电场诱导释放与检测法（EFIRM）对外泌体生物标志物的检测

摘要

外泌体是存在于生物体液中的微囊泡结构，可能携带重要的疾病鉴别生物标志物。本文采用一种新方法，通过非均匀电循环方波破坏外泌体后，特异性地提取外泌体，并快速检测其内含的RNA和蛋白质靶标。

摘要

外泌体是一类在细胞间通讯中起介导作用的微囊泡结构。研究外泌体内部携带的成分，有助于判断其是否含有可用于区分疾病的生物标志物。为了开展外泌体分析，有必要建立一种从目标生物液体中分离和分析外泌体的方法，且该方法需确保外泌体内部内容物不被破坏。

电场诱导释放与检测（EFIRM）是一种用于从生物液体中特异性提取外泌体、释放其内含物并检测其内部RNA/蛋白质含量的方法。首先使用抗人CD63特异性抗体磁性微粒从生物液体中沉淀外泌体。提取后，施加低电压电循环方波（CSW）以破坏囊泡膜并促使内含物释放。外泌体内容物随后与固定在电极表面的DNA引物或抗体杂交，以实现对分子含量的定量检测。

EFIRM 方法在提取外泌体并释放其内含物用于分析时具有优势，无需使用裂解缓冲液。该方法能够对外泌体中的 RNA 和蛋白质生物标志物靶标进行特异性检测。EFIRM 依据外泌体表面标志物特异性地提取外泌体，而非基于尺寸的分离技术。

透射电子显微镜（TEM）和检测分析证明了该方法在外泌体捕获与分析中的功能性。为检测外泌体特征，将EFIRM方法应用于9只注射了人肺腺癌H640细胞（经转染表达外泌体标志物人源CD63-GFP的细胞系）的小鼠的外泌体分析，并与11只接受生理盐水对照的小鼠进行比较。在注射H640细胞的小鼠中，血清和唾液样本均检测到升高的外泌体生物标志物水平（参考基因GAPDH和蛋白表面标志物人源CD63-GFP）。此外，唾液和血清样本显示出良好的线性关系（R = 0.79）。这些结果提示，唾液外泌体生物标志物在远端疾病检测中具有可行性和应用潜力。

引言

外泌体研究是一个新兴的研究领域，旨在研究携带RNA¹、DNA²和蛋白质³等分子的脂质微囊泡。以往对外泌体生物学的研究已证实，外泌体存在于血液⁴、尿液⁵、母乳⁶和唾液⁷等生物流体中。研究表明，外泌体在不同的细胞通路中发挥作用，能够介导机体不同系统之间的远距离细胞间通讯⁸。由于外泌体在细胞间通讯中的重要作用，人们推测其可能包裹着与疾病状态相关的生物分子靶标（如蛋白质、RNA和DNA）。体外in vitro³研究和动物模型⁹研究似乎支持这一假说。在以外泌体内容物进行生物标志物发现的研究中，有必要建立一种方法，用于从生物流体中选择性地分离外泌体、诱导外泌体内容物的释放，并对外泌体中的生物分子进行定量分析。在本研究范围内，外泌体被定义为直径约为70–100 nm、并具有表面标志物CD63的结构。

研究人员通常首先通过超速离心法纯化外泌体¹⁰，然后使用裂解缓冲液试剂盒处理外泌体内容物。采用裂解缓冲液方法需要数分钟至数小时的孵育时间。该过程可能对外泌体所携带的分子造成损伤，并导致样本降解。例如，通过裂解缓冲液释放到周围细胞外环境中的唾液外泌体RNA，其半衰期不足1分钟，因此在未添加稳定试剂的情况下，裂解后对外泌体RNA进行检测尤为困难¹¹。添加多种裂解和稳定试剂的复合效应可能会引入干扰物质，从而增加外泌体内容物分析的复杂性和干扰性。因此，一种可快速释放外泌体内容物并安全保存其分子 cargo 以供表征的替代方法可能具有重要意义。

在本研究中，我们提出利用非均匀电场来释放外泌体内容物。已知电场具有使形成细胞膜的脂质双分子层极化并破坏其结构的能力。我们的实验工作探索了使用非均匀循环方波（CSW）来破坏外泌体的微囊泡结构并释放其所携带的 cargo。该方法使用的电压在数百毫伏范围内，意味着大多数生物分子不会被破坏。我们证明，循环方波能够促使唾液外泌体中的 mRNA 内容物释放到周围流体环境中。这种外泌体内容物的释放可与电极系统无缝整合，用于定量检测生物标志物的表达水平^12,13。该方法实现了对外泌体内容物的快速、高灵敏度且无需裂解缓冲液的分析。

图1. EFIRM 工作流程概览。^. EFIRM 方法 broadly 分为三个主要阶段，这些阶段对于外泌体的纯化与分析至关重要。

本研究采用基于CSW的外泌体内容物释放与分析方法，并结合CD63特异性磁性微珠进行外泌体分离。这些CD63亲和微珠可实现从唾液样本（及其他生物流体）中选择性分离外泌体。使用磁珠孵育并提取外泌体后，将磁珠转移至电化学传感器系统，以进行基于CSW的内容物释放与分析实验步骤。图1展示了EFIRM方法的工作流程概览。

方案

1. 基于磁珠的外泌体提取

1. 取5 µl充分混匀的链霉亲和素包被磁性微粒溶液，用移液器将其加入装有495 µl磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中，以重悬微珠。使用磁力架，用500 µl PBS对微珠洗涤并重悬三次。该磁力架为一个外壳装置，其侧面装有一排磁铁，可固定样品微量离心管。
   1. 每次洗涤时，先将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后用移液枪头小心吸除上清缓冲液，避免扰动微珠。
   2. 将离心管转移至无磁铁的普通试管架上。向管中加入500 µl PBS，并用移液器吹打混合溶液与微珠。随后将离心管放回磁力架，再次使微珠与溶液分离。
   3. 重复上述磁力分离与PBS重悬步骤共三次。此过程完成对磁性微粒的初步洗涤。
2. 将微珠重悬于490 µl PBS缓冲液中，离心管置于磁力架的非磁化区域。向微珠混合液中加入5 µl浓度为1.0 mg/ml的生物素化小鼠抗人CD63抗体，用移液器充分混匀微珠与抗体溶液。
3. 将含有微珠与生物素化抗体混合物的微量离心管置于样品旋转仪上。设置旋转仪参数为往复旋转，倾斜角度90°，持续5秒，振动角度5°，持续1秒。在室温下按此参数旋转样品-微珠混合管30分钟。
4. 偶联后去除未结合的抗体。
   1. 室温旋转30分钟后，将离心管重新置于磁力架上静置5分钟。
   2. 使用微量移液器吸除液体相，并用500 µl PBS洗涤微珠三次。完成三次洗涤后，将微珠重悬于490 µl酪蛋白-PBS溶液中，并置于磁力架的非磁化区域。
5. 使用抗体包被微珠提取外泌体。
   1. 根据目标样品编号标记各离心管。用移液器向微量离心管中加入10 µl血清或唾液样品。通过反复吹打，用移液器充分混匀样品与磁性微珠。
   2. 将含有样品与抗人CD63抗体微珠的离心管置于旋转仪上，在室温下按步骤1.2所述相同参数旋转2小时。
   3. 样品旋转2小时后，进行三次洗涤：通过磁力分离使微珠与溶液分开，用微量移液器去除液体相，并将微珠重悬于500 µl Tris-HCl缓冲液中。此时微珠已结合外泌体，可用于后续电场释放与检测。

2. 电场诱导释放与外泌体内容物的检测

1. 使用GAPDH引物对电极进行初始预包被
   1. 将一个塑料小室应用于电极阵列上，以防止各个电极之间的交叉污染。本实验使用一个包含16个传感器的电极阵列，阵列中的每个单元电极均由裸金制成的工作电极、对电极和参比电极组成。
   2. 通过移液将储备试剂加入含有超纯去离子水的离心管中，配制含有100 nM DNA探针、0.3 M KCl和10 mM吡咯的储备混合液。充分涡旋混匀。
      注：本研究选用的DNA探针对应于存在于外泌体中的GAPDH参考基因。所用探针序列为：5'-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3'。将该混合液用于所有电极。
   3. 将60 µl单体-DNA探针混合液滴加至每个金电极表面。检查电极，确保液体混合物充分覆盖工作电极、对电极和参比电极。
   4. 通过在电极表面施加循环方波（CSW）电场，使单体-探针混合物发生电聚合，在电极表面形成导电聚合物层。该电场包括先施加+350 mV持续9秒，随后立即切换至+950 mV持续1秒。对电极施加该循环方波电场共10个循环，总施加时间为100秒。
   5. 用去离子水冲洗传感器表面3次，并用氮气吹干，以去除电极表面残留液体。确保电极表面液体被彻底清除。
2. 外泌体内容物释放
   1. 将5 µl浓度为1 µM的检测探针加入495 µl珠-外泌体复合物混合液中，并用移液器混匀。
      注：检测探针为在3'端偶联了荧光素分子的DNA引物序列。本研究所用检测探针序列对应于外泌体内的GAPDH mRNA。荧光素标记检测探针的序列为：5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3'。
   2. 将60 µl探针与珠-外泌体复合物混合液滴加至下方装有磁阵列的金电极表面。该磁阵列由16个直径为2.54 mm的钕磁铁组成，排列方式与传感器的工作电极相对应。图2A展示了磁铁与珠-外泌体溶液的布置方式。
   3. 样品加载至电极表面后，施加20个循环的CSW电场（每个循环包括-300 mV持续9秒和+200 mV持续1秒，共200秒）。释放的外泌体内容物将与电极表面的引物发生杂交。若研究目标为外泌体表面标志物，则跳过本实验步骤。图2B展示了该过程。
   4. 用去离子水对电极表面进行三次冲洗，洗去未结合的分析物。用氮气吹干电极。
3. 报告抗体结合与信号读出
   1. 在酪蛋白/PBS缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体（HRP，1:1,000稀释），使其终浓度为150单位/毫升，取60 µl加入电极表面。
   2. 通过电场驱动使抗荧光素HRP与探针夹心复合物结合。在电极表面施加-200 mV持续1秒、+500 mV持续1秒，共5个循环。图2A展示了蛋白质和核酸系统中捕获探针与检测探针复合物的形成。
   3. 用去离子水对传感器表面进行三次清洗，并用氮气吹干。
   4. 在洗去未结合的过量抗荧光素抗体后，加入60 µl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物。使用多通道移液器将该底物加载至各传感器表面。
   5. 使用可同时测量16个通道的电化学恒电位仪，在-200 mV电位下测量60秒的电流，进行安培法信号读出。图2C为读出过程中电流曲线的一个示例。

图2. EFIRM 方法的组成部分。（A）利用包被抗人CD63的磁性微粒从生物流体中提取外泌体，并通过向粒子-外泌体复合物施加循环方波释放外泌体内容物的方法。（B）用于检测释放的外泌体中RNA/DNA/蛋白质靶标的电极生物传感器示意图。（C）EFIRM 方法的典型安培信号读出结果，其中较大的电流强度对应于更高水平的生物分子。该图来自 Wei et al.¹⁴ 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

使用透射电子显微镜验证外泌体捕获微珠

采用抗人CD63磁珠从唾液中分离外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）图像验证提取方案。TEM显示磁珠周围紧邻70-100 nm的颗粒（见图3A和3B），符合已知的外泌体特征。而在未预先偶联抗人CD63抗体的磁珠中，则未观察到70-100 nm的颗粒（见图3C和3D）。

图 3. 磁性微粒的透射电子显微镜（TEM）图像。...

讨论

结果表明，包被抗人CD63的磁性纳米颗粒能够特异性捕获大小在70-100 nm范围内的小颗粒。所捕获的颗粒与先前观察到的外泌体特征一致。此外，在捕获颗粒后使用低压循环方波（CSW）可将颗粒从磁珠表面释放，并产生与传统基于裂解缓冲液方法相似的DNA降解谱，从而实现内容物的释放。这些数据表明，通过施加循环方波破坏外泌体脂质膜，可简化外泌体内容物释放的工作流程。该简化方法能够在无需使用可能对外泌体内容物产生不利影响的裂解缓冲液的情况下，实现快速内容物释放。因此，与传统的超速离心法和裂解缓冲液使用方法相比，EFIRM方法似乎是开展外泌体内容物研究的更优选择。EFIRM方法具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，非常适合从生物液体中提取外泌体，并快速检测其内部的核酸和蛋白质靶标。

将EFIRM方法应用于注射了H460人肺癌细胞的裸鼠模型研究。H460人肺癌细胞 дополнительно 转染了人源CD63-GFP，使外泌体表面标志物CD63具有荧光特性。经过20天后，采集小鼠的血清和唾液样本，并利用EFIRM方法分析其外泌体成分。该研究显示血清与唾液样本之间存在线性相关性（R

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带芯片接口的Helios 16通道读取系统	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16通道传感器芯片，裸金表面，每包5片	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
生物素标记的抗人CD63抗体	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne 链霉亲和素T1磁珠	Invitrogen, USA	65601
钕磁铁（1/10" 直径 × 1/32" 厚度）	K&J Magnetics, USA	DH101
超纯蒸馏水	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toledo 3 M KCl溶液	Fisher Scientific, USA	1911512
吡咯	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
抗荧光素-POD，Fab片段	Roche, Germany	11426346910
3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物（TMB/H2O2，低活性）	Neogen, Usa	330175
磷酸盐缓冲盐水溶液	Life Technologies, USA	10010023
酪蛋白/PBS	Fisher Scientific, USA	37532