本方案描述了如何从小鼠多能干细胞(PSC)生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3(TBX3)并结合心肌肌球蛋白重链(Myh6)启动子驱动的抗生素筛选,可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”(iSABs)中起搏细胞比例超过80%,表现出显著增高的搏动频率,并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.
方法文章
本方案描述了如何从小鼠多能干细胞(PSC)生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3(TBX3)并结合心肌肌球蛋白重链(Myh6)启动子驱动的抗生素筛选,可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”(iSABs)中起搏细胞比例超过80%,表现出显著增高的搏动频率,并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.
病态窦房结综合征的治疗依赖于人工起搏器。人工起搏器存在电池故障、感染等风险,且缺乏对激素的响应能力,整体治疗费用较高。由多能干细胞(PSCs)衍生的“生物起搏器”可能成为一种替代方案,但胚胎体(Embryoid Bodies, EBs)中起搏细胞的典型比例极低。本方案结合了小鼠PSCs的“正向编程”方法 通过 基于Myh6启动子的抗生素筛选与窦房结诱导因子TBX3。这将获得由一致的心肌细胞聚集体组成 >80% 具有生理功能的起搏细胞。这些“诱导性窦房结样结构”(“iSABs”)可自发收缩,其频率达到前所未有的水平(400–500 次/分钟),与从小鼠心脏分离的窦房结细胞相当,并能够驱动小鼠心肌组织的节律性收缩。 离体使用所述方案可生成高纯度的窦房结单细胞,其 例如 可用于 体外 药物检测。此外,根据本方案生成的iSABs可能成为心脏组织工程中的关键步骤。
“病态窦房结综合征”这一术语概括了多种导致心脏起搏系统功能恶化的疾病。它包括病理性、有症状的窦性心动过缓、窦房传导阻滞、窦性停搏以及心动过速-心动过缓综合征。病态窦房结综合征常伴随多种普通心脏疾病,例如缺血性心脏病、心肌病或心肌炎。目前,该病的治疗主要依赖植入电子起搏器。然而,这种方法伴随诸多风险,如感染和电池故障。总体而言,植入人工起搏器的患者发生并发症的几率仍然很高。此外,与内源性起搏系统不同,这些装置无法对激素刺激产生响应。
未来的一种替代方案可能依赖于“生物起搏器”的开发,其中PSCs可作为合适的细胞来源,同时也将对in vitro药物测试具有重要价值。然而,一个主要问题在于胚胎体(EBs)中窦房结样细胞的出现频率极低——通常不超过约0.5%1。
此前的研究表明,通过过表达特定的早期心血管转录因子,例如中胚层特异性后部基因1(Mesoderm-specific-posterior 1, MesP1)和NK2转录因子相关位点5(NK2 transcription factor related, locus 5, Nkx2.5),可实现向特定心肌细胞亚型的“前向编程”2,3。T-box转录因子Tbx3对于窦房结(sinoatrial node, SAN)的正常大小和功能至关重要,已被证实能够启动起搏器基因程序并调控窦房结的分化4。尽管如此,功能性起搏细胞的比例在整体心肌细胞群体中仍未能超过约40%。
因此,需要增加一个基于 Myh6 启动子的抗生素筛选步骤5 由我们首次引入。这最终导致形成此前未观察到的心肌细胞聚集体(“诱导性窦房体”,iSABs),其搏动频率显著增加(>400 次/分钟 体外首次接近小鼠心脏的水平,且与体外培养的小鼠心脏窦房结细胞相当6在给予异丙肾上腺素的情况下,搏动频率可达550次/分钟。值得注意的是,通过广泛的生理学分析证实,iSABs中功能性起搏细胞的比例超过80%。7近年来,已有多种通过直接重编程生成窦房结细胞的方法19,表面标志物14 或使用小分子进行药物治疗16,17 然而,这些方法均未达到iSABs中所观察到的起搏细胞纯度以及接近小鼠心脏的搏动频率。
此外,在一个 离体 成年小鼠心室切片培养模型在失去自发搏动活性后,iSABs 能够整合至切片组织中,保持自发活性,并强有力地驱动心室切片产生收缩7本文详细描述了这些iSABs的生成方案。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
1. 开始前的建议
2. 分化步骤
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所述方案可从PSCs生成跳动频率约为450 bpm的iSABs(见视频),该频率接近小鼠心脏的跳动频率。在iSABs解离后(步骤2.8.8),观察到的单个细胞呈现出窦房结细胞的典型形态(纺锤形和蜘蛛状细胞),如图1所示。这些细胞高表达已知对窦房结功能至关重要的蛋白质,如超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4(Hcn4)、连接蛋白45(Cx45)、连接蛋白30.2(Cx30.2)以及Myh6(图2A-C)。在用药物处理iSAB来源的细胞后,细胞表现出预期的反应:与窦房结类似, funny通道阻滞剂ZD7288(图3A)和毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱(carbachol)(图3B)均使其跳动频率显著降低;而β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素则导致跳动频率升高(图3C)。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
获得由干细胞衍生的心脏起搏细胞的能力,可能实现“生物起搏器”意义上的正常心律重建。同样,体外药物筛选也将受益于这类细胞的可获得性。多能干细胞(PSCs)能够分化为哺乳动物体内任何类型的细胞,包括具有起搏细胞特性的心肌细胞8,9,10,11,12,13。然而,通常“拟胚体”内的细胞群体高度异质,这不可避免地要求建立可靠的细胞筛选与分离策略——尤其是对于极为稀少的心脏结节细胞这一细胞类型。已有多种方法被尝试,包括基于外源性和内源性表面标志物的方法14、通过药理学手段施加小分子化合物的方法15,16,17,以及直接重编程策略18,19。此外,还有一些非干细胞来源的方法,旨在通过调控介导肌膜电生理的终末效应分子来模拟生物起搏器功能,而非从头生成完全功能性结节细胞20,21。
然而,这两种方法均未能达到必要的高自发性收缩频率和细胞纯度。相比之下,我们的方案所获得的细胞不仅表现出电振荡,还具有内源性起搏细胞特有的电生理和钙信号特征以及独特的形态学特征7。该技术可能...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含稳定谷氨酰胺的伊氏液态培养基 | Biochrom AG | FG 0465 | |
| 不含丙酮酸钠、含稳定谷氨酰胺的DMEM液态培养基 | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS IV型胶原酶,CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| 非必需氨基酸 | Biochrom AG | K 0293 | |
| 优质胎牛血清 | Biochrom AG | S 0615 | |
| 丙酮酸钠(100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC 液体(即用型溶液),无菌 | Biochrom AG | A 2912 | |
| 聚丙烯多通道移液管用试剂储液槽,60 mL,无菌 | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus 电子移液器 | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon 细胞滤筛 40 µm | Falcon | 352340 | |
| 青霉素/链霉素 | GE Healthcare | P11-010 | |
| 培养皿 | Greiner BioOne | 663102 | |
| 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液(DPBS) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| 白血病抑制因子 | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| 方形培养皿 | Roth | PX67.1 | |
| 冷水鱼皮来源明胶 | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-巯基乙醇 | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-硫代甘油 | SigmaAldrich | M6145 | |
| 组织培养皿 | TPP | 93100 | |
| 组织培养瓶 | TPP | 90076 | |
| 组织培养板(24孔) | TPP | 92424 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可