本方法学论文的目的是介绍一种微流控系统的使用，用于构建包含人类龈上牙菌斑中常见菌种的多物种生物膜。 文中重点阐述了描述生物膜结构、生物膜活性的方法，以及一种用于培养依赖性或培养非依赖性分析的生物膜收获技术。
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本文内容
摘要
摘要
目前，能够促进多物种生物膜发育的高通量in vitro系统较少，而这些生物膜需包含在in vivo口腔生物膜中常检测到的多种微生物。此外，若能使用天然人唾液作为营养来源，而非人工培养基，则更有利于模拟in vivo微生物群落中细胞及生物膜特异性特性的表达，因此这类系统尤为理想。本文描述了一种在类似人体口腔条件下，构建与龈上牙菌斑在物种组成上相当的多物种口腔生物膜的方法。具体而言，本方法文章将介绍如何改造一种市售的微流控系统，以促进来源于混合唾液并在其中生长的多物种口腔生物膜的形成。此外，还将介绍如何结合共聚焦激光扫描显微镜使用该系统，以生成三维生物膜重建图像，用于结构分析和活性分析。鉴于在微流控系统中生长的生物膜内微生物具有广泛的多样性（包括Streptococcus、Neisseria、Veillonella、Gemella和Porphyromonas），本文还将提供一种方案，描述如何收集生物膜细胞以进行进一步传代培养 或DNA提取与分析。文章也将讨论当前微流控生物膜系统以及先进数据分析技术的局限性。最终，本文旨在提供一种基础性技术，以促进口腔生物膜的研究，并推动可与微流控平台整合的其他技术的开发。
引言
生物膜是结构复杂的细菌群落，聚集在各种表面1。这些群落通常包含多种细菌，在生物膜内相互作用2。口腔生物膜是最为明显的生物膜之一，其中最显著的是牙菌斑，对人类健康构成长期挑战，其不受控制的发展会形成分类学上高度多样化的多物种群落3。这些多样化群落中的细菌成分对抗微生物药物的耐受性可比其浮游（浮游态）状态下的同类高出多达1000倍4-6。若未能有效治疗这些可导致龋齿和牙周病的口腔生物膜群落，将带来重大的公共卫生负担：在美国，每年因口腔问题就诊牙科诊所的次数超过5亿次，用于治疗或预防牙周病和龋齿的费用约为1080亿美元7。
“尽管许多微生物学家主张在自然条件下研究微生物行为，但真正做到的人却很少。这是因为实验室培养工作的便利性极具吸引力，不断削弱了他们克服困难的动力。” —Smith 8。
目前，口腔生物膜研究采用多种方法进行 体内 和 体外 方法，各有其优势与局限性 9,10. 体外 方法通常采用相对易于构建的模型生物膜系统，但可能缺乏临床或实际应用的相关性 10,11. 在体 方法通常依赖于动物模型系统，这些系统可能再现人类口腔环境的某些方面，但由于动物与人类在....
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方案
本文所述唾液采集方案已通过密歇根大学人类受试者研究机构审查委员会（IRB）的审核。
注意：对于此类涉及人类受试者的研究，应事先从所在机构获得相应的安排和许可。具体而言，根据机构要求，可能需要在开始从人类志愿者采集唾液前申请并获得机构审查委员会（IRB）或伦理委员会的批准。为协助准备申请材料，可参考美国国立卫生研究院（NIH）提供的实用算法/流程图，网址如下：http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
1. 制备混合唾液作为环境相关性生长培养基
- 招募 >5 名志愿者提供唾液样本。不得收集任何可识别个人信息，确保志愿者在生病期间、过去3个月内使用过口服抗生素、或在采集前2小时内摄入过食物或除水以外的液体时，不得捐献唾液。
- 使用50 ml塑料离心管收集唾液。将收集的唾液汇集至塑料烧杯中，并置于冰上。请勿使用玻璃器皿，因为唾液中的聚合物会黏附在玻璃内表面。
- 加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为2.5 mM（使用100倍储存液，储存液分装后于–20 °C冷冻保存）。在冰....
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结果
生物膜的三维成像
代表性结果如图3所示。IMARIS软件中一个有用的工具是可逐层查看所采集的生物膜图像堆栈，并将其合并生成三维重建图像。此外，还可添加人工阴影效果，以帮助直观地解读三维结构。渲染后的生物膜图像可任意旋转方向并调整放大倍数，以观察生物膜或微菌落的结构。图3中展示的图像为口腔多物种生物膜经处理后的结果。值得注意的是，经70%乙醇处理后，大部分生物膜呈现明显的颜色变化（由绿色变为红色），提示细胞大量死亡或受损。较大的微菌落似乎比其下方（现暴露的）微菌落含有更多的死细胞。这一结果可能归因于乙醇作为膜活性抗菌剂导致生物膜细胞脱附。通过将文件转换为OME格式，并在IMAGEJ中分析渲染后的图像堆栈，应用直方图函数可发现，未经处理与经乙醇处理的生物膜中红色与绿色信号的强度呈反比关系。
生物膜特性的定量分析
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讨论
本文方法学论文重点介绍了建立和运行微流控系统所需的基本步骤，以促进利用混合人唾液来源的接种物在滤膜过滤除菌的25%混合人唾液培养基中形成口腔多物种生物膜。文中提供了对生物膜进行表征的方法，但需注意，这些方法均可根据需要进行修改，并可引入其他技术手段，例如染色或标记方法。举例而言，可使用标记的抗体或引入荧光标记菌株，以可视化并分析特定物种在口腔多物种生物膜中的空间分布位置。此外，根据所使用的微流控系统型号不同，还可在厌氧条件下培养生物膜（例如，在使用Bioflux系统时，可在Fluxion.com网站上获取关于此问题的技术说明文档）。
Bioflux 微流控系统的一个关键特性是其与多种技术的兼容性，这一点通过能够进行无需培养的多样性分析得到了充分体现（图3）。尽管微流控系统内部表面不易直接接触，但通过强烈的正向和反向流可以去除大量生物膜生物量。虽然并非所有生物膜都能被轻易清除，这可能被视为该系统的一个局限性，但值得注意的是，许多模型生物膜系统也存在类似问题，因此在解读由此类采集数据得出的结论时，必须考虑到这一因素。例如，链球菌在生物膜中的实际丰度可能.......
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披露
A. H. R. 和 N.S.J. 在过去五年中获得了来自多个机构的研究资助，包括美国国立卫生研究院（NIDCR）、高露洁-棕榄公司（新泽西州皮斯卡特维）以及应用微生物学会，用于支持其实验室的研究工作。其余所有作者：无任何声明。
致谢
作者感谢密歇根大学的 William Nance 在制定生物膜生长方案过程中提供的帮助，以及旧金山 Fluxion 公司的 John Battista 在 Bioflux 系统相关技术问题上的建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH：R21DE018820，授予 A. H. R.）和密歇根大学启动资金对 A. H. R. 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 ml 圆锥形离心管（Falcon） | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 15 ml 圆锥形离心管（Falcon） | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| 二硫苏糖醇（DTT，白色晶体或粉末/电泳级），Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval 超速离心机 （兼容 SS-34 转子） | Thermoscientific | 取决于设备型号 | |
| Thermo Scientific SS-34 角转子 | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific 一级试剂级去离子水 | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene 快流速滤器单元及瓶顶滤器，PES 膜，无菌 | VWR | 73520-986 | |
| 甘油 | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux 微流控系统 | Fluxion | Bioflux 200 系统 | |
| Bioflux 24 通道板 | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS（Gibco） | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD 染色试剂（Invitrogen） | Invitrogen | L7012 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Lecia | SPE 或同等系统 | |
| 落射荧光显微镜 | 多种选择 | 多种选择 | |
| 焦磷酸测序平台 | 多种选择 | 多种选择 | |
| Decon SaniHol 70% 乙醇溶液 | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| 超低温冰箱 -80 °C | 多种选择 | 多种选择 | |
| 移液器吸头（20、200 和 1,000 μl） | 多种选择 | 多种选择 | |
| 单通道可调体积移液器（20、200、1,000 μl） | 多种选择 | 多种选择 | |
| 软件 | |||
| Bioflux 专用软件 | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | 免费软件（http://imagej.nih.gov/ij/） | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | 免费软件（http://www.comstat.dk/） |
参考文献
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander,....
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重印与许可
