斑马鱼胚胎中的机械性血管损伤

摘要

本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中制造机械性血管损伤的方法。该损伤模型为研究止血、与损伤相关的炎症反应以及伤口愈合提供了一个理想的平台，适用于实时显微镜观察的生物体。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）胚胎已被证实是研究多种发育过程和疾病机制的有力模型。其体外发育和光学透明的特性使这些胚胎特别适合显微观察，且目前已拥有大量可利用荧光蛋白标记特定细胞类型的转基因品系，使得斑马鱼胚胎成为在活体（in vivo）条件下可视化观察血管、造血及其他细胞类型在损伤与修复过程中相互作用的理想系统。斑马鱼的正向和反向遗传学技术已相当成熟，也可进行药理学干预。本文描述了一种利用显微操作技术的机械性血管损伤模型，该模型结合了上述多种优势，可用于研究血管损伤后的反应，包括止血和血管修复过程。通过结合视频显微和延时成像技术，我们证明该血管损伤方法可产生可测量且可重复的止血及伤口修复反应。该方法为在完整动物模型中深入研究血管损伤与修复提供了有效系统。

引言

斑马鱼已被广泛用于研究血管生物学中的多种课题，包括血管发育、血管生成以及造血发育和病理过程^1-3。胚胎在受精后1天（dpf）即已发育出功能性循环系统，以及先天免疫系统的组分如白细胞等^1,4,5。其对损伤所引发的炎症反应和白细胞反应具有高度保守性，使斑马鱼胚胎成为研究结核感染、肠炎及组织再生等多种炎症过程的有用模型^6-9。斑马鱼胚胎已被用于研究与损伤相关的炎症，特别是在上皮损伤及中性粒细胞反应方面的研究^10,11。胚胎损伤会引发损伤部位细胞以及被募集至损伤处以响应并调控损伤修复过程的先天免疫细胞产生高度保守的细胞反应^11,12。其他损伤模型则采用聚焦激光脉冲，将损伤精确定位于特定细胞类型，包括神经元、肌细胞和心肌细胞^13-15。

斑马鱼胚胎已被用作研究在药物和遗传操作条件下止血和血栓形成的模型，该模型可利用机械性和激光诱导的血栓形成方法^16-19。凝血级联反应的组分似乎高度保守，而转基因技术使得研究人员能够详细研究血栓细胞和纤维蛋白在凝血部位的沉积过程^17,20,21。本文所介绍的方法进一步补充了这些技术，提供了一种用于研究机械性血管损伤所导致的血管破裂、血栓形成与消退以及血管修复的系统。

方案

注意：使用斑马鱼的实验程序已获得加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 工具的准备

1. 将微小针插入针座中并夹紧固定。
2. 使用尖头镊子小心弯曲针尖，形成轻微的钩状。
3. 为便于在损伤过程中操作和稳定胚胎，使用尖嘴钳弯曲安装在胰岛素注射器上的28号½英寸针头的末端。

2. 斑马鱼胚胎损伤实验的准备

1. 设置斑马鱼繁殖配对，并在卵水中（60 µg/mL 水族馆盐）收集卵，方法如前所述²²。
2. 在受精后约 8 小时（hpf）向卵水中添加 0.003% N-苯硫脲（PTU），以防止黑色素形成。
3. 实验前使用精细尖头镊子去除受精后两天（dpf）胚胎的绒毛膜。
   注意：血液循环开始后，胚胎可能在任何时候受到损伤。本文提供的数据针对 2 dpf 胚胎，但该技术已成功应用于长达 5 dpf 的胚胎。
4. 在操作前约 10 分钟，使用 0.02% 缓冲的 3-氨基苯甲酸（Tricaine）对胚胎进行麻醉。

3. 胚胎的机械性血管损伤

1. 使用转移移液管将麻醉后的胚胎转移至解剖体视显微镜下的凹面载玻片上。
2. 用惯用手持注射器针头的短平侧操作胚胎，将胚胎侧放，使其腹面背离针头。
3. 将微细针的尖端对准鱼体泄殖孔后方的腹面正中位置，并以轻微角度放置，使弯曲的针尖能够穿透表皮层，直接刺入尾静脉（图1）。
4. 利用注射器针头操控胚胎，通过轻敲使胚胎接触微细针，将针尖轻微钩入静脉，从而刺破尾静脉。
5. 使用注射器针头将胚胎从微细针上拉开，以在血管上造成微小撕裂。
   注意：成功的损伤将导致静脉立即出血。

4. 止血分析

1. 仅选择血液细胞明显循环的胚胎进行此操作。
2. 一旦将微细针从血管中拔出，立即准备开始计时。
3. 一旦可见伤口处开始失血，立即启动计时器。当伤口处失血停止时，停止计时，并将总时间记录为出血时间（Bleeding Time）。如果凝血受到抑制，记录至血液细胞不再明显循环时的时间。

5. 伤口愈合分析

1. 将损伤后的动物转移至玻璃底成像培养皿中，用于显微观察。
2. 移除大部分卵水。
3. 用含0.02% Tricaine的卵水溶解0.3-1.2%低熔点琼脂糖，加热至42至45 ºC，覆盖胚胎。
4. 使用镊子将胚胎侧向摆放。
5. 待琼脂糖冷却凝固后，向培养皿中加入含0.02% Tricaine的卵水。
6. 采用明场、落射荧光或共聚焦显微镜采集图像。
7. 用镊子将胚胎从琼脂糖中取出，并转移回卵水中。

结果

在2 dpf胚胎上进行机械性血管损伤（图2A-C）。损伤可引发快速且可重复的凝血反应，通过出血停止所需时间进行测定（图2D）。为了确定是否能够检测到凝血反应的差异，于损伤前立即通过注入柯氏管的方式向胚胎注射抗凝剂水蛭素（5–10 nl，浓度为1单位/µl的水蛭素溶于水中）（关于柯氏管注射的演示，请参见此前的JoVE文章²³²⁴）。损伤前给予水蛭素后，出血时间较溶剂对照组显著延长（图2D）。

通过表达内皮细胞标记物（kdrl:egfp）和红细胞标记物（gata1a:dsred）的转基因品系，可在损伤后立即观察到血管损伤和凝血的证据^25,26。采用落射荧光显微技术，每5分钟连续采集一次图像，持续12小时。不同伤口修复阶段的代表性静态图像如（图3）所示。结合微分干涉差（DIC）显微成像与荧光显微成像，可定量测定伤口修复过...

讨论

斑马鱼已被成功用作不同类型伤口的模型，包括激光损伤^13-15，激光诱导血栓形成¹⁶，以及上皮损伤¹⁰我们报道一种机械损伤方法，该方法操作简便，可产生可控的损伤 体内 适用于实时显微镜观察的模型。损伤可引发快速且可测量的止血反应，以及可重复的伤口修复过程，该过程可通过视频和延时显微镜进行监测。

其简单且模式化的血管解剖结构，使得可在明确且显微镜下可及的部位进行可重复的损伤操作，加之存在大多数血管和造血细胞类型，斑马鱼胚胎因此成为研究损伤反应的特别有用模型。然而，斑马鱼胚胎在发育的最初几周内缺乏功能性淋巴细胞^5,6，这使得该系统最适合用于研究先天免疫在炎症与修复过程中的作用。目前，已有大量转基因斑马鱼品系可供使用，其标记物可标记参与血栓形成、凝血、炎症以及伤口修复的细胞和蛋白质，包括标记血栓细胞、纤维蛋白原、红细胞、白细胞和血管内皮的品系^17,21,25-31。这些工具及其他技术手段使得深入细致地追踪止血与修复相关过程成为可能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微细针	Fine Science Tools	26002-10	针尖直径 0.0125 mm，杆径 0.1 mm
持针器	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 精细尖镊子	Fine Science Tools	11254-20
玻璃凹面载玻片	Aquatic Eco-Systems	M30
低熔点琼脂糖	Lonza	50081	预热至 42 º C
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma Aldrich	P7629
3-氨基苯甲酸（Tricaine）	Sigma Aldrich	E10521
水蛭素	Sigma Aldrich	H7016
玻璃底成像培养皿	Mattek	P35G-1.5-14-C
解剖显微镜	Olympus	SZH10
荧光显微镜	Zeiss	Axio Observer
水族盐	Instant Ocean
带 28.5 G 针头的胰岛素注射器	Becton Dickinson	329461