的蛋白质 - 蛋白质相互作用抑制剂的发展，通过替换：应用程序的设计和开发非ATP竞争性CDK抑制剂

摘要

我们描述了靶向蛋白质-蛋白质相互作用的 REPLACE 策略的实施。REPLACE 是一种迭代策略，涉及合成和计算方法，用于将优化的肽抑制剂转化为药物样分子。

摘要

REPLACE是发展到更有效地针对蛋白质 - 蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）一个独特的策略。其目的是通过对抑制剂的识别这样的结合位点并提供改进的方法代表了大多数潜在的药物靶点，扩大可用药物靶点的空间。本文的主要目的是提供替换策略，涉及的计算和合成化学方法的使用和应用的方法概述。取而代之的是通过其应用到非ATP竞争性细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂作为抗肿瘤治疗学的发展例举。激酶经常放松管制在癌症，因此被认为是药物开发的重要目标。在S期CDK2 /细胞周期蛋白A的抑制已报道通过E2F1途径促进癌细胞中p53的独立的方式选择性凋亡。靶向蛋白质 - 蛋白质相互作用的细胞周期蛋白结合蛋白摹槽（CBG）是一种方法，这将使细胞周期在转录激酶特异性抑制。该CBG是由CDK底物和肿瘤抑制蛋白的共识序列中，识别被称为细胞周期蛋白结合基序（CBM）。煤层气先前已优化，从P21WAF（HAKRRIF），然后八肽进一步截短为五肽保持足够的活性（RRLIF）。在一般不细胞渗透性肽，是代谢不稳定，因此，策略REPLACE（通过计算富集代用偏配体替代品）已被以产生更多的类药性的抑制剂的应用。策略开头片段结扎抑制肽（翻转），其选择性地抑制细胞周期CDK /细胞周期蛋白复合物的设计。通过迭代地更换HAKRRLIF / RRLIF的残基片段像小分子（封端基团），从N末端（NCAPS）开始生成翻转，随后更换上C末端。这些化合物开始的非ATP竞争性CDK抑制剂作为抗肿瘤疗法的产生点。

引言

在这篇文章中，应用REPLACE（更换使用计算富集部分配体的替代品）策略，以蛋白质-蛋白质相互作用的肽酶抑制剂转换成多种药物相关的分子为例进行说明^1-3。虽然生产者价格指数代表了丰富，但开发不足潜在的药物靶点的来源，现有方法在很大程度上不足以让这些普及。当前策略包括基于片段设计^4，高通量筛选^5和6提供了进步装订肽，但是这些在许多情况下是无效的。其结果是，更多的进展和更有效的方法是必需的。 REPLACE已激酶抑制剂具有改善的类药性的属性和有潜力的进一步发展为抗肿瘤治疗剂的开发已充分验证。这种策略是例示的电池的非ATP酶抑制剂的开发周期CDK的并涉及如下：1）获得关于HAKRRLIF / RRLIF与细胞周期蛋白结合槽相互作用三维结构信息; 2）确定的重要结合决定肽相互作用;含有一种或多种结合决定簇的肽的N-末端的3）截断; 4）计算确定可能的小分子的替代品（局部的配位体的替代品，聚乳酸类）的肽和其中的截断部分保留母体肽的关键相互作用; 5）合成或PLA中的商业采购预测与先前所删除的肽残基所占据的子站点贪婪地结合; 6）的合成通过使用固相合成截短的肽最好PLA中的结扎翻转的; 7）检测结合在体外翻转或功能测定（在CDK /细胞周期蛋白上下文荧光偏振），随后在细胞生存力测定法进一步表征。更换的战略中一个示意图y为如图 1所示。在这篇文章中，REPLACE策略的迭代被讨论，并应用到CDK2 /细胞周期蛋白A进行详细说明。....

方案

潜在的小分子封端基团的1计算识别

注意：原则上，各种各样的对接或药效搜索方法可用于预测潜在封盖基。计算研究中REPLACE的主要目的是确定的小分子，其保留的被取代的氨基酸的功能和相互作用。

1. 在LigandFit对接协议¹⁴的验证

注意：在以前的研究中，对接方法（LigandFit ^15，在分子建模程序套件的模块，发现工作室3.0）进行验证，以确保该算法足以重现已知NCAPS的结合方式，并表明，该结果获得的未知化合物的预测^14。

1. 通过以下步骤（1.2 - 1.5），识别LigandFit最佳条件为：PLP1恩ERGY网格姿势代，最小化产生的姿势和PLP1打分函数姿势的分析。
2. 为了限制所得到的构象，并在封端的肽适当地定位的配体形成共价键，设置Trp217和Gln254的吲哚氮与酰胺氮原子分别作为相互作用滤波器氢键。
3. 设计和码头的片段替代品库到CDK2 /细胞周期蛋白受体（2UUE）。优先潜力封盖组​​进行综合和基于PLP1得分，以互动的过滤器和互补的CBG互动的商业采购。是所需LigandFit对接的各个步骤如下。

2. 的受体结合位点^14制备 ....

结果

HAKRRLIF与细胞周期蛋白槽的相互作用示于图2。表示键结合决定的肽残基包括ALA2，ARG4，Leu6和Phe8与其他残基提供较小的贡献^12,13,18。在这种情况下，研究替换策略已被用于为了找到残留HAKRRLIF的N末端四肽片段的替代品，主要是模仿ALA2和ARG4的相互作用。潜在NCAP片段（ 表1）库是基于标准构建。每个分子停靠到由N个封端基的截断其晶体结构与细胞周期蛋白A（PDB ID：2UUE）创建的空置结合位点。基于姿态分析和PLP1得分作为亲和力的预测潜在配体的替代品被选定（对接姿势例子示于图4）。一个确认NCAP（1-（3-氯苯基）-5-甲基-1-的合成1H-1,2,4-三唑-3-羧酸）示于图5，其中在三个步骤中生成且通过自动快速色谱法（补充图1）纯化该分子。的^{1 H NMR，13 CNMR，}质谱和HPLC表征有代表性的化合物的1-（3-氯苯基）-5-甲基-1H-1,2.......

讨论

在药物发现中靶向蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）非常具有挑战性，因为这些相互作用通常涉及一个大的浅接触界面，该界面由许多扩散的接触组成¹⁹。此外，抑制适合药物发现的PPI的肽化合物由于其较高的分子量、代谢不稳定性和生物利用度差而存在问题²⁰。目前应用于开发 PPI 抑制剂的策略包括拟蛋白质组学设计和基于片段的设计。拟蛋白质组学的例子包括吻合肽、卟啉支架和环α螺旋模拟物，尽管这些并非没有缺点^21,22。卟啉（由吡咯环组成的杂环大环）是高分子量结构，具有很强的疏水性²³。合订肽的合成可能很复杂，其细胞通透性机制目前尚不完全清楚⁶。传统的基于片段的方法需要一种高灵敏度的检测方法来测试弱结合化合物，并且还必须具有高溶解性。REPLACE 是一种由计算预测、合成有机化学和生物学评估组成的迭代策略，旨在将肽抑制剂转化为 FLIP，并最终转化为非肽类药物化合物。使用 REPLACE，设计和鉴定片段替代品以模拟肽抑制剂结合决定簇的相互作用。结构分析与合成方法和生物学评估相结合，可以有效地设计与热点（关键相互作用位点）相互作用的分子，并补充PPI.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计算化学
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex 工作站
合成有机化学
硅胶（GF-254 板），用于 TLC，Biotage（瑞典乌普萨拉）用于快速色谱，Waters Alliance 2695 HPLC 和 2996二极管阵列检测器，配备 C18 （2） 100 A，250 x 4.6 毫米， 5 μm 柱 （Phenomenox Luna） 用于纯度测定，1H NMR 和 13C NMR 波谱分别用 Varian Mercury 300 和 400 波谱仪记录。使用微质量 QTOF（串联四重 1 飞行时间质谱仪）、电喷雾电离 （ESI） 和 VG 70S（双聚焦扇形磁场质谱仪，EI）测量质谱。
荧光偏振测定
384 微量孔板，微量移液管	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 和 CDK2CA（充分纯化的重组人激酶复合物）	BPS BioSciences	40094（CDK4/细胞周期蛋白 D），41101（CDK2/细胞周期蛋白 A）
测定缓冲液（25 nM HEPES pH 7,10 mM NaCl，0.01% Nonidet P-40,1 mM 二硫苏糖醇 （DTT））
25 nM HEPES	CALBIOCHEM
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US 生物	N3500
DTT	Aldrich-70
°C 冷冻室	Revco （Ultima II）
DTX880 多模式探测器配备 485 NM/535 nm 激发/发射滤光片和适用于荧光素的二向色镜	Beckman Coulter， Brea， CA
细胞培养
96 孔板	Fisher
U2OS（骨肉瘤）和 DU145（前列腺癌）细胞系的冷冻储备	ATCC
NU 血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、PEN/STRIP、MTT 试剂	Fisher，Life technology，Alfa Aesar
血细胞计数器	VWR-70
°C 冷冻机	Revco （Ultima II）
培养箱	Thermo electron corporation
离心机	Eppendorf	5804 R
冰箱 4-8 °C	Isotemp Fisher
DTX880 多模式探测器配备 595 nm 滤光片	Beckman Coulter，加利福尼亚州