒转化至野生型和突变型酵母细胞中。
2. 将转化子接种于5 ml选择性合成限定（SD）培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。在30 °C下振荡培养过夜。
3. 在600 nm处测定光密度（OD₆₀₀每种过夜培养物的体积。
   注意：经过过夜培养后，培养物中的细胞可能处于对数生长期或稳定期，但应已达到最低OD值₆₀₀ 0.2。生长极为缓慢的酵母菌株可能需要超过一晚的培养时间，或接种更多的细胞，具体条件需通过实验确定。
4. 在无菌96孔板中制备转化酵母细胞的六倍系列稀释液，起始细胞稀释至OD₆₀₀ 0.2。将每种待检测的酵母转化子分别接种于96孔板的不同列中。
   1. 对于每个转化子，计算获得指定细胞稀释光密度（OD）所需的过夜培养物体积₆₀₀ 在最终体积为 200 µl 的条件下，OD600 值为 0.2。将此体积的过夜培养物加入第 1 列对应的孔中。加入适量的无菌水，使总体积达到 200 µl。
   2. 为每行酵母，在第2、3、4列的孔中各加入125 µl无菌水。
      注意：单独包装的无菌96孔板可能附带无菌盖。这些盖子可用作本步骤中分配的无菌水的储液槽，从而允许使用多通道移液器将无菌水同时转移至某一列的所有孔中。
   3. 混合第一列中的内容（酵母稀释至 OD₆₀₀ 用多通道移液器反复吹打，重悬至0.2的OD值。
   4. 使用多通道移液器将25 µl酵母从第1列转移至第2列，通过反复吹打混匀。将25 µl液体从第2列转移至第3列，再将25 µl从第3列转移至第4列（每步均需充分混匀）。
5. 使用多通道移液器混合每个样品。按照酵母稀释度从高到低的顺序，将每个样品各取 4 µl 点样至两块含有相应选择性培养基的平板上。其中一块平板使用可维持质粒选择的压力培养基（该平板作为酵母点样和生长对照）；另一块平板使用可选择维持质粒并表达与报告酶融合的不稳定蛋白的培养基。由于酵母细胞沉降迅速，需在操作过程中定期通过上下吹打混匀细胞。
   注意：与新制备的平板相比，较干燥的平板更容易吸收液体，因此推荐用于本实验。潮湿的平板可通过在低湿度环境中室温孵育1–2天，或在层流罩中较短时间孵育来干燥。如果层流气流方向与实验台面平行，可能导致平板干燥不均匀。使用模板有助于以固定间距点样酵母细胞。文中提供了两种示例模板 图1这些可以打印出来，剪下后贴在培养皿盖的内侧。
6. 让培养皿在实验台面上自然晾干。
7. 在30 °C下孵育平板2–6天。
8. 孵育后对每块平板进行拍照。

图1. 将酵母细胞点样到100毫米琼脂平板上的模板。 这些模板可用于借助多通道移液器以规则间距点样酵母细胞。模板可打印后剪下，并固定在培养皿盖内侧。将含有生长培养基的培养皿放入已固定模板的皿盖中。模板上标有缺口以标记方向。建议在生长实验中使用的平板也用缺口标记方向以便追踪。本图提供了用于点样四组 (A) 或五组 (B) 酵母细胞连续稀释液的模板。请点击此处查看包含100毫米模板的可打印版本。

2. 酵母生长实验的生化验证

1. 酵母细胞培养与碱处理后蛋白质提取（改良自 ³¹)
   1. 将编码不稳定蛋白的质粒转化至野生型和突变型酵母细胞中。
   2. 将转化子接种于5 ml选择性SD培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。30 °C振荡培养过夜。
   3. 测量OD₆₀₀ 每种过夜培养物
      注意：经过过夜培养后，细胞可能处于对数生长阶段或稳定生长阶段，但应已达到指定的OD值₆₀₀ 可允许稀释至 OD₆₀₀ 在10 ml新鲜选择性培养基中稀释至0.2（步骤2.1.4）。生长极为缓慢的酵母菌株可能需要超过一夜的培养时间，或接种更多数量的细胞，具体条件需通过实验确定。
   4. 稀释酵母细胞至 OD₆₀₀ 在10 ml新鲜选择性培养基中，OD600值为0.2。
   5. 继续在30 °C下孵育细胞，同时旋转或振荡，直至培养物达到OD₆₀₀ 介于 0.8 和 1.2 之间（即 处于对数生长中期。
      注意：如果目标不稳定蛋白由可调控启动子控制，则蛋白表达诱导及细胞收获的最佳时间可能因既往研究或经验观察而异。
   6. 收集 2.5 OD₆₀₀ 在15 ml锥形管中，于室温下以5,000 × g离心5分钟，收集培养物。通过移液或抽吸去除上清液。
      注意：一个OD₆₀₀ 单位定义为在 OD 值下每毫升培养液中存在的酵母数量₆₀₀ 为收获2.5 OD，所需培养液体积（以ml计）₆₀₀ 单位（V）可使用以下公式计算：V = 2.5 OD₆₀₀ 单位 / 测定的光密度₆₀₀
   7. 用1 ml蒸馏水重悬细胞，将重悬的细胞转移至微量离心管中。
   8. 离心6,500 × g，室温下持续30秒，使细胞沉淀。用移液器或抽吸法去除上清液。
   9. 将细胞用100 µl蒸馏水重悬，通过移液吹打或涡旋混合，然后加入100 µl 0.2 M NaOH。通过移液吹打混匀。室温孵育5分钟。
   10. 离心收集细胞沉淀（大部分细胞尚未释放蛋白且仍具活性），18,000 × g 离心 5 分钟。用移液器或抽吸法去除上清液。
   11. 将沉淀重悬于50–100 µl 1x Laemmli样品缓冲液中，通过移液吹打或涡旋以裂解细胞。
       注意：离心后去除碱性上清液，随后将细胞重悬于Laemmli样品缓冲液中，可提取与使用Tris-甘氨酸电泳缓冲系统进行SDS-PAGE及蛋白质印迹（western blotting）相容的pH条件下的蛋白质。
   12. 为完全变性蛋白质，将裂解液在 95 °C 下孵育 5 分钟。
       注意：易聚集蛋白（例如 含有多个跨膜片段的蛋白质在95 °C下孵育时可能变得不溶。因此，裂解液应在较低温度下孵育。例如 37 °C – 70 °C，根据经验确定，持续 10 – 30 分钟，用于此类蛋白质的分析。
   13. 将裂解液置于冰上冷却5分钟。
   14. 在室温下以 18,000 x g 离心裂解物 1 分钟，使不溶性物质沉淀。取上清液（溶解的提取蛋白）进行 SDS-PAGE 分离，随后进行 Western 印迹分析（第 2.2 节）。或者，可将裂解物于 -20 °C 保存。
2. 代表性蛋白质印迹实验方案
   1. 加入经经验确定体积的裂解液至SDS-PAGE凝胶中。
   2. 以200 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
   3. 将蛋白质从凝胶通过湿转法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，4 °C条件下，20 V电压下转移60–90分钟。
   4. 用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）溶液，在室温下摇床孵育1小时，或4 °C过夜，封闭膜。
   5. 吸除封闭液。
   6. 在含0.1% Tween-20的TBS缓冲液（TBS/T）中，加入1%脱脂奶粉，将膜与针对目标蛋白（或其表位标签）的一抗在此溶液中于室温孵育1小时，同时轻轻振荡。
   7. 弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   8. 在室温下，将膜与适当荧光染料标记的二抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T中孵育1小时，同时轻轻摇动。
      注意：由于荧光染料对光敏感，荧光染料标记抗体的稀释液应在避光条件下配制。此外，膜与荧光染料标记抗体的孵育应在避光容器中进行。可通过用铝箔包裹孵育托盘来实现避光。
   9. 弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   10. 使用 Li-Cor Odyssey CLx 成像系统及 Image Studio 软件（或性能相当的成像设备和软件），按照制造商推荐的方法获取膜的图像。
   11. 成像膜后，将膜在含1%脱脂奶粉的TBS/T中，与针对上样对照蛋白的一抗在室温下孵育1小时，同时轻轻振荡。
   12. 弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇晃洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   13. 在室温下，将膜与适当荧光染料标记的二抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T缓冲液中孵育1小时，同时轻轻摇动。
   14. 弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
   15. 使用 Li-Cor Odyssey CLx 成像系统及 Image Studio 软件（或性能相当的成像设备和软件），按照制造商推荐的方法获取膜的图像。

结果

为说明该方法，已将 His3 酶融合至模型内质网（ER）相关降解（ERAD）底物的羧基末端， Deg1-Sec62 (图 2A）以创建 Deg1-Sec62-His3（图3). Deg1Sec62 是一类新型内质网相关降解（ERAD）底物的始创成员，这类底物在持续异常地与转运子复合物（translocon）结合后被靶向降解；转运子复合物是介导蛋白质跨内质网膜转运的主要通道。^32-34此类不稳定的蛋白质暂被称为ERAD-T（与易位子相关的）底物。先前的研究表明，在异常的易位子结合情况下， Deg1-Sec62 被 Hrd1 泛素连接酶靶向降解（图2B-D)^32,34,35. 降解其他Hrd1底物所需的因子似乎对 Deg1-Sec62 降解，提示一种新的降解机制³²在脂质结合受损且易位子持续结合的条件...

讨论

本文所述方法可用于快速确定并生化验证酵母细胞中蛋白质降解所需的遗传条件。这些实验突显了酵母作为一种模式真核生物的实用性和强大优势（有关酵母生物学的多篇优秀综述以及酵母细胞操作、保存和处理的实验方案汇编例如 ^41-44) 适用于刚接触该生物体的研究人员）。这些技术可轻松应用于研究多种类型蛋白质的降解及其丰度。例如，已有研究者采用该策略来表征不稳定的胞质、细胞核以及内质网腔内和跨膜蛋白质的降解机制。^45-49.

在选择与不稳定蛋白融合的代谢酶时，需考虑若干因素。首先，宿主基因组中必须不存在该酶编码基因的功能性版本。为最大限度减少假阳性结果（即 在选择性条件下培养时，若不稳定蛋白确实被降解，则建议使用携带报告基因非回复性突变等位基因（最好为完整的基因缺失）的菌株进行实验⁵⁰另一个选择报告酶时需要考虑的因素是是否存在竞争性抑制剂，这些抑制剂可被添加至选择性培养基中，以减少背景生长并提高检测的严谨性。在即使存在完整功能的降解机制时底物蛋白周转率仍相对较低的情况下，这一策略尤为有用。在本文展示...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
所需的酵母菌株、质粒、标准培养基和缓冲液成分			研究人员可在实验室中构建具有特定突变的酵母菌株。野生型酵母及多种突变体也可从商业途径获得（例如 来自 GE Healthcare）。编码融合蛋白的质粒可在研究人员的实验室中构建。
3-氨基-1H-1,2,4-三唑	Fisher Scientific	AC264571000	His3酶的竞争性抑制剂。可在培养基中添加，以提高使用His3报告构建体的生长实验的严谨性。
内切糖苷酶 H（源自重组形式） Streptomyces plicatus)	罗氏	11088726001	可用于评估蛋白质的N-糖基化；与1x Laemmli上样缓冲液中的SDS和β-巯基乙醇浓度相容。
一次性硼硅酸盐玻璃管	Fisher Scientific	14-961-32	可从多家制造商处获得
温度可控培养箱（例如 Heratherm 培养箱型号 IMH180	点科学	51028068	可从多家制造商处获得
New Brunswick 可互换式 18 mm 试管滚轴瓶（试管滚筒）	新不伦瑞克	M1053-0450	建议使用试管滚轴仪以保持酵母初始培养物在悬浮状态下过夜培养。可使用平台摇床或试管滚轴仪维持较大体积的酵母培养物处于悬浮状态。
新不伦瑞克 TC-7 滚筒式摇床 120V 50/60 Hz	新不伦瑞克	M1053-4004	适用于试管滚轴混合器
SmartSpec Plus 分光光度计	Bio-Rad	170-2525	可从多家制造商处获得
无菌96孔平底微量检测板，带盖，单独包装	Sarstedt	82.1581.001	可从多家制造商处获得
Pipetman Neo P8x20N，2-20 μl	Gilson	F14401	可从多家制造商处获得
[标题]
Pipetman Neo P8x200N，20-200 μl	Gilson	F14403	单通道和多通道移液器在本实验方案的各个阶段均有使用。尽管多通道移液器可在多个步骤中减轻移液操作负担，但整个实验流程亦可全程使用单通道移液器。上述设备可从多家制造商处获得。
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	随设备提供的转子可容纳1.5 ml和2.0 ml微量离心管。该转子可更换为可容纳15 ml和50 ml锥形管的转子。
平板成像系统（例如 Gel Doc XR+ 系统	Bio-Rad	170-8195	可使用多种系统对平板进行成像，包括精密成像系统、计算机扫描仪和手机摄像头。
固定角转子 F-35-6-30，带盖及适配器，适用于离心机型号 5430/R，15/50 ml 锥形管，6 位	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml 丝网印刷螺旋盖管，17 x 20 mm 锥形，聚丙烯	Sarstedt	62.554.205	可从多家制造商处获得
1.5 ml 柔性管，PCR 级洁净，天然微量离心管	Eppendorf	22364120	可从多家制造商处获得
模拟 Dri-Bath 加热器	Fisher Scientific	1172011AQ	也可使用带加热板的沸水浴使蛋白质变性
SDS-PAGE 电泳及转膜装置、电源、成像设备或用于 SDS-PAGE 及膜转移的暗室			将因实验室和应用而异
Western blot 成像系统例如 Li-Cor Odyssey CLx 扫描仪和 Image Studio 软件	Li-Cor	9140-01	将因实验室和应用而异
EMD Millipore Immobilon PVDF 转印膜	Fisher Scientific	IPFL00010	将因实验室和应用而异
一抗（例如 磷酸甘油酸激酶（Pgk1）单克隆抗体，小鼠（克隆 22C5D8）	Life Technologies	459250	将根据实验室和应用情况而异
二抗（例如 Alexa Fluor 680 标记的兔抗小鼠 IgG (H+L)	Life Technologies	A-21065	将因实验室和应用而异