基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

摘要

本方案描述了如何从小鼠多能干细胞（PSC）生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3（TBX3）并结合心肌肌球蛋白重链（Myh6）启动子驱动的抗生素筛选，可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”（iSABs）中起搏细胞比例超过80%，表现出显著增高的搏动频率，并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.

摘要

病态窦房结综合征的治疗依赖于人工起搏器。人工起搏器存在电池故障、感染等风险，且缺乏对激素的响应能力，整体治疗费用较高。由多能干细胞（PSCs）衍生的“生物起搏器”可能成为一种替代方案，但胚胎体（Embryoid Bodies, EBs）中起搏细胞的典型比例极低。本方案结合了小鼠PSCs的“正向编程”方法 通过 基于Myh6启动子的抗生素筛选与窦房结诱导因子TBX3。这将获得由一致的心肌细胞聚集体组成 >80% 具有生理功能的起搏细胞。这些“诱导性窦房结样结构”（“iSABs”）可自发收缩，其频率达到前所未有的水平（400–500 次/分钟），与从小鼠心脏分离的窦房结细胞相当，并能够驱动小鼠心肌组织的节律性收缩。 离体使用所述方案可生成高纯度的窦房结单细胞，其 例如 可用于 体外 药物检测。此外，根据本方案生成的iSABs可能成为心脏组织工程中的关键步骤。

引言

“病态窦房结综合征”这一术语概括了多种导致心脏起搏系统功能恶化的疾病。它包括病理性、有症状的窦性心动过缓、窦房传导阻滞、窦性停搏以及心动过速-心动过缓综合征。病态窦房结综合征常伴随多种普通心脏疾病，例如缺血性心脏病、心肌病或心肌炎。目前，该病的治疗主要依赖植入电子起搏器。然而，这种方法伴随诸多风险，如感染和电池故障。总体而言，植入人工起搏器的患者发生并发症的几率仍然很高。此外，与内源性起搏系统不同，这些装置无法对激素刺激产生响应。

未来的一种替代方案可能依赖于“生物起搏器”的开发，其中PSCs可作为合适的细胞来源，同时也将对in vitro药物测试具有重要价值。然而，一个主要问题在于胚胎体（EBs）中窦房结样细胞的出现频率极低——通常不超过约0.5%¹。

此前的研究表明，通过过表达特定的早期心血管转录因子，例如中胚层特异性后部基因1（Mesoderm-specific-posterior 1, MesP1）和NK2转录因子相关位点5（NK2 transcription factor related, locus 5, Nkx2.5），可实现向特定心肌细胞亚型的“前向编程”^2,3。T-box转录因子Tbx3对于窦房结（sinoatrial node, SAN）的正常大小和功能至关重要，已被证实能够启动起搏器基因程序并调控窦房结的分化⁴。尽管如此，功能性起搏细胞的比例在整体心肌细胞群体中仍未能超过约40%。

因此，需要增加一个基于 Myh6 启动子的抗生素筛选步骤⁵ 由我们首次引入。这最终导致形成此前未观察到的心肌细胞聚集体（“诱导性窦房体”，iSABs），其搏动频率显著增加（>400 次/分钟 体外首次接近小鼠心脏的水平，且与体外培养的小鼠心脏窦房结细胞相当⁶在给予异丙肾上腺素的情况下，搏动频率可达550次/分钟。值得注意的是，通过广泛的生理学分析证实，iSABs中功能性起搏细胞的比例超过80%。⁷近年来，已有多种通过直接重编程生成窦房结细胞的方法¹⁹，表面标志物¹⁴ 或使用小分子进行药物治疗^16,17 然而，这些方法均未达到iSABs中所观察到的起搏细胞纯度以及接近小鼠心脏的搏动频率。

此外，在一个 离体 成年小鼠心室切片培养模型在失去自发搏动活性后，iSABs 能够整合至切片组织中，保持自发活性，并强有力地驱动心室切片产生收缩⁷本文详细描述了这些iSABs的生成方案。

方案

1. 开始前的建议

1. 请勿使用支原体污染的PSCs，因为它们无法正常分化为窦房结细胞。在开始本方案前，需使用PCR试剂盒检测支原体污染，该方法可实现快速、高灵敏度的支原体检测，并请遵循试剂盒制造商的说明书操作。
2. 对于每个培养皿（步骤2.3.4），在37 °C条件下，用7 ml无菌的0.1%冷水鱼皮明胶对一个10 cm²的细胞培养皿包被1小时。去除明胶后，在无菌操作台内无菌条件下让培养皿干燥。
3. 在启动分化方案之前，需准备一种双转染的稳定小鼠胚胎干细胞系克隆，其具备以下特征：i) 使用哺乳动物表达载体实现TBX3的组成型过表达；ii) G418抗性基因受Myh6启动子调控⁵。
4. 未分化的PSCs细胞应在标准条件下与经辐照处理的饲养层细胞共培养，具体方法见文献¹所述。

2. 分化步骤

1. 分化前两天——将 PSCs 从饲养层细胞中分离
   1. 吸弃培养基，用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入7 ml IV型胶原酶溶液，于37 °C孵育10分钟。将一个无菌的40 µm滤膜置于50 ml离心管中。
   2. 用移液器将胶原酶溶液上下吹打5次，轻轻冲洗PSC集落（注意避免去除饲养层细胞）。
   3. 将细胞悬液转移至40 µm滤器中，用8 ml PBS冲洗滤器三次。翻转滤器，将其倒置于培养皿中。通过移液枪向滤器底部加入10 ml PBS，以去除PSC细胞集落。
   4. 将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在300 x g下离心5分钟。
   5. 移除 PBS，加入 1 ml Accutase 重悬细胞，于 37 °C 孵育 5 min。
   6. 加入10 ml PBS，用移液器上下吹打细胞悬液5次混匀，然后在300 x g离心5分钟。
   7. 吸除 PBS，将细胞重悬于 10 ml 培养基中，并测定细胞数量。
   8. 接种15,000个细胞/cm²² 在75 cm处² 滤瓶，并在37 °C、5% CO2条件下培养2天。2天后，培养瓶中的细胞应达到50-70%融合度。
2. 第0天 - 分化开始
   1. 吸去培养基，用 10 ml PBS 洗涤细胞。
   2. 吸去 PBS，加入 2 ml Accutase，于 37 °C 孵育 5 分钟。将一个无菌的 40 µm 滤器置于 50 ml 离心管中。
   3. 加入10 ml PBS，将细胞悬液转移至40 µm滤膜，用10 ml PBS冲洗滤膜，离心滤过液5分钟，300 x g。
   4. 将细胞重悬于10 ml分化培养基中，并测定细胞数量。
   5. 用分化培养基将细胞悬液稀释至终浓度为20,000个细胞/ml。
   6. 用移液器向方形培养皿中加入20 ml水和5 ml悬滴（HD）溶液，以防止悬滴干燥。
      注意：对于每块含有iSABs的24孔板（参见第2.8.6.4/2.8.7节），需准备16个培养皿。
   7. 用移液器吸取最多 50 ml 细胞悬液至托盘中。
   8. 将培养皿盖翻转。使用12通道移液器，将180个含有20 µl（每孔400个细胞）细胞悬液的孔加入到盖子上。
   9. 小心地将盖子翻转并放置到培养皿上。
      注意：旋转盖子的速度非常关键。如果旋转速度过慢或过快，细胞悬液的表面张力将不足以使悬滴保留在盖子上。在首次制备悬滴前，建议先用20 µl培养基液滴练习旋转盖子的操作。
   10. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞 2 天₂ 使其形成拟胚体。
       注意：在5个培养皿堆叠的顶部放置一个装有水的培养皿，否则上方培养皿中的HD会变干。
3. 第2天
   1. 小心翻转方形培养皿的皿盖，将来自两个培养皿的胚状体（360个EBs）转移至50 ml离心管中。
   2. 等待10分钟，使EBs沉降至管底（切勿离心EBs）。
   3. 尽可能吸除培养基，将拟胚体重悬于10 ml分化培养基中，转移至10 cm培养皿中。
4. 第2-6天 悬浮培养
   1. 在37 °C、5% CO₂条件下将拟胚体悬浮培养4天₂，2天后更换培养基。
      注意：尽管培养皿未经包被处理（与细胞培养皿不同），胚胎干细胞聚集体（EBs）仍常会贴附于皿底表面。需每天检查培养皿中EBs的贴壁情况，必要时通过轻柔吹打将贴壁的EBs从皿底分离。可选步骤：在悬浮培养期间持续轻度摇动培养皿，注意控制摇床速度，避免EBs在皿中央聚集或漂向皿边缘。
5. 第6天
   1. 将EBs从一个培养皿转移至一个明胶包被的10 cm培养皿中² 细胞培养皿
6. 第7-12天
   1. 细胞应在8-12天后开始搏动。每天在显微镜下观察细胞的搏动区域。细胞开始形成单层。
   2. 每天更换培养基。
      注意：更换培养基后，细胞需要 3-4 小时恢复并重新开始搏动。
7. 第12至15天 窦房结样细胞的筛选
   1. 细胞开始搏动后三天（约第12至15天），吸除培养基，加入10 ml含有400 µg/ml G418的新鲜分化培养基。
8. 在开始筛选后的第四天，将细胞层解离。
   注意：细胞层可能已从表面脱落。
   1. 小心移除培养基，避免吸到细胞层。
   2. 加入10 ml PBS，小心移除PBS，避免吸走细胞层。
   3. 加入10 ml Collagenase IV溶液，将细胞转移至50 ml离心管中，在37 °C孵育5 min。
   4. 用移液器上下吹打悬液10次使其充分混匀，将细胞在37 °C孵育5分钟。应形成由小细胞团簇组成的悬液。若仍有较大块的组织残留，则重复步骤2.8.4两次。
   5. 加入 20 ml PBS，以 300 x g 离心 10 分钟。
   6. 小心吸除 PBS。
      注意：如果要生成iSABs，请继续进行步骤2.8.7；如果要生成由iSAB衍生的窦房结单细胞，请继续进行步骤2.9。
   7. 将细胞重悬于12 ml含有400 µg/ml G418的分化培养基中，并接种至经明胶包被的24孔板中的6个孔（每孔2 ml）。
9. 单个结节细胞的生成
   1. 将第2.8.6步的细胞重悬于5 ml Accutase中，37 °C孵育5 min。
   2. 用移液器上下吹打悬浮液10次使其充分混匀，然后将细胞在37 °C下孵育5分钟。
   3. 加入20 ml PBS，以300 × g离心5分钟。
   4. 将细胞重悬于12 ml含400 µg/ml G418的分化培养基中，接种至经明胶包被的24孔板的6个孔内（每孔2 ml）。
10. 消化后第2天，吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次。每孔加入1 ml分化培养基。
11. 解离后第4-8天，每隔2天更换一次培养基^nd 第10天，解离后可使用iSABs或由iSABs衍生的窦房结单细胞进行进一步分析。

结果

所述方案可从PSCs生成跳动频率约为450 bpm的iSABs（见视频），该频率接近小鼠心脏的跳动频率。在iSABs解离后（步骤2.8.8），观察到的单个细胞呈现出窦房结细胞的典型形态（纺锤形和蜘蛛状细胞），如图1所示。这些细胞高表达已知对窦房结功能至关重要的蛋白质，如超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（Hcn4）、连接蛋白45（Cx45）、连接蛋白30.2（Cx30.2）以及Myh6（图2A-C）。在用药物处理iSAB来源的细胞后，细胞表现出预期的反应：与窦房结类似， funny通道阻滞剂ZD7288（图3A）和毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱（carbachol）（图3B）均使其跳动频率显著降低；而β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素则导致跳动频率升高（图3C）。

讨论

获得由干细胞衍生的心脏起搏细胞的能力，可能实现“生物起搏器”意义上的正常心律重建。同样，体外药物筛选也将受益于这类细胞的可获得性。多能干细胞（PSCs）能够分化为哺乳动物体内任何类型的细胞，包括具有起搏细胞特性的心肌细胞^{8,9,10,11,12,13}。然而，通常“拟胚体”内的细胞群体高度异质，这不可避免地要求建立可靠的细胞筛选与分离策略——尤其是对于极为稀少的心脏结节细胞这一细胞类型。已有多种方法被尝试，包括基于外源性和内源性表面标志物的方法¹⁴、通过药理学手段施加小分子化合物的方法^15,16,17，以及直接重编程策略^18,19。此外，还有一些非干细胞来源的方法，旨在通过调控介导肌膜电生理的终末效应分子来模拟生物起搏器功能，而非从头生成完全功能性结节细胞^20,21。

然而，这两种方法均未能达到必要的高自发性收缩频率和细胞纯度。相比之下，我们的方案所获得的细胞不仅表现出电振荡，还具有内源性起搏细胞特有的电生理和钙信号特征以及独特的形态学特征⁷。该技术可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含稳定谷氨酰胺的伊氏液态培养基	Biochrom AG	FG 0465
不含丙酮酸钠、含稳定谷氨酰胺的DMEM液态培养基	Biochrom AG	FG 0435
CLS IV型胶原酶，CLS IV	Biochrom AG	C4-22
非必需氨基酸	Biochrom AG	K 0293
优质胎牛血清	Biochrom AG	S 0615
丙酮酸钠（100 mM）	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC 液体（即用型溶液），无菌	Biochrom AG	A 2912
聚丙烯多通道移液管用试剂储液槽，60 mL，无菌	Brand	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus 电子移液器	Eppendorf	4861000155
Falcon 细胞滤筛 40 µm	Falcon	352340
青霉素/链霉素	GE Healthcare	P11-010
培养皿	Greiner BioOne	663102
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）	PAN-Biotech	P04-36500
胎牛血清	PAN-Biotech	P30-3302
白血病抑制因子	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
方形培养皿	Roth	PX67.1
冷水鱼皮来源明胶	SigmaAldrich	G7765
2-巯基乙醇	SigmaAldrich	M3148
1-硫代甘油	SigmaAldrich	M6145
组织培养皿	TPP	93100
组织培养瓶	TPP	90076
组织培养板（24孔）	TPP	92424