通过原子力谱学研究单分子粘附

摘要

本文介绍了一种将多种单分子共价偶联到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案，并提供了测定这些分子在固体载体及生物界面黏附力和自由能的步骤与实例。

摘要

原子力谱学是研究表面和界面分子的理想工具。本文介绍了一种将多种单分子共价连接到原子力显微镜（AFM）探针尖端的实验方案。同时对AFM探针进行钝化处理，以防止探针与基底之间发生非特异性相互作用，这是研究连接在AFM探针上的单分子的前提条件。简要介绍了在固体表面和生物界面测定这些分子的黏附力、黏附长度和自由能的分析方法，并提供了进一步阅读的外部参考文献。示例分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺）。这些分子在不同溶剂条件下，从诸如CH₃-自组装单层膜、氢终止金刚石以及支撑脂双层等不同表面被解吸。最后讨论了力谱单分子实验的优势，包括判断实验中是否真正研究了单个分子的方法。

引言

在过去的30年中，原子力显微镜（AFM）已成为研究生物体系的一种重要成像技术 ^1,2 和合成的 ³ 材料和表面，因为它能在三维空间中提供分子级别的空间分辨率，并可在多种溶剂环境中操作。此外，原子力显微镜-单分子力谱（AFM-SMFS）能够测量从皮牛顿（pN）到微牛顿（µN）范围的力，为研究蛋白质折叠等过程提供了前所未有的洞察 ^4,5，聚合物物理 ^6–8 ，以及单分子-表面相互作用^9–12研究单个分子而非分子集合的 rationale 在于避免平均效应，这种效应常常会掩盖稀有事件或隐藏的分子状态。此外，大量分子参数（如轮廓长度、库恩长度、黏附自由能） 等等。 可以获得。这将在下文的示例中详细说明。在典型的原子力显微镜单分子力谱（AFM-SMFS）实验中，探针分子通过连接分子固定在非常尖锐的探针尖端上。该尖端位于一个可弯曲悬臂的末端。当尖端与表面接触时，探针分子将与该表面发生相互作用。通过监测尖端回撤过程中悬臂的偏转，可测定将分子从表面解离所需的力，进而获得其自由能。为了获得有意义的统计结果，必须采集大量所谓的力-距离曲线。此外，为了实现真正的单分子实验（即在整个实验过程中使用同一探针分子时，应将探针分子共价偶联至原子力显微镜（AFM）探针尖端。本文提供了一种通过共价键将单个分子固定于悬臂梁上的实验方案。该单个分子可通过氨基或巯基与AFM探针尖端连接。偶联过程可在多种溶剂（包括有机溶剂和水相溶剂）中进行，以适应所用聚合物的溶解特性。

第一部分描述了一种通过连接分子将单个分子（“探针分子”）共价连接到原子力显微镜（AFM）针尖的通用实验方案。该过程采用有机NHS或马来酰亚胺化学方法¹³。文中同时提供了三种示例分子的详细操作步骤，并介绍了数据采集与数据分析流程，以及进一步阅读的参考文献。三种示例分子分别为：（线性）聚合物酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS和脂质POPE。方案中还包括若干微小的调整步骤，例如用于共价连接半胱氨酸的方法。此外，还专门设置一节介绍不同表面的制备方法，如金刚石表面、CH₃-自组装单分子层以及脂双层。这些界面已被证实是良好的参照体系和典型示例。

方案

注意：有关包含制备、数据采集和数据分析步骤的流程概述，请参见图2。

1. 试剂准备

注意：所有化学品均需小心处理，因此应穿戴实验服、手套和护目设备。所有操作必须在实验室通风橱中进行。特别是使用氯仿时，应佩戴专用手套。

1. 使用含水量低的化学试剂，例如干燥的氯仿，并尽快使用，干燥储存时间不超过一周。将这两种试剂储存在 -20 °C 并置于氮气或氩气环境中，因为 APTES ((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷)（见表1）和 PEG（聚乙二醇）具有吸湿性，且 PEG 在空气中易发生氧化。
2. 为避免母液频繁暴露于大气中的氧气和湿气，建议分装成小份储存，理想情况下在充满氮气的手套箱系统中进行分装。

2. 仪器设置

注意：为避免可能的交叉污染，每一步骤均应使用新鲜且洁净的容器。

1. 将玻璃器皿和镊子置于洗涤剂溶液中，在60 °C超声浴中超声清洗30分钟。
2. 用超纯水将步骤2.1中的器械彻底冲洗并超声处理两次。
3. 将步骤2.1中的器械置于RCA溶液（超纯水、过氧化氢和氨水（5:1:1））中，在烘箱中加热至75 °C，保持45分钟，随后用超纯水冲洗。
4. 最后，在干燥氮气流下或烘箱中（100 °C，3小时）干燥玻璃器皿和镊子。

3. 尖端功能化

注意：使用镊子、容器 等等。 由不锈钢、聚四氟乙烯（PTFE）、玻璃或任何在有机溶液中化学性质稳定的材料制成（如适用）。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。所需孵育溶液的体积取决于悬臂芯片的数量。确保悬臂始终完全浸没在相应溶液中。

注意：使用通风橱以避免吸入有机蒸气。

1. 悬臂表面羟基（OH-基团）的形成（“活化”）（约0.5小时）：
   1. 使用镊子将新的悬臂芯片（材料：SiN，弹性系数：10–100 pN/nm）放置于洁净的玻璃载片上，并将其放入等离子体腔室（100 W）中。
   2. 抽真空至腔室压力约为0.1 mbar。
   3. 向腔室内充入氧气，随后再次抽真空。
   4. 启动等离子体处理（功率：20%，持续时间：15分钟，处理压力：0.25 mbar）。
2. 悬臂的氨基硅烷化（约1小时）：
   1. 在玻璃培养皿中配制2.5 ml APTES溶液（见表1）——建议在等离子体处理过程中完成此步骤。
   2. 等离子体处理结束后，立即将每个悬臂在丙酮中浸渍1秒，随后立即放入APTES溶液中。
   3. 在室温下孵育15分钟。
   4. 用10 ml丙酮小心冲洗悬臂芯片两次，再用10 ml氯仿冲洗一次。
   5. 可选的最后步骤：将上一步处理后的悬臂芯片置于洁净的玻璃载片上，在70 °C下烘烤30分钟。需注意，表面活化亦有其他替代策略，例如，紫外线处理¹²。
3. 聚乙二醇化（PEGylation，约2小时）：
   注意：请在进行氨基硅烷化的同时执行步骤3.3.1–3.3.4。NHS基团和马来酰亚胺基团在水性环境中易发生水解，而PEG本身在空气中易被氧化。因此，操作时间（尤其是各步骤之间的间隔）是关键参数。更多信息请参见¹³。
   1. 配制氯仿溶液（见表1）。
   2. 为避免冷凝，打开分装前应先将PEG粉末升温至室温，再称取所需质量。
   3. 为将聚合物或脂质与氨基偶联，分别将NHS-PEG-NHS（6 kDa）和甲基-PEG-NHS（5 kDa）溶于氯仿溶液中，涡旋至完全溶解。浓度请参见表1。
      1. 替代方案：为将含巯基的聚合物偶联，分别将Mal-NHS-PEG和甲基-PEG-NHS溶于氯仿溶液中。
   4. 根据需要混合溶液，以调节NHS或马来酰亚胺封端的PEG分子与甲基封端的PEG分子之间的特定摩尔比（通常为1:500）。需注意，最佳比例需通过一系列制备-实验循环迭代确定。
   5. 将悬臂芯片在PEG溶液中孵育1小时，孵育环境需为氯仿饱和气氛，以防止氯仿挥发。
4. 探针分子偶联（>1小时）：
   注意：在以下3.4.1–3.4.3中，描述了三种将不同探针分子共价偶联至AFM针尖的示例。每种分子均需调整相应方案。另需注意，示例1和3采用NHS化学法，而示例2中则通过马来酰亚胺化学法将巯基功能化的聚合物PI-g-PS偶联至PEG。详细信息请参见¹⁴。
   1. 针对多氨基酸聚合物聚-D-酪氨酸（40–100 kDa）
      1. 将聚酪氨酸偶联的探针分子溶于1 M NaOH中，调节浓度至1 mg/ml。
      2. 在功能化前，立即使用旋转脱盐柱（7 kDa截留分子量）将NaOH置换为硼酸钠缓冲液（pH 8.1）。
      3. 依次用5 ml氯仿、5 ml乙醇和5 ml硼酸缓冲液冲洗悬臂。
      4. 将悬臂芯片在聚酪氨酸硼酸缓冲液中孵育1小时，随后用硼酸缓冲液和超纯水冲洗。孵育后保存于超纯水中，直至测量。
   2. 针对具有线性主链（聚异戊二烯，119 kDa）并接枝侧链（聚苯乙烯，88 kDa）的聚合物¹⁴
      1. 将PI-g-PS溶于无水氯仿中，调节偶联溶液浓度至4 mg/ml。
      2. 用5 ml氯仿冲洗悬臂，并在偶联溶液中孵育至少1小时。
      3. 再次用5 ml氯仿冲洗，并将悬臂保存于氯仿饱和环境中（防止氯仿挥发），直至使用。
   3. 针对脂质POPE
      1. 将POPE溶于无水氯仿中，调节浓度至20 mM。
      2. 在将悬臂于脂质溶液中孵育1小时之前，先用5 ml乙醇和5 ml超纯水冲洗悬臂。
      3. 孵育后，依次用5 ml氯仿、5 ml乙醇和5 ml温热的超纯水冲洗悬臂（顺序不可更改），以去除未结合的探针分子并清除氯仿残留。功能化后的针尖应立即使用；或可选择保存于氯仿中，待需要时取出。

图1. (A) 以NHS化学为例的针尖功能化过程示意图。(B) 通过氨基将探针分子连接到针尖所采用的化学键合方式。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 表面准备

1. 自组装单分子层（SAM）
   注意：在第一个示例中，选择自组装单分子层作为表面。详细信息请参见文献¹⁵。
   1. 在超声波清洗机中，先用洗涤剂溶液清洗载玻片，再用超纯水清洗两次，每次30分钟。然后，作为额外的清洗步骤，将载玻片置于RCA溶液中（见步骤2.3），在75 °C下处理15分钟。
   2. 在真空镀膜仪中，将载玻片镀上10 nm铬镍层和100 nm金层。随后存放在冰箱中，并在进行下一步操作前，立即再次用RCA溶液清洗。
   3. 将上一步的载玻片置于2 mM 1-十二硫醇/乙醇溶液中孵育12小时。巯基与金表面结合，形成疏水性自组装单分子层。用乙醇和超纯水冲洗载玻片，然后用氮气流吹干。使用配备CCD相机的接触角测量仪，通过静态接触角测量确认所制备表面的疏水性¹⁰。
2. 氢终端金刚石
   注意：在第二个示例中，选择氢终端金刚石作为表面。表面制备方法如先前所述¹⁶。
3. 支撑脂双层
   注意：在最后一个示例中，使用支撑脂双层（SLB）作为表面。为获得此类表面，通过挤出法制备含有磷脂POPC的大单层囊泡（LUVs）溶液（0.1 mg/ml）。然后将50 µl LUV溶液滴加到新解理的云母片上（A = 1 cm²），孵育30分钟。最后用20 ml超纯水冲洗溶液。有关SLB制备的详细描述，请参见文献^17,18。

5. 数据采集

注意：实验中应使用能够在液体环境中进行测量的原子力显微镜（AFM）。数据采集与数据分析流程适用于任何型号的AFM。此外，在某些实验中，若能控制液体池内的温度将更具优势。悬臂梁的偏转通过激光束偏转法¹⁹检测，弹簧常数则采用热噪声法²⁰测定。

1. 将功能化悬臂梁插入适用于液体环境中测量的原子力显微镜悬臂梁支架中。
2. 将待取样的表面（制备方法见上文）放入原子力显微镜（AFM）中，并用液体覆盖。此时，悬臂和表面均应浸入液体中，且悬臂针尖朝向表面。请注意，在多数情况下，一滴液体已足够。无论如何，应避免液体蒸发。 例如， 通过使用封闭式液体池。
3. 如适用，调节控制器上的目标温度。
4. 让系统平衡至少半小时。
5. 将悬臂远离表面，记录其热噪声谱，以排除任何表面阻尼效应。注意，通常需要累积10个或更多谱图，以获得足够的信噪比。
6. 接近表面。注意，为了保持针尖几何形状和针尖功能化的完整性，必须小心进行接近过程。例如，可通过间歇接触模式实现这一操作。
7. 测定以 nm/伏特为单位的倒光学杠杆灵敏度（InvOLS）。通过将悬臂针尖推压至硬质表面来完成该测定。
   1. 通过测量压电陶瓷移动距离与光电二极管电压变化之间的斜率，确定InvOLS。对力-距离曲线中悬臂梁尖端与表面接触的部分进行直线拟合。在涉及软表面（如脂双层）的实验中，应在未被脂双层覆盖的区域（“缺陷位点”）执行此步骤。
8. 通过将热噪声谱拟合为谐振子模型来确定弹簧常数（pN/nm）。使用自动化软件功能进行弹簧常数测定；若无，则参考相关文献 ²⁰.
9. 开始实验。
   1. 在每种实验条件下记录大量力-距离曲线。通常采用以下实验参数值：采样率为 5 kHz，针尖速度为 1 µm/sec，回缩距离为 1 µm。
      注意：有时，根据所研究实验的动力学特性，可能需要让针尖与表面接触并保持一定时间（“停留时间”）。
      注意：本实验的具体参数可能与上述数值有显著差异。
   2. 在长期测量过程中，通过调整光电二极管的位置，定期将激光在光电二极管上的位置归零。
   3. 可选：每次力曲线测量后，将原子力显微镜探针重新定位至另一个 x-y 位置。
   4. 实验结束时，再次测定灵敏度和弹簧常数，以检验系统的稳定性和一致性。
      注意：比较实验前后弹簧常数和灵敏度也是一种确保系统特性及探针特性在实验过程中保持不变的方法。如果弹簧常数的差异不大（<如果差异在15%以内，可以取平均值，因为弹簧常数测定的固有不确定性也约为15%。对于更大的差异，建议首先找出并消除表观弹簧常数变化的原因，然后再继续后续实验。

6. 数据准备

注意：本节描述了通常独立于特定实验类型的通用数据准备步骤，包括将单位转换为牛顿和纳米，以及对数据进行校正。各类实验特有的数据分析将在下文相应的代表性示例部分简要介绍。

1. 通常通过自行编写的算法自动执行所有数据准备和分析步骤，例如，基于软件 IGOR Pro 6 的算法。
2. 将原始偏转信号（Defl）[V] 乘以 InvOLS [nm/V] 和弹簧常数 [nN/nm]，从而将其转换为力。
3. 对力进行偏移，使得探针远离表面时悬臂所受的力（未加载的悬臂）为 0 nN。
4. 计算实际的针尖位置（也称为相对于表面测量时的分离距离）z*，该位置考虑了悬臂的弯曲：
   
5. 对 z* 进行偏移，使得 z* = 0 对应于表面的 z 位置。
   注：此处 F 为作用在针尖上并导致悬臂弯曲的力（由步骤 6.2 确定），z 为测得的 z 传感器位置（由仪器直接给出），k 表示弹簧常数（由步骤 5.8 确定）。

图 2. 流程图，展示样品制备、数据采集和数据分析过程。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

下文展示了上述示例分子的实验结果，这些分子包括聚氨基酸聚酪氨酸、接枝聚合物PI-g-PS以及磷脂POPE。首先，针对每个示例，提供了数据采集和数据处理的实验特异性细节。随后，展示了这些分子从不同表面（CH₃-自组装单层膜、氢终止金刚石和脂双层）解吸的典型实验结果。文中介绍了黏附力、黏附长度和自由能的测定方法。

示例1：聚酪氨酸从自组装单层膜上的解吸

测量了聚酪氨酸在不同乙醇含量的溶液中从疏水性自组装单分子膜（SAM）上的解吸过程。在每种溶液中，悬臂梁InvOLS和弹簧常数均按前述方法测定，并且每种溶液至少记录300条力-距离曲线。同一实验组的所有实验均在同一天使用同一个悬臂梁完成，以确保测量的是同一条单一的聚（氨基酸）链。悬臂梁的伸展/回缩速度为0.5 µm/sec，表面停留时间为1秒。力-距离曲线显示出恒定力的平台区域。每个平台区域均用S型曲线进行拟合，并确定平台力及平台长度，然后绘制为直方图。直方图采用高斯函数拟合，提取分布的峰值及其标准偏差（误差）...

讨论

在过去的几十年中，单分子实验为分子机制提供了前所未有的见解，并已成为生命科学及其他领域中一种极为宝贵的研究方法。为了从单分子力谱（SMFS）实验中获得良好且具有意义的统计结果，理想情况下应在整个实验过程中使用同一个分子。与分子群体实验不同，SMFS实验能够检测到罕见事件和隐藏的分子状态。单分子实验的另一个优势在于，它们可以通过分子动力学模拟进行建模^24,25。

上述悬臂梁功能化方案是此前已发表方法的改进版本^26–28。在活化和硅烷化之后，原子力显微镜（AFM）悬臂梁通过两种不同类型的聚乙二醇（PEG）分子（连接分子）的混合物进行功能化。

第一种连接子-PEG以惰性甲基基团终止（“甲基-PEG”），第二种则以氨基反应性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团（或巯基反应性的马来酰亚胺基团）终止，后续探针分子将与之偶联（“NHS-PEG”、“Mal-PEG”）。探针尖端功能化的示意图见图1。PEG的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
Hellmanex III 碱性液体浓缩液（洗涤剂溶液）	Hellma
RCA（超纯水、过氧化氢（35%）、氨水（32%）；5:1:1（v/v/v））	Sigma
Vectabond 试剂 / APTES（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷	Vectorlabs
干燥丙酮（< 50 ppm H2O）	Sigma
干燥氯仿（> 99.9%）	Sigma
三乙胺	Sigma
超纯水	Biochrom, Germany
四硼酸钠（> 99.5%）	Biochrom, Germany
硼酸	Biochrom, Germany
单功能 α-甲氧基-ω-NHS PEG，5 kDa，“甲基-PEG-NHS”	Rapp, Germany
异双功能 α,ω-双-NHS PEG，6 kDa，“NHS-PEG-NHS”	Rapp, Germany
异双功能 α-马来酰亚胺己酸-ω-NHS PEG，5 kDa，“Mal-PEG-NHS”	Rapp, Germany
探针分子（聚合物、脂质、等）
设备
足量带嘴玻璃结晶皿（10 ml）、玻璃培养皿（500 µl）和玻璃盖	VWR International GmbH, Germany
[header]
实验室烘箱型号 UF30	Memmert, Germany
温控超声仪	VWR International GmbH, Germany
等离子体系统 "Femto"，100 W	Diener, Germany
每种有机溶剂各配备一支独立的玻璃注射器	VWR International GmbH, Germany
涡旋混合器	VWR International GmbH, Germany
微量离心管（0.5 ml 或 1.5 ml）	Eppendorf
移液器：10–100 µl、50–200 µl 和 100–1,000 µl	Eppendorf
配备温控液体池的原子力显微镜（例如 MFP-3D 配 BioHeater）	Asylulm Research, Santa Barbara
柔软的氮化硅（SiN）悬臂梁，通常由氮化硅制成（弹性系数小于 100 pN/nm，例如 MLCT）	Bruker AXS, Santa Barbara