比较非洲化蜜蜂与欧洲蜜蜂所产蜂粮中的营养成分及其对血淋巴蛋白浓度影响的方法

摘要

本文介绍了两种亚种蜜蜂将花粉转化为蜂粮前后，对花粉中营养成分进行定量的方法。我们描述了测定这两种亚种蜜蜂消耗蜂粮的情况及其体内蛋白质浓度的技术。

摘要

蜜蜂通过采集花粉并将其储存在蜂巢中形成蜂粮来获取营养。我们开发了通过将蜂群置于特别构建的封闭飞行区域内，以控制蜜蜂采集并转化为蜂粮的花粉来源的方法。同时建立了分析花粉和蜂粮中蛋白质及氨基酸组成的方法。我们还描述了如何测量蜂粮的摄食量，以及在成年工蜂羽化后分别饲喂蜂粮4天、7天和11天后测定其血淋巴蛋白质浓度的方法。这些方法被用于研究基因型是否影响花粉向蜂粮的转化过程，以及蜜蜂对蜂粮中蛋白质的摄食与吸收速率。实验中为两个亚种（欧洲蜜蜂和非洲化蜜蜂，分别简称为EHB和AHB）提供了相同的花粉来源。根据所建立的方法，由两个亚种制成的蜂粮其蛋白质浓度和pH值均低于原始花粉。总体而言，EHB或AHB制成的蜂粮中氨基酸浓度相似，且均高于原始花粉中的含量。AHB和EHB均显著更偏好摄食由AHB制成的蜂粮，而非由EHB制成的蜂粮。尽管EHB和AHB对每种蜂粮的摄食量相似，但AHB的血淋巴蛋白质浓度高于EHB。AHB与EHB在蛋白质获取能力上的差异可能反映了各自在演化过程中对原生地理区域环境的适应性。这些差异可能有助于解释非洲化蜜蜂种群在新大陆成功建立的原因，因其对幼虫培育和蜂群增长具有积极影响。

引言

营养在蜜蜂蜂群的健康和活力以及种群建立过程中起着基础性作用。食物中的营养物质提供能量以及育雏、体温调节、觅食和免疫反应所需的生化组分。对于蜜蜂蜂群而言，用于发展种群数量并维持其健康的营养物质来源于花蜜和花粉。花蜜提供碳水化合物，而花粉则满足其他膳食需求，如蛋白质、脂类、维生素和矿物质¹。

不同亚种的蜜蜂在基于营养的群体水平参数上可能存在差异，例如工蜂寿命、育雏能力以及社会免疫机制^2-6。这些差异可能与蜂群对食物（尤其是花粉）的处理方式以及个体对花粉的消化过程有关。花粉被储存在蜂巢巢房中，并通过微生物介导的乳酸发酵发生化学变化^7-10。经过发酵的花粉被称为蜂粮。不同亚种之间可能在从其所采集和储存的花粉中获取营养物质的能力方面存在基因型差异，这可能影响蜂群的生长和存活。在其他生物中，已有研究记录了基因型对食物加工和营养吸收的影响，表明在摄取相同食物的情况下，某些个体比其他个体能够获取更多的营养物质和热量^11-14。

本文描述了用于比较不同亚种蜜蜂所产蜂粮的成分及其消耗情况的方法，同时也介绍了测定工蜂血淋巴蛋白浓度的方法。以往关于蜂粮营养成分的研究均以欧洲蜜蜂（EHB）为对象开展。 ^10,15,16然而，即使采集相同的花粉，不同亚种蜜蜂所生产的蜂粮也可能存在差异。本研究选择比较欧洲蜜蜂（EHB）和非洲化蜜蜂（AHB），因为这两个亚种在行为和生理上具有显著差异，这些差异可能与食物加工和营养获取相关。 ¹⁷一些最显著的差异在于，与欧洲蜜蜂相比，非洲化蜜蜂采集并消耗更多的花粉，且似乎能更高效地将花粉转化为蜂子。 ¹⁸AHB 菌落的分巢率高于 EHB，且在食物资源受限时会弃巢迁离 ^19-23. 东方蜜蜂中逃群现象较为罕见。与东方蜜蜂相比，西方蜜蜂具有更高的代谢速率 ²⁴. EHB与AHB在群体水平上的营养差异可能与花粉采集速率及其营养成分有关（例如氨基酸和蛋白质）转化为蜂粮后获得。蜂粮的摄食及由此带来的蛋白质获取，可能在欧洲蜜蜂（EHB）与非洲化蜜蜂（AHB）的群体差异中发挥作用。利用所建立的方法，EHB 和 AHB 从相同的花粉来源制作蜂粮，随后将这些蜂粮回喂给各自亚种的蜜蜂，从而可判断蜜蜂获取蜂粮中蛋白质的方式是取决于其亚种特性，还是取决于蜂粮的来源。

方案

1. 从 AHB 和 EHB 蜂群中获取蜂粮

1. 在蜜蜂蜂群上安装花粉采集器并收集花粉。使用咖啡研磨机将花粉研磨成细粉（类似于花药自然散出的花粉）。
2. 在封闭飞行区（EFA）内分别建立5个非洲化蜜蜂（AHB）和欧洲蜜蜂（EHB）蜂群，使蜜蜂仅采集所提供的花粉。为防止工蜂在AHB和EHB蜂群之间游走，将EFA划分为相互隔离的区域，使蜜蜂无法在各区域间穿行。在EFA的每个区域中放置一个独立的EHB或AHB蜂群，包含3,500–4,000只工蜂、带有花蜜、蜂蜜、未成熟子脾和空巢脾的蜂蜡巢脾。
   注意：建立蜂群时不应含有储存花粉。通过不在蜂群中引入产卵蜂王，可提高花粉储存速率。
3. 通过在EFA的每个区域放置盛有花粉的托盘来饲喂研磨花粉。每张托盘上铺约60 g花粉，使采集蜂可将其作为花粉团采集，并以蜂粮形式储存在蜂群中。持续每天在每张托盘上提供新鲜花粉，共持续3周。
4. 将来自欧洲蜂群的蜂粮称为欧洲蜂粮（EBB），来自非洲化蜂群的蜂粮称为非洲化蜂粮（ABB）。

2. 蜂群在蜂笼中的饲喂

1. 将来自非洲化蜜蜂（AHB）和欧洲化蜜蜂（EHB）蜂群的封盖工蜂蛹框分别放置于环境室内的羽化笼中，环境室温度设置为32-34 °C，相对湿度为40%。
2. 当工蜂羽化并达到约24小时龄时，准备12个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）生物测定笼（尺寸 = 11.5 × 7.5 × 16.5 cm³），每个笼中放入100只新羽化的EHB工蜂或100只新羽化的AHB工蜂。在每个笼中放入一段已知数量的蜂房，蜂房内含有欧洲蜜蜂幼虫（EBB）或非洲蜜蜂幼虫（ABB）（每笼24-30个蜂房），以形成以下处理组合：喂食ABB的AHB、喂食ABB的EHB、喂食EBB的AHB和喂食EBB的EHB（共4种处理，每种处理6个重复笼，总计24个笼）。
3. 向每个笼中添加装有水和按体积配制的50%蜂蜜水溶液的试剂瓶。在为期11天的研究期间，每天补充蜂蜜水溶液。

3. 采集工蜂和蜂粮并估算消耗量

1. 在将新羽化的EHB和AHB工蜂放入蜂笼之前，采集10只样本。将这些蜜蜂称为第0天（Day 0）蜜蜂，用作血淋巴蛋白浓度的基线参照。
2. 在蜜蜂分别取食EBB或ABB第4、7和11天后，从每个蜂笼中取出10只蜜蜂。
3. 将活体蜜蜂分别放入微量离心管中，并置于冰袋上。从中选取4只蜜蜂的亚样本，用于血淋巴蛋白浓度分析。
4. 在第11天采样结束后，统计每个蜂巢中仍含有蜂粮的巢房数量。该数值作为蜂粮消耗量的相对指标。
5. 从各蜂笼的巢房中移除剩余蜂粮，并按蜂笼分别储存于不同的微量离心管中。将蜂粮样品保存在-80 °C条件下，待后续分析其pH值、可溶性蛋白浓度及氨基酸含量。

4. 花粉和蜂粮pH值的估算

1. 取六份随机的0.3 g蜂群EFA中喂给蜜蜂的花粉样品，溶于300 µl蒸馏水中。使用精度为+0.01的防水双结pH探针测量pH值。
2. 取每个蜂笼在11天饲喂期后剩余的0.3 g蜂粮样品。将蜂粮溶于300 µl蒸馏水中，并按照花粉的方法（4.1）测量pH值。

5. 蛋白质分析

1. 从每个蜂箱中取六份花粉样品以及一份EBB和ABB样品。将样品储存于-20 °C，直至进行可溶性蛋白浓度分析。
2. 将20 mg花粉或蜂粮与1,000 µl的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）混合。
3. 涡旋振荡混合物10秒，并在571.2 × g下离心1分钟。
4. 取10 µl上清液，加入96孔平底EIA/RIA聚苯乙烯板的孔中。每个样品设三个重复孔。
5. 通过将已加热并拉制成针尖状的20 μl毛细管插入蜜蜂胸部右侧翅基附近区域，采集来自各蜂箱蜜蜂的血淋巴。如有需要，可将同一毛细管插入腹部背板间的膜质区域以收集更多血淋巴。
6. 将1 μl血淋巴加入9 μl的0.1 M PBS中。将血淋巴溶液储存于-20 °C，直至进行可溶性蛋白分析。
7. 使用商用Bradford蛋白检测试剂盒测定花粉、蜂粮和血淋巴样品中的总可溶性蛋白浓度。按照制造商说明书操作。
8. 利用已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）建立标准曲线，通过分光光度计在595 nm处测定蛋白吸光度，以估算样品中的可溶性蛋白浓度。

6. 氨基酸分析

1. 将每个蜂群蜂房中的个体样本混合，制成代表性的蜂粮（EBB）和蜂花粉（ABB）分析样本。
2. 取50 mg花粉或蜂粮样本，称重后放入自动进样瓶中，加入1 ml蒸馏水以及100 µl浓度为50 ng/μl的内标溶液，内标溶液包含d₄-丙氨酸、d₂₃-月桂酸、¹³C₆-葡萄糖和d₃₉-花生酸。
3. 盖紧瓶盖，超声处理5分钟。
4. 使用HLB固相萃取小柱，先加入1 ml甲醇进行活化，再加入1 ml蒸馏水平衡，随后加入1 ml蜂粮或花粉样本。用1 ml 5.0%甲醇/水（MeOH/H₂O）洗涤小柱，最后用1 ml 80%甲醇/水（MeOH/H₂O）洗脱。
5. 在氮气流下将洗脱液吹干。用50 µl吡啶和100 µl N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（BSTFA + TMCS）重新溶解残渣。
6. 盖紧瓶盖，在70 °C下孵育30分钟。
7. 让样本冷却后转移至洁净的自动进样瓶中。
8. 盖紧瓶盖，将样本放入与气相色谱仪联用的质谱选择性检测器中，用于分析挥发性化合物和有机酸。采用TMS衍生化（使用BSTFA + TMCS）后，通过一根（30 m × 0.25 mm内径）且膜厚为1.0 µm的色谱柱分离糖类和有机酸。
9. 设定色谱柱 oven 初始温度为50 °C，保持2分钟，然后以5 °C/min的速率线性升温至290 °C，并保持7分钟。设定气相色谱进样口和气相色谱/质谱接口温度分别为250 °C和290 °C。
   1. 使用氦气作为载气，流速为1.0 ml/min。设定质谱离子源温度为230 °C。
10. 每天使用全氟三丁胺（PFTBA）对质谱仪进行调谐和校准。采用1 µl PFTBA进样，在全扫描模式（35–700 amu）正离子模式下获取数据，用于分析氨基酸的存在及其浓度。

结果

蜂粮在分析pH值和蛋白质浓度前于-80 °C保存不超过一个月，进行氨基酸分析前约保存4个月。蜂粮的pH值和蛋白质浓度与花粉不同（图1）。蜂粮的pH值和蛋白质浓度均低于花粉。无论是欧洲蜜蜂（EHB）还是非洲化蜜蜂（AHB），其对ABB的摄食量均高于EBB（图2）。

无论食用何种蜂粮，非洲化蜜蜂（AHB）血淋巴中的可溶性蛋白水平均显著高于欧洲蜜蜂（EHB）（图3）。尽管欧洲蜜蜂和非洲化蜜蜂摄食各类蜂粮的量相似，但其血淋巴蛋白水平仍存在上述差异。采样时蜜蜂的年龄对血淋巴中可溶性蛋白浓度有显著影响。第4天蜜蜂的蛋白浓度显著低于第7天和第11天的蜜蜂，而第7天与第11天之间的蛋白浓度无显著差异。

在对蜜蜂生长发育至关重要的10种必需氨基酸中，除组氨酸外，其余均在花粉中被检测到。大多数情况下，蜂粮中测得的氨基酸浓度高于花粉（图4）。例如，蜂粮中亮氨酸和苏氨酸的浓度比花粉高出约60%，缬氨酸浓度则高出约25%。丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸的含量在蜂粮中也高于花粉。除苯丙氨酸和半胱氨酸外，美洲蜜蜂（ABB）与欧洲蜜蜂（EBB）之间的氨基酸浓度差异不大。ABB中苯丙氨酸的含量约为EBB或花粉的两倍。EBB中半胱氨酸的浓度低于ABB或花粉。色氨酸是唯一一种在花粉中浓度高于EBB或ABB的氨基酸。花粉和ABB中脯氨酸的浓度高于EBB。

图1：欧洲蜜蜂（EHB）和非洲化蜜蜂（AHB）的花粉及其所酿蜂粮中pH值（A）和可溶性蛋白浓度（B）的比较。经方差分析（F_2,12 = 3725，p <0.0001）及Tukey W-多重比较检验，花粉的pH值显著高于蜂粮。花粉中的蛋白质浓度也显著高于EHB（EBB）或AHB（ABB）所酿蜂粮（F_2,27 = 16.49；p <0.0001）。均值后标有相同字母者在0.05水平上无显著差异。

图2： 在11天时间内，笼养蜜蜂完全消耗含蜂粮蜂房的平均百分比。 蜂粮由使用相同花粉来源的欧洲蜂（EHB）或非洲化蜂（AHB）所酿制。每种处理方式的数据均来自五个蜂笼的平均值；经单因素方差分析（F_3,16 = 7.3, p = 0.003）和Tukey’s W检验，在0.05水平上具有相同字母标记的均值之间无显著差异。本图改编自²⁵。

图3： 饲喂由欧洲蜂（EBB）或非洲化蜂（ABB）所产蜂粮的欧洲蜂（EHB）或非洲化蜂（AHB）在饲喂4、7和11天后血淋巴中平均蛋白质浓度。 重复测量方差分析显示，4个处理组之间存在显著差异（F_3,20 = 19.7，p <0.001）。饲喂ABB的AHB个体血淋巴中可溶性蛋白水平显著高于饲喂ABB的EHB个体（p = 0.008）或饲喂EBB的EHB个体（p = 0.018）。采样时蜜蜂的年龄显著影响血淋巴中可溶性蛋白浓度。第4天蜜蜂的蛋白水平显著低于第7天（p <0.0001）或第11天（p = 0.001）的个体。第7天与第11天之间则无显著差异（p = 0.149）。本图经修改自²⁵ 。

图 4： 花粉或由其制成的蜂粮中氨基酸浓度（每克花粉或蜂粮中的微克数）。 EBB 是由欧洲蜜蜂制成的蜂粮，ABB 是由非洲化蜜蜂制成的蜂粮。为清晰展示含量，色氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸被单独绘图。此图已根据文献²⁵修改。

讨论

通过上述方法，我们发现非洲化蜜蜂（AHB）所制作的蜂粮被非洲化蜜蜂和欧洲化蜜蜂（EHB）均消耗得更多。尽管欧洲化蜜蜂和非洲化蜜蜂对每种蜂粮的摄食量相似，但非洲化蜜蜂的血淋巴蛋白滴度更高。本研究方法所得结果与以往报道一致：在饲喂相同饮食的情况下，非洲化蜜蜂的血淋巴蛋白水平高于欧洲化蜜蜂²⁶。通过测量欧洲化蜜蜂和非洲化蜜蜂对欧洲蜂粮（EBB）和非洲蜂粮（ABB）的摄食量（两者摄食速率不同），结果表明，增加食物摄入量并不能提高每个亚种的血淋巴蛋白浓度。似乎在哺育蜂龄工蜂中，血淋巴蛋白浓度存在一个平台期，而该平台期的设定点在非洲化蜜蜂中高于欧洲化蜜蜂。

建立蜂群以生产蜂粮时，需满足若干重要条件，以优化花粉储存速率。首先，蜂群必须拥有带有开放型幼虫的巢脾；若无幼虫需要饲喂，工蜂将不会大量采集花粉。其次，蜂群必须处于无王状态，以避免产生新的幼虫。因为培育幼虫需要大量花粉，只有多余的花粉才会被储存。在EFA中建立的小型蜂群若持续扩大育虫区，则可用于储存为蜂粮的花粉将非常有限，因此蜂群必须无王。最后，要形成蜂粮，花粉必须以团块形式由工蜂后足花粉篮采集，并储存在巢房中。若花粉是通过花粉收集器采集的，则必须先将其研磨成细粉后再提供给蜜蜂，以便它们能够以团块形式采集并储存。

测量蜂粮消耗量的方法仅能提供定性而非绝对定量的估计结果。统计时仅将蜂房内蜂粮被完全取食的情况计为消耗。若要更准确地估算蜂粮的总消耗量，可将蜂房中的蜂粮取出并制成饼状，在研究周期前后称重。然而，我们希望将蜂粮保留在蜂房中，以便蜜蜂能够像在蜂群中一样自由取食，并可能在研究期间继续对其进行加工处理。研究前后蜂巢片重量的差异未被用作消耗量的估算依据，因为蜜蜂可能将饲喂给它们的稀释蜂蜜存入部分蜂房，从而导致重量增加。

工蜂在饲喂期间也可能将部分稀释的蜂蜜添加到了蜂粮中。由于这些原因，我们统计了饲喂前后蜂粮量大致相等的蜂房，以此获得定性测量结果。然而，饲喂11天后，与EBB相比，两种蜂粮在空蜂粮房（ABB）数量上存在显著差异。

确定储存的花粉何时转变为蜂粮较为困难，因为蜜蜂会持续向蜂巢中添加花粉。用于生产蜂粮的蜂群在建立时配备了带有开放型幼虫的巢框，以促使蜜蜂采集花粉。然而，这些蜂群无蜂王，因此仅在蜂群建立后的约9天内有幼虫需要饲喂。在蜂群处于EFA环境的其余3周时间内，蜜蜂采集的花粉被储存并逐渐转化为蜂粮。在将储存的花粉饲喂给笼中蜜蜂时，额外延长11天的存放时间，也可能进一步促进了花粉向蜂粮的转化过程。花粉转化为蜂粮的过程大约需要7天⁸。饲喂给EHB和AHB的蜂粮相比所饲喂的花粉，其pH值更低，蛋白质浓度也有所降低。其他研究者也曾报道过花粉转化为蜂粮后发生类似变化的结果^7,10,27。然而，我们的研究结果与以往报道不同之处在于，蜂粮与花粉之间某些氨基酸的浓度存在差异。蛋白质和氨基酸浓度的变化可能是由于蛋白水解酶的活性所致，这些酶的来源可能是蜜蜂自身，也可能是蜂粮中定植的微生物群落^7,8,28,29。

用于测定蛋白质浓度的方法与先前报道的用于确定膳食蛋白质对非洲化蜜蜂和欧洲蜜蜂影响的方法相似²⁶。作为这些方法的延伸，我们能够估算花粉和蜂粮中的可溶性蛋白质含量。这些方法所得结果与先前的研究报道相似^7,10,27。我们的研究结果进一步提供了证据，表明非洲化蜜蜂（AHB）比欧洲蜜蜂（EHB）更高效地同化膳食蛋白质，这可能是非洲化蜜蜂在大多数迁入并定殖地区占据生态优势的关键因素^30-32。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
防水双接界 pH 探针	Thermo Fisher
咖啡研磨机	Mr. Coffee	型号 1DS77
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Emd-millipore	BSS-1005-B
EIA/RIA 聚苯乙烯板	Sigma-Aldrich-Corning	CLS3590-100EA
微量毛细移液管	Kimble Glass Inc.
Quick Start Bradford 蛋白质测定试剂盒 2	Bio-Rad	#500-0202
分光光度计	Biotek Synergy HT
质谱选择检测器	Agilent	5973N
HLB 小柱
气相色谱仪	Agilent	6930
气相色谱柱	A J&W Scientific	DB-1701
d4-丙氨酸	Sigma-Aldrich	488917
d23-月桂酸	Sigma-Aldrich	451401
13C6-葡萄糖	Sigma-Aldrich	389374
吡啶	Sigma-Aldrich	270970
N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺 +
三甲基氯硅烷 (BSTFA + TMCS)	Sigma-Aldrich	33148
全氟三丁胺 (PFTBA)	Sigma-Aldrich	442747-U
d39-花生酸	Cambridge Isotope