为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。
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摘要
摘要
Müller 细胞是视网膜的主要胶质细胞。它们的终足在视网膜的外限界膜和内限界膜（ILM）处构成视网膜的边界，并与星形胶质细胞、周细胞和内皮细胞共同形成血-视网膜屏障（BRB）。BRB 限制了血液与视网膜之间的物质转运，而 ILM 作为基底膜，在组织学上定义了视网膜与玻璃体腔之间的分界。标记 Müller 细胞对于研究视网膜屏障的物理状态尤为重要，因为这些细胞是 BRB 和 ILM 的组成部分。BRB 和 ILM 在视网膜疾病中常发生改变，并导致疾病的症状。
目前已有多种成熟的方法用于研究血-视网膜屏障（BRB）的完整性，例如伊文思蓝检测法或荧光素眼底血管造影。然而，这些方法无法提供关于BRB对纳米尺度较大分子通透程度的信息。此外，它们也无法反映其他视网膜屏障（如内界膜，ILM）的状态。为了同时研究BRB通透性及视网膜ILM的情况，我们采用了一种基于腺相关病毒（AAV）的方法，该方法不仅可提供BRB对较大分子通透性的信息，还能指示疾病状态下ILM及细胞外基质蛋白的状态。其中，AAV5和ShH10两种AAV血清型适用于此类研究。AAV5 对光感受器具有天然趋向性，但当内界膜（ILM）完整时，玻璃体腔注射无法使其穿透到达外层视网膜（即， 在野生型视网膜中）。ShH10 对胶质细胞具有强趋向性，可在健康和病变的视网膜中选择性地标记穆勒胶质细胞。在内界膜（ILM）受损的视网膜中，ShH10 可实现更高效的基因递送。这些病毒工具结合免疫组织化学与血液-DNA 分析，有助于揭示疾病状态下视网膜屏障的改变情况。
引言
Müller细胞是视网膜主要的胶质成分。形态学上，它们以放射状贯穿整个视网膜，其末端足突与玻璃体接触，朝向内界膜（ILM），并分泌后者的部分成分。ILM是一种基底膜，由约十种不同的细胞外基质蛋白组成（包括层粘连蛋白、agrin、perlecan、nidogen、胶原蛋白以及多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）。在发育过程中，ILM的存在对视网膜组织发生、视神经轴突的导向以及 神经节细胞的存活至关重要1-3。然而，在成年视网膜中ILM并非必需，可在某些病理情况下通过手术切除而不引起视网膜损伤4。在基因治疗中，该膜会成为通过玻璃体内注射腺相关病毒（AAV）实现视网膜高效转导的物理屏障5。
通过其突起的广泛分支，穆勒细胞为视网膜神经元和血管细胞提供营养和调节支持。穆勒细胞还参与视网膜稳态的调节以及血-视网膜屏障（BRB）的形成与维持6。视网膜毛细血管内皮细胞、穆勒细胞、星形胶质细胞和周细胞之间的紧密连接构成BRB。BRB可阻止某些物质进入视网膜。在糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞及呼吸系统疾病等多种疾病中，视网膜缺氧会导致BRB发生渗漏7-9。这种屏障破裂与血管通透性增加相关，进而引起血管源性水肿、视网膜脱离和视网膜损伤。
Müller细胞与血管和基底膜紧密相连，在血-视网膜屏障（BRB）和内界膜（ILM）的完整性中发....
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方案
本研究中使用的所有动物均按照眼科与视觉研究动物使用ARVO声明的规定进行饲养和处理。
1. 通过瞬时转染 HEK-293 细胞生产重组腺相关病毒（rAAV）17,18
注：参见 McClure C, JoVE (2011)19。
- 纯化大量质粒制备物（至少 1 mg/ml）的 AAV 载体质粒。使用 3 种质粒：携带复制和衣壳基因但不含 AAV 反向末端重复序列 ITR 的 AAV 辅助质粒，携带 AAV ITR 的转基因表达盒（称为转移质粒），以及提供腺病毒辅助基因 E2、E4 和 VA RNA 基因的质粒（称为 pHELPER）。
- 使用聚乙烯亚胺（或其它转染试剂）将上述 3 种质粒共转染至 293 细胞中。转染效率需高于 80%，以获得良好的病毒产量。
- 通过碘克沙醇梯度从 293 细胞裂解液中纯化重组 AAV。使用 15%、25%、40% 和 60% 的碘克沙醇形成梯度。收集含有 AAV 颗粒的 40% 碘克沙醇组分，在 500,000 × g 条件下超速离心 1 小时后浓缩，并用含 0.001% Pluronic 的 PBS（磷酸盐缓冲盐水） 进行缓冲液置换。
- 为测定病毒基因组滴度20，进行 DN....
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结果
若动物模型显示内界膜（ILM）结构出现紊乱，我们预期使用ShH10可增强对视网膜穆勒胶质细胞的转导。图 2A-B）。例如，我们已证明在缺乏 Dp71 的情况下， ShH10通过玻璃体内注射可特异性靶向 Müller胶质细胞，且效率更高，表明与野生型小鼠相比，该小鼠品系的内界膜（ILM）通透性增加16 (图2C-F).
AAV5 还可用作 ILM 通透性的指示剂。AAV5 在野生型小鼠中通过玻璃体内注射无效，但在视网膜屏障受损的小鼠（如 Dp71-null 小鼠）或其他视网膜变性模型小鼠中，对光感受器的基因递送效果显著增强1622（图 2G-H）。这进一步证实了视网膜神经元周围细胞外基质中 ILM 的结构紊乱及通透性可能增加。
我们发现，Dp71基因敲除.......
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讨论
血-视网膜屏障（BRB）调控血液与视网膜之间的分子交换。BRB的破坏与多种疾病相关，例如糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性（AMD）。我们近期研究表明，在一种表现出BRB通透性的抗萎缩蛋白（dystrophin）基因敲除小鼠模型中，视网膜对腺相关病毒载体（AAV）介导的基因递送更为敏感。然而，尽管BRB具有通透性，在该模型中经眼内注射的AAV颗粒仍局限于眼部腔室。我们的结果表明，针对存在BRB通透性疾病的基因治疗并不会带来额外的全身性副作用风险。此外，这些结果支持了在视网膜疾病过程中其他屏障（如内界膜ILM）也会受损，从而使得病毒颗粒更易进入的观点。我们的发现提示，编码报告基因的AAV是研究视网膜疾病动物模型中BRB通透性和ILM完整性的优良工具。特别是AAV变体ShH10，因其可特异性标记Müller胶质细胞，可作为标记视网膜胶质细胞并报告视网膜在疾病响应下状态的工具。ShH10可在健康和病变的视网膜中选择性地标记Müller胶质细胞。然而，ShH10及其他AAV在屏障受损的视网膜中均能实现更高效的基因递送。
应用上述方案时的一些关键步骤包括：（1）培养熟练的手动操作技巧以完成.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢巴黎视觉研究所成像平台的支持。感谢法国肌肉萎缩症协会（AFM）为O.V.提供博士奖学金，以及艾尔建公司（Allergan INC.）的支持。本工作在LIFESENSES卓越实验室（LABEX）[项目编号ANR-10-LABX-65]框架内进行，获得了由法国国家科研署（ANR）管理的法国国家资金支持。我们感谢Peggy Barbe和Mélissa Desrosiers在AAV制备方面的技术协助。我们衷心感谢Stéphane Fouquet在共聚焦显微镜技术上的出色支持，以及在结果解读方面提供的专业指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL6J 小鼠品系 | JANVIER LABS | 小鼠 | |
| 氯胺酮 500 | Virbac France | 麻醉剂 | |
| 赛拉嗪 Rompun 2% | Bayer Healthcare | 麻醉剂 | |
| 新福林 5% Faure | Europhta | 扩瞳剂 | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | 扩瞳剂 | |
| Sterdex | Novartis | 抗炎药 | |
| Cryomatrix 包埋树脂 | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus 黏附载玻片 | Thermo Scientific | 10143352 | 载玻片 |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Sigma | L9393 | 抗体 |
| 抗视紫红质克隆 4D2 | Millipore | MABN15 | 抗体 |
| 抗谷氨酰胺合成酶克隆 GS-6 | Millipore | MAB302 | 抗体 |
| 抗胶质纤维酸性蛋白抗体 | Dako | 334 | 抗体 |
| PNA 凝集素 | Invitrogen | L32459 | 探针 |
| Alexa Fluor 标记的二抗 | Invitrogen | 抗体 | |
| Fluorsave 封片试剂 | Calbiochem | 345789 | 封片介质 |
| QIAmp DNA 微量提取试剂盒 | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA 聚合酶 | Promega | M3001 | |
| 伊文思蓝染料 | Sigma | E2129 | 染料 |
| 5 µm 滤膜 | Millipore | ||
| 柠檬酸钠 | Sigma | S1804 | |
| 柠檬酸 | Sigma | C1909-2.5KG | |
| 光谱纯甲酰胺 | Sigma | 295876-2L | |
| 荧光素 | Sigma | F2456 | 染料 |
| Micron III | Phoenix Research Labs | 基于三芯片彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像 | |
| 胰岛素注射器 | Terumo | SS30M3109 | |
| 10 µl Hamilton 注射器 | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| RN G33 针头，25 mm，PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | 玻璃体内注射 |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | 多功能注射器，使用微量注射器递送皮升级体积 |
| UltraMicroPump (UMP3)（单通道）配 SYS-Micro4 控制器 | UMP3-1 | 数字控制器 | |
| 双目放大镜 SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | 0.66–5× 变倍，带LED照明立式支架，透射与反射光照明，用于视网膜解剖 |
| 直型弹簧剪刀 - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | 视网膜解剖 |
| 弯型 Vanna 剪刀 | 15004-08 | ||
| Dumont 5 号镊子 | 11254-20 | ||
| Veriti 96 孔梯度 PCR 仪 | Life technologies | 4375786 | PCR 仪 |
| 超声波清洗机 | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega 离心管 | VWR | ||
| 真空浓缩仪 | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| 荧光分光光度计 | TECAN | infinite M1000 |
参考文献
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E.
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重印与许可
