Escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

摘要

蛋白质共表达是重组表达的一种有力替代方法 体外 蛋白质复合物，并有助于进行生物化学和遗传学检测 体内。本文报道了蛋白质共表达的应用 大肠杆菌 以获取蛋白质复合物，并调节细胞的突变频率。

摘要

我们在此报道蛋白复合物的表达 体内 在 大肠杆菌 可能比传统的重组实验更为方便 体外特别是，我们证明了溶解度差的 大肠杆菌 DNA聚合酶III的ε亚基（具有3’-5’外切核酸酶活性）在与α亚基（具有DNA聚合酶活性）和θ亚基（稳定ε亚基）共同表达时，其性能显著提升。我们还表明，蛋白质共表达在 E. coli 可用于高效检测来自不同细菌物种的亚基形成功能性蛋白质复合物的能力。我们确实证明了α亚基 Deinococcus radiodurans DNA聚合酶III可共表达 体内 与ε亚基 E. coli此外，我们报道了利用蛋白质共表达来调节突变频率的方法 大肠杆菌. 通过在控制下表达野生型ε亚基 araBAD 启动子（阿拉伯糖诱导型），并在其控制下共表达同一蛋白的诱变D12A变体 lac 启动子（可被异丙基-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷，IPTG 诱导），我们能够改变 E. coli 使用适当浓度的诱导剂阿拉伯糖和IPTG测定突变频率。最后，我们讨论蛋白质共表达领域的最新进展及未来面临的挑战 E. coli.

引言

过表达技术的引入极大地推动了低拷贝数酶的生化研究以及药理活性蛋白（例如， 胰岛素）的工业生产。自这些技术问世以来，人们在提高重组蛋白的产量和质量方面取得了显著进展。此外，多年来已开发出原核生物^1,2和真核生物³的过表达系统，为蛋白质生物技术中的“主力”——Escherichia coli（大肠杆菌）——提供了有用的替代方案。特别是，除E. coli以外的表达平台的出现，使得能够生产具有翻译后修饰的重组肽或蛋白质。然而需要指出的是，E. coli目前仍然是重组蛋白生产的首选生物体。这主要归因于以下几个因素：i）存在大量适用于E. coli的过表达系统（表达载体和菌株）^1,2；ii）E. coli在多种丰富培养基和合成培养基中具有较短的世代时间以及较高的生物量产率；iii）该微生物在生化和遗传水平上均易于操作；iv）已分离出能够表达毒性蛋白的菌株⁴；v）已构建出在群体水平上具有均一诱导特性的菌株^5,6。此外，最近的研究表明，可设计并构建适用于在E. coli中生产翻译后修饰蛋白的表达系统²。

目前，蛋白质过表达主要用于获取单体或同源寡聚蛋白质，其超量合成可通过将单个基因克隆至合适的质粒中实现。然而，近期研究开始关注构....

方案

1. 分离 E. coli 共转化子

1. 准备待转化的合适 E. coli 菌株的感受态细胞。取单个菌落接种于 1 ml LB 培养基（胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl 浓度分别为 10、5 和 10 g/L）中，在 37 °C、180 rpm 振荡条件下培养。将预培养物按 1:500 比例稀释至 25 ml 新鲜 LB 培养基中，并在 37 °C 下继续培养。
2. 当菌液处于对数生长期（OD 值为 0.6）时，于 5,000 × g 离心 20 分钟，弃上清，将菌体沉淀用相当于原培养体积一半的冰预冷的 10%（v/v）无菌甘油-水溶液重悬。重复此步骤 4 次，每次重悬体积减半。最后将菌体沉淀用甘油-水溶液重悬，并将菌悬液分装为每份 50 μl。于 -80 °C 保存，可保存长达 6 个月。
3. 将目标质粒溶解于含 0.5 mM EDTA 的无菌水中。在冰上融化一份电转化感受态细胞，加入适量（2.5–5 ng）的载体质粒。将混合液转移至适合电穿孔的 0.1 cm 比色杯中，施加 1.8 kV 电击。
4. 立即将电穿孔后的细胞转移至 1 ml SOC 培养基（LB 培养基添加 0.2% w/v 葡萄糖、10 mM MgCl₂、2.5 mM KCl）中，在振荡条件下培养 1 小时，然后取 100 μl 菌液涂布于含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上。于 37 °C 过夜培养。
5. 通过在平板上划线分....

结果

E. coli DNA聚合酶III的ε亚基由243个氨基酸组成，通常溶解性较差^17,18，除非删除第187至243位的残基¹⁷。然而，我们先前的研究¹¹表明，全长α、ε和θ亚基的共表达能够产生可溶性的DNA聚合酶III催化核心（图1）。具体而言，利用pBAD-pGOOD共表达系统，我们证明了：i）α和ε亚基的过表达可分别通过阿拉伯糖和IPTG独立调控（图1A）；ii）在过表达α、ε和θ的E. coli细胞中，经凝胶过滤分离的可溶性蛋白提取物中可检测到全长ε亚基（图1B）。在此情况下，外切酶活性分布于三个主要峰（图1B，实心圆点），其中以第23组分为中心的峰被证实含有αεθ催化核心（图1C和图1D）。ε亚基在与α和θ亚基结合后稳定性显著提高。此前我们在E. coli中过表达全长ε时，仅在可溶性蛋白提取物中通过Wester.......

讨论

蛋白质可以具有内在无序性，其三级结构不局限于有限数量的构象²⁵这些无序蛋白通常容易发生聚集²⁵，其分离与表征可能是一项具有挑战性的任务。ε亚基 E. coli DNA聚合酶III具有两个不同的结构域^26,27即：i）N端结构域，具有3’-5’外切酶活性，并能够结合θ亚基；ii）C端结构域，负责与α（聚合酶）亚基结合。已知ε亚基的C端结构域会导致该蛋白溶解度较差，易于发生聚集。事实上，已有研究证明，缺失C端结构域的截短形式ε-186具有可溶性，且可实现高产量纯化¹⁷然而，当需要对ε与α之间的相互作用进行定量研究时（例如， 以确定 K_D αε复合物）的纯化需要获得全长的ε蛋白，这意味着生化操作上的困难。在此背景下，蛋白质共表达可提供ε与α结合能力的定性评估。我们已证明，可获得大量αεθ复合物 体内 通过共表达（图1），从而绕过ε亚基溶解度差的问题。值得注意的是，已有文献报道过表达的αεθ复合物的纯化方法^28,29共表达策略也.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9518
氯仿	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
四环素	Sigma-Aldrich	87128
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T1503
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	95039
酵母提取物	Fluka	70161
30% 丙烯酰胺溶液	BioRad	161-0158	用于凝胶电泳
过硫酸铵	BioRad	161-0700	用于凝胶电泳
甘氨酸	BioRad	161-0718	用于凝胶电泳
SDS	BioRad	161-0302	用于凝胶电泳
TEMED	BioRad	161-0800	用于凝胶电泳
Tris	BioRad	161-0719	用于凝胶电泳
0.1 cm 比色皿	BioRad	1652089	用于电穿孔
5415R 离心机	Eppendorf
Allegra 21R 离心机	Beckman
层析装置 GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II 电穿孔仪	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 电泳槽	BioRad
电源	BioRad
超声波破碎仪 3000	Misonix