本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。
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本文内容
摘要
摘要
原子力谱学是研究表面和界面分子的理想工具。本文介绍了一种将多种单分子共价连接到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案。同时对AFM探针进行钝化处理，以防止探针与基底之间发生非特异性相互作用，这是研究连接在AFM探针上的单分子的前提条件。简要介绍了在固体表面和生物界面测定这些分子的黏附力、黏附长度和自由能的分析方法，并提供了进一步阅读的外部参考文献。示例分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺）。这些分子在不同溶剂条件下，从诸如CH3-自组装单层膜、氢终止金刚石以及支撑脂双层等不同表面被解吸。最后讨论了力谱单分子实验的优势，包括判断实验中是否真正研究了单个分子的方法。
引言
在过去的30年中，原子力显微镜（AFM）已成为研究生物体系的一种重要成像技术 1,2 和合成的 3 材料和表面，因为它能在三维空间中提供分子级别的空间分辨率，并可在多种溶剂环境中操作。此外，原子力显微镜-单分子力谱（AFM-SMFS）能够测量从皮牛顿（pN）到微牛顿（µN）范围的力，为研究蛋白质折叠等过程提供了前所未有的洞察 4,5，聚合物物理 6–8 ，以及单分子-表面相互作用9–12研究单个分子而非分子集合的 rationale 在于避免平均效应，这种效应常常会掩盖稀有事件或隐藏的分子状态。此外，大量分子参数（如轮廓长度、库恩长度、黏附自由能） 等等。 可以获得。这将在下文的示例中详细说明。在典型的原子力显微镜单分子力谱（AFM-SMFS）实验中，探针分子通过连接分子固定在非常尖锐的探针尖端上。该尖端位于一个可弯曲悬臂的末端。当尖端与表面接触时，探针分子将与该表面发生相互作用。通过监测尖端回撤过程中悬臂的偏转，可测定将分子从表面解离所需的力，进而获得其自由能。为了获得有意义的统计结果，必须采集大量所谓的力-距离曲线。此外，为了实现真正的单分子实验（即在整个实验过程中使用同一探针分子时，应将探针分子共价偶联至原子力显微镜（AFM）探针尖端。本文提供了一种通过共价键将单个分子固定于悬臂梁上的实验方案。....
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方案
注意：有关包含制备、数据采集和数据分析步骤的流程概述，请参见图2。
1. 试剂配制
注意：所有化学品均需谨慎操作，因此应穿戴实验服、手套和护目设备。所有操作必须在实验室通风橱中进行。特别是使用氯仿时，应佩戴专用手套。
- 使用含水量低的化学试剂，例如干燥的氯仿，并尽快使用，干燥储存时间不超过一周。将这两种试剂在 -20 °C 条件下保存于氮气或氩气环境中，因为 APTES ((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)（见表 1）和 PEG（聚乙二醇）具有吸湿性，且 PEG 在空气中易发生氧化。
- 为避免母液频繁暴露于空气中的氧气和湿气，建议分装成小份 aliquot，理想情况下在充满氮气的手套箱系统中进行操作。
2. 仪器设置
注意：为避免可能的交叉污染，每一步骤均应使用新鲜且洁净的容器。
- 将玻璃器皿和镊子置于洗涤剂溶液中，在60 °C超声浴中超声清洗30分钟。
- 用超纯水将步骤2.1中的器械彻底冲洗并超声清洗两次。
- 将步骤2.1中的器械置于RCA溶液（超纯水、过氧化氢和氨水（5:1:1））中，在烘箱中加热至75 °C，保持45分钟，随后用超纯....
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结果
下文展示了上述示例分子的实验结果，这些分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE。首先，针对每个示例，提供了数据采集和数据处理的实验特异性细节。随后，展示了这些分子从不同表面（CH3-自组装单分子层、氢终止金刚石和脂双层）解吸的典型实验结果。文中介绍了黏附力、黏附长度和自由能的测定方法。
示例1：聚酪氨酸从自组装单分子层的解吸
在不同乙醇含量的溶液中，测定了聚酪氨酸从疏水性自组装单分子层（SAM）上的解吸行为。在每种溶液中，按照前述方法测定悬臂梁InvOLS及弹簧常数，并针对每种溶液至少记录300条力-距离曲线。同一实验组的所有实验均在同一天使用同一个悬臂梁完成，以确保测量的是同一条单一的聚氨基酸链。悬臂梁的伸展/ retract速度为0.5 µm/sec，表面停留时间为1秒。力-距离曲线显示出恒定力的平台区域。每个平台区域均用S型曲线进行拟合，并确定平台力及平台长度，然后将其绘制成直方图。直方图采用高斯函数拟合，提取分布的峰值及.......
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讨论
在过去的几十年中，单分子实验为分子机制提供了前所未有的见解，并已成为生命科学及其他领域中一种极为宝贵的研究方法。为了从单分子力谱（SMFS）实验中获得良好且具有意义的统计结果，理想情况下应在整个实验过程中使用同一个分子。与分子群体实验不同，SMFS实验能够检测到罕见事件和隐藏的分子状态。单分子实验的另一个优势在于，它们可以通过分子动力学模拟进行建模24,25。
上述悬臂梁功能化方案是此前已发表方法的改进版本26–28。在活化和硅烷化之后，原子力显微镜（AFM）悬臂梁通过两种不同类型的聚乙二醇（PEG）分子（连接分子）的混合物进行功能化。
第一种连接子-PEG以惰性甲基基团终止（“甲基-PEG”），第二种则以氨基反应性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团（或巯基反应性的马来酰亚胺基团）终止，后续探针分子将与之偶联（“NHS-PEG”、“Mal-PEG”）。探针尖端功能化的示意图见图1。PEG的.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
作者感谢德国研究基金会（DFG，项目编号 Hu 997/2-2）提供的经费支持。FS 感谢汉斯·赛德尔基金会（HSS）的支持。SKr 在博士生项目“复杂界面材料科学”框架下得到了巴伐利亚精英网络的资助。SKi 感谢 SFB 863 提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| Hellmanex III 碱性液体浓缩液（洗涤剂溶液） | Hellma | ||
| RCA（超纯水、过氧化氢（35%）、氨水（32%）；5:1:1（v/v/v）） | Sigma | ||
| Vectabond 试剂 / APTES（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷 | Vectorlabs | ||
| 干燥丙酮（< 50 ppm H2O） | Sigma | ||
| 干燥氯仿（> 99.9%） | Sigma | ||
| 三乙胺 | Sigma | ||
| 超纯水 | Biochrom, Germany | ||
| 四硼酸钠（> 99.5%） | Biochrom, Germany | ||
| 硼酸 | Biochrom, Germany | ||
| 单功能 α-甲氧基-ω-NHS PEG，5 kDa，“甲基-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| 异双功能 α,ω-双-NHS PEG，6 kDa，“NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| 异双功能 α-马来酰亚胺己酸-ω-NHS PEG，5 kDa，“Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| 探针分子（聚合物、脂质、等） | |||
| 设备 | |||
| 足量带嘴玻璃结晶皿（10 ml）、玻璃培养皿（500 µl）和玻璃盖 | VWR International GmbH, Germany | ||
| [header] | |||
| 实验室烘箱型号 UF30 | Memmert, Germany | ||
| 温控超声仪 | VWR International GmbH, Germany | ||
| 等离子体系统 "Femto"，100 W | Diener, Germany | ||
| 每种有机溶剂各配备一支独立的玻璃注射器 | VWR International GmbH, Germany | ||
| 涡旋混合器 | VWR International GmbH, Germany | ||
| 微量离心管（0.5 ml 或 1.5 ml） | Eppendorf | ||
| 移液器：10–100 µl、50–200 µl 和 100–1,000 µl | Eppendorf | ||
| 配备温控液体池的原子力显微镜（例如 MFP-3D 配 BioHeater） | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| 柔软的氮化硅（SiN）悬臂梁，通常由氮化硅制成（弹性系数小于 100 pN/nm，例如 MLCT） | Bruker AXS, Santa Barbara |
参考文献
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
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重印与许可
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