通过REPLACE方法开发蛋白-蛋白相互作用抑制剂：应用于设计与开发非ATP竞争性CDK抑制剂

摘要

我们描述了用于靶向蛋白质-蛋白质相互作用的 REPLACE 策略的实施方法。REPLACE 是一种迭代策略，结合合成与计算方法，将优化的肽类抑制剂转化为类药物分子。

摘要

REPLACE 是一种独特的策略，旨在更有效地靶向蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。该策略通过提供更优的方法来识别此类结合位点的抑制剂，从而拓展可成药靶点的空间，而这类靶点代表了大多数潜在的药物靶标。本文的主要目标是概述 REPLACE 策略的应用与使用方法，该策略结合了计算化学与合成化学手段。本文以 REPLACE 策略在开发非ATP竞争性周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂作为抗肿瘤治疗药物中的应用为例进行说明。CDK 在癌症中常发生失调，因此被视为药物研发的重要靶点。已有报道指出，在S期抑制 CDK2/周期蛋白A 可通过 E2F1 通路以p53非依赖的方式促进癌细胞的选择性凋亡。靶向周期蛋白结合沟槽（CBG）处的蛋白质-蛋白质相互作用，是一种可特异性抑制细胞周期相关CDK而非转录相关CDK的方法。CBG 可被来源于CDK底物和肿瘤抑制蛋白的一段共识序列识别，该序列称为周期蛋白结合基序（CBM）。此前，CBM 已从 p21Waf 蛋白中优化为一个八肽（HAKRRIF），并进一步截短为保留足够活性的五肽（RRLIF）。然而，多肽通常细胞通透性差且代谢不稳定，因此应用了 REPLACE（通过计算富集实现部分配体替代）策略，以生成更具药物特性的抑制剂。该策略首先设计片段连接型抑制性多肽（FLIPs），选择性抑制细胞周期相关的CDK/周期蛋白复合物。FLIPs 的构建是通过从N端（Ncaps）开始，逐步用类似片段的小分子（封端基团）替代 HAKRRLIF/RRLIF 中的氨基酸残基，随后再对C端进行替换而实现的。这些化合物可作为开发非ATP竞争性CDK抑制剂用于抗肿瘤治疗的起点。

引言

本文描述了应用REPLACE（通过计算富集法以部分配体替代物进行替换）策略将蛋白-蛋白相互作用的肽类抑制剂转化为更具药物研发价值分子的案例研究。^1-3尽管蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）代表着丰富但尚未被充分开发的潜在药物靶点资源，现有的方法在很大程度上仍不足以使其得到广泛应用。目前的策略包括基于片段的设计⁴高通量筛选⁵ 和订书肽⁶ 已取得进展，但这些方法在许多情况下效果不佳。因此，需要进一步推进并开发更高效的策略。REPLACE 方法已在激酶抑制剂的开发中得到充分验证，所获得的化合物具有更优的类药性质，并具备进一步开发为抗肿瘤治疗药物的潜力。该策略在细胞周期依赖性激酶（CDK）非ATP竞争性抑制剂的开发中得到了充分体现，具体步骤如下：1）获取 HAKRRLIF/RRLIF 与周期蛋白结合沟区相互作用的三维结构信息；2）确定介导肽段结合的关键结合决定因素；3）截除含有一个或多个结合决定因素的肽段N端；4）通过计算方法识别可替代被截除肽段部分的潜在小分子替代物（部分配体替代物，PLAs），并保留母体肽段的关键相互作用；5）合成或商业采购预测能够高亲和力结合原先被删除肽段残基所占据亚位点的 PLAs；6）通过固相合成将最优的 PLAs 与截短肽段连接，合成荧光标记抑制肽（FLIPs）；7）对 FLIPs 进行测试 体外 结合或功能检测（CDK/细胞周期蛋白背景下的荧光偏振检测），随后在细胞活力检测中进行进一步表征。REPLACE....

方案

1. 潜在小分子封端基团的计算鉴定

注意：原则上，可使用多种对接或药效团搜索方法来预测潜在的封端基团。REPLACE 中计算研究的主要目的是鉴定能够保留被替换氨基酸的特征和相互作用的小分子。

1. 配体对接程序 LigandFit 的验证¹⁴

注意：在之前的研究中，对接方法（LigandFit¹⁵，分子模拟程序套件 Discovery Studio 3.0 中的一个模块）已得到验证，以确保该算法足以重现已知 Ncaps 的结合模式，并证明对未知化合物所得结果具有预测性¹⁴。

1. 通过以下步骤（1.2 – 1.5），确定LigandFit的最佳参数：采用PLP1能量网格进行构象生成，对生成的构象进行最小化优化，并使用PLP1评分函数分析构象。
2. 为限制获得的构象数量，并使配体在封端肽中正确定位以形成共价键，将Trp217的吲哚氮原子和Gln254的酰胺氮原子分别设置为氢键相互作用的过滤条件。
3. 设计并对接一系列片段替代物至CDK2/细胞周期蛋白A受体（2UUE）中。根据PLP1评分、与相互作用过滤条件的相互作用以及与CBG的互补性，优先选择潜在的封端基团用于合成和商业采购。LigandFit对接所需的各个步骤如下。....

结果

HAKRRLIF 与周期蛋白沟槽的相互作用如图2所示。构成关键结合决定因素的肽残基包括 Ala2、Arg4、Leu6 和 Phe8，其他残基贡献较小^12,13,18。在本案例研究中，采用了 REPLACE 策略，旨在寻找 HAKRRLIF N 端四肽中各残基的片段替代物，主要模拟 Ala2 和 Arg4 的相互作用。根据既定标准构建了潜在 Ncap 片段的化合物库（表1）。每个分子均对接至从 HAKRRLIF 与周期蛋白 A 的晶体结构（PDB ID: 2UUE）中去除 N 端封端基团后形成的空余结合位点。通过构象分析及 PLP1 评分（用于预测结合亲和力）筛选出潜在的配体替代物（对接构象示例见图4）。一个经确认的 Ncap（1-(3-氯苯基)-5-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-甲酸）的合成路线如图5所示，该分子经三步反应合成，并通过自动快速色谱法纯化（补充图1）。代表性化合物 1-(3-氯苯基)-5-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-甲酸的<.......

讨论

在药物发现中，靶向蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）极具挑战性，因为这类相互作用通常涉及一个由大量且分散的接触点组成的宽而浅的接触界面¹⁹。此外，可用于药物发现的肽类PPI抑制剂也存在诸多问题，例如分子量较高、代谢不稳定以及生物利用度差²⁰。目前用于开发PPI抑制剂的策略包括拟蛋白设计和基于片段的设计。拟蛋白的实例包括订书肽（stapled peptides）、卟啉骨架以及环状α-螺旋模拟物，尽管这些方法也存在一定的局限性^21,22。卟啉（由吡咯环组成的杂环大环化合物）具有较高的分子量且高度疏水²³。订书肽的合成可能较为复杂，且其细胞通透性的机制目前尚未完全阐明⁶。传统的基于片段的方法需要高灵敏度的检测手段来测试弱结合化合物，同时这些化合物还必须具有高度的溶解性。REPLACE是一种迭代策略，结合了计算预测、合成有机化学和生物学评价，旨在将肽类抑制剂转化为FLIPs（片段状抑制剂肽），并最终转化为非肽类、类药物化合物。通过REPLACE方法，设计并鉴定出能够模拟肽类抑制剂中关键结合残基相互作用的片段替代物。结合结构分析、合成方法与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计算化学
Accelyrs Discovery Studio 3.0
Dell Optiplex 工作站
合成有机化学
薄层色谱用硅胶（GF-254板），快速柱色谱用Biotage（瑞典乌普萨拉），纯度测定用Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（2996）和C18 (2) 100 Å, 250 × 4.6 mm, 5 μm色谱柱（Phenomenex Luna）；1H NMR和13C NMR谱图分别使用Varian Mercury 300和400核磁共振波谱仪记录。质谱采用Micromass QTOF（串联四极杆-飞行时间质谱仪）和电喷雾电离（ESI）以及VG 70S（双聚焦磁扇形质谱仪，EI）测定。
荧光偏振分析
384孔微孔板，微量移液器	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 和 CDK2CA（高度纯化的重组人激酶复合物）	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/细胞周期蛋白D), 41101(CDK2/细胞周期蛋白A)
分析缓冲液（25 nM HEPES，pH 7，10 mM NaCl，0.01% Nonidet P-40，1 mM 二硫苏糖醇（DTT））
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70 °C 冰箱	Revco (Ultima II)
配备485 nm/535 nm激发/发射滤光片及适用于荧光素的二向色镜的DTX880多功能检测仪	Beckman Coulter, Brea, CA
细胞培养
96孔板	Fisher
U2OS（骨肉瘤）和DU145（前列腺癌）细胞系的冻存株	ATCC
胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素/链霉素、MTT试剂	Fisher, Life Technology, Alfa Aesar
血细胞计数板	VWR
-70 °C 冰箱	Revco (Ultima II)
培养箱	Thermo Electron Corporation
离心机	Eppendorf	5804 R
4–8 °C 冰箱	Isotemp Fisher
配备595 nm滤光片的DTX880多功能检测仪	Beckman Coulter, Brea, CA