合成吲哚基糖苷用于检测糖苷酶活性

摘要

吲哚醇糖苷是已被广泛认可且普遍使用的酶筛选和酶活性监测工具。尤其是对于葡萄糖型结构，以往的合成方法已被证明具有挑战性且产率较低。我们的新方法采用吲哚醇酸酯作为关键中间体，能够以较高的产率获得大量吲哚醇糖苷。

摘要

吲哚酚糖苷已被证明是监测糖苷酶活性的有价值且多功能的工具。通过酶水解释放出的吲哚酚可迅速被氧化，例如被空气中的氧气氧化，生成类似于靛蓝的染料。该反应使得无需对酶进行分离或纯化即可快速简便地进行 in vivo 筛选，也可用于琼脂平板或溶液中的快速检测（例如，蓝白斑筛选、微孔板检测），并广泛应用于生物化学、组织化学、细菌学和分子生物学领域。然而，由于多种副反应以及吲哚酚羟基官能团的低反应活性，此类底物的合成一直存在困难，特别是对于葡萄糖型结构，产率普遍较低。我们提出的新方法采用吲哚酸酯作为关键中间体。通过可放大的合成路线，制备了具有不同取代模式的吲哚酸酯。以这些受体与全乙酰化糖基卤化物在常规条件下进行相转移糖基化反应，可获得高产率。随后经酯基裂解及温和的银介导糖基化反应，可高产率地得到全乙酰化的吲哚酚糖苷。最后采用Zemplén去保护法完成脱乙酰化。

引言

长期以来，靛蓝的生产是一项经济上非常重要的工艺。在大规模化学合成方法能够廉价制备靛蓝之前，自基督教出现以前人们便已从天然来源获取其前体物质。17世纪以来，欧洲种植产靛植物（天然靛蓝）逐渐变得无利可图。^th 世纪，因为印度靛蓝植物中靛蓝前体的含量（0.2–0.8%）约高出30倍。19世纪末，靛蓝的化学合成取代了传统的种植 cultivation^1,2.

天然存在于植物中的靛蓝前体包括靛苷（1）、印萨坦A（2）和伊萨坦B（3）（图1）。它们均含有一个与糖苷残基相连的吲哚酚基团。通过酶水解等方式裂解糖苷键后，可释放出吲哚酚（4）。吲哚酚本身几乎无色，但可迅速被氧化生成靛蓝染料（5）。这一灵敏的反应已被广泛应用于生物化学、组织化学、细菌学和分子生物学中，用于检测酶活性。无需分离或纯化酶即可在活体（in vivo）中进行活性筛选，也可在琼脂平板或溶液中进行快速检测（例如，蓝白斑筛选、微孔板检测）。根据与吲哚酚部分相连的残基（例如，酯类、糖苷类、硫酸酯类），已开发出适用于不同酶类（例如，酯酶、糖苷水解酶、硫酸酯酶）的相应底物³。下文将重点讨论吲哚酚糖苷的形成及其应用。

方案

一般注意事项：

所有反应均在通风橱中进行，并使用适当的个人防护装备。所有试剂和溶剂（p.a. 级；干燥溶剂的含水量：MeCN <50 ppm；Et₂O <0.01%；CH₂Cl₂ <0.003%；THF <0.005%）均购自商业来源，未经进一步纯化直接使用。薄层色谱在 Merck 硅胶 60 F₂₅₄ 板上进行。化合物通过紫外光显色和/或用 EtOH/H₂SO₄（9:1）处理后加热显色。柱色谱使用 Merck/Fluka 硅胶 60（230–400 目）进行。过滤操作使用布氏漏斗和真空泵完成。溶剂通过旋转蒸发仪（40 °C，约 200 rpm）去除。产物在高真空（旋片泵）条件下干燥。需要干燥溶剂的反应均在氩气气氛下进行。

以下描述了使用5-溴-4-氯-吲哚酸烯丙酯（12）合成X-Gal（16）的方法。有关根据此合成路线制备的具有不同取代模式的其他化合物以及甲基酯，参见文献^17-19。

1. 受体：5-溴-4-氯-吲哚酸烯丙酯¹⁸（12）的合成

1. N-乙酰化：合成 N-(4-溴-3-氯-2-甲基....

结果

最早关于吲哚烷和5-溴-吲哚烷的合成方法由Robertson于1927年和1929年发表^15,16通过使用靛红酸甲酯作为受体，反应性的2位点被阻断，从而部分抑制了副反应。在脱保护和脱羧后，于丙酮/氢氧化钠体系中进行糖基化反应（160 °C，乙酸酐，1 小时），最后经脱乙酰化得到靛苷烷和 5-溴靛苷烷。基于此概念，我们开发了一种改进的吲哚醇糖苷合成方法，采用吲哚酸烯丙酯作为受体^17-19. 受体合成从相应的取代苯胺衍生物（5）开始（图2）。氨基官能团乙酰化后（6），经高锰酸钾氧化得到 N乙酰化蒽胺酸衍生物（7）的乙酰保护基被去除（8），随后与三光气反应生成相应的异邻氨基苯甲酸酐（9）。 N- 烷基化反应可通过氢化钠去质子化后，随后与烯丙基溴乙酸酯（10）反应轻松实现。然后用烯丙醇开环酸酐（11），最后通过Dieckmann缩合反应实现环化闭合（12）。除一个例外（11）外，所有化合物均通过重结晶、沉淀或洗涤进行纯化。靛红酸烯丙酯以30%的总收率获得（共七步）。

讨论

由于产率较低且存在局限性，特别是对于葡萄糖型结构及更复杂的寡糖，因此开发了一种新型的吲哚醇糖苷合成方法。吲哚酸酯被证明是宝贵的中间体，可通过模块化、可放大的路线获得。所有步骤均具有高产率，且由于起始原料廉价、后处理简便，可实现克级规模的合成。采用烯丙基酯策略的优势在于能够阻断活性较强的2位，从而抑制导致产率降低的副反应。使用烯丙基酯还允许进行选择性断裂，这在含有羧基官能团的底物上尤为重要。

在常规条件下，采用相应的全乙酰化糖基卤化物对这些受体进行相转移糖基化反应，均以高收率成功实现。随后，使用钯催化剂选择性地裂解烯丙基酯，粗产物经温和的银介导脱羧反应处理。此步骤是合成过程中的关键环节。尤其重要的是需尽量缩短反应时间，并将温度保持在尽可能低的水平。经优化，最佳反应条件为使用乙酸银。最后，按照Zemplén去保护条件常规去除乙酰保护基。通过该方法，我们获得了多种吲哚醇糖苷，其收率达到迄今为止的最高水平。

一个模型实验展示了利用β-半乳糖苷酶对合成的X-Gal进行酶促水解。溶液中蓝色染料的形成清晰地表明了酶的活性。对该概念的进一步拓.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸酐	Grüssing	10298	腐蚀性，易燃
乙腈	Sigma-Aldrich	608-001-00-3	有害，易燃
烯丙醇	Aldrich	453021	有害，对环境有害
Amberlite IR-120 H+	Fluka	06428	刺激性
溴乙酸	Merck	802260	腐蚀性，有毒，对环境有害
4-溴-3-氯-2-甲基苯胺	ABCR	AB 171687	刺激性
二氯甲烷	ACROS	326850010	有害
乙醚	Grüssing	10274	有害，极度易燃
二甲基甲酰胺	ACROS	348430010	有害，易燃
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	41648
乙酸乙酯	Sigma-Aldrich	607-022-00-5	刺激性，易燃
乙二胺四乙酸	AppliChem	A1103.0500	刺激性
β1,3-半乳糖苷酶，重组，E. coli	Calbiochem	345795
盐酸	VWR	20252.290	腐蚀性
硫酸镁水合物	Merck	105885
甲醇	ACROS	326950010	有毒，易燃
吗啉	Janssen Chimica	15.868.57	腐蚀性，易燃
石油醚	Azelis	111053	易燃，刺激性，对环境有害
碳酸钾	Grüssing	12005	腐蚀性
高锰酸钾	Grüssing	12056	有害，氧化性
叔丁醇钾	Merck	804918	腐蚀性，易燃
吡啶	Sigma-Aldrich	613-002-00-7	有害，易燃
乙酸银	Fluka	85140	刺激性，对环境有害
碳酸氢钠	Grüssing	12144	腐蚀性
氢化钠	Merck	814552	腐蚀性，易燃
氢氧化钠	Riedel-de Häen	S181200	腐蚀性
甲醇钠	Merck	806538	腐蚀性，易燃
硫酸钠	Grüssing	12175
四丁基氢硫酸铵	Lancaster	5438	有害
四氢呋喃	Sigma-Aldrich	87371	有害，易燃
四（三苯基膦）钯(0)	Sigma-Aldrich	216666
三光气	Fluka	15217	有毒
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐	Sigma	T-3253	刺激性