高通量技术的应用 体外 用于构建口腔多物种生物膜的微流控系统

摘要

本方法学论文的目的是介绍一种微流控系统的使用，用于构建包含人类龈上牙菌斑中常见菌种的多物种生物膜。 文中重点阐述了描述生物膜结构、生物膜活性的方法，以及一种用于培养依赖性或培养非依赖性分析的生物膜收获技术。

摘要

目前，能够促进多物种生物膜发育的高通量in vitro系统较少，而这些生物膜需包含在in vivo口腔生物膜中常检测到的多种微生物。此外，若能使用天然人唾液作为营养来源，而非人工培养基，则更有利于模拟in vivo微生物群落中细胞及生物膜特异性特性的表达，因此这类系统尤为理想。本文描述了一种在类似人体口腔条件下，构建与龈上牙菌斑在物种组成上相当的多物种口腔生物膜的方法。具体而言，本方法文章将介绍如何改造一种市售的微流控系统，以促进来源于混合唾液并在其中生长的多物种口腔生物膜的形成。此外，还将介绍如何结合共聚焦激光扫描显微镜使用该系统，以生成三维生物膜重建图像，用于结构分析和活性分析。鉴于在微流控系统中生长的生物膜内微生物具有广泛的多样性（包括Streptococcus、Neisseria、Veillonella、Gemella和Porphyromonas），本文还将提供一种方案，描述如何收集生物膜细胞以进行进一步传代培养 或DNA提取与分析。文章也将讨论当前微流控生物膜系统以及先进数据分析技术的局限性。最终，本文旨在提供一种基础性技术，以促进口腔生物膜的研究，并推动可与微流控平台整合的其他技术的开发。

引言

生物膜是结构复杂的细菌群落，聚集在各种表面¹。这些群落通常包含多种细菌，在生物膜内相互作用²。口腔生物膜是最为明显的生物膜之一，其中最显著的是牙菌斑，对人类健康构成长期挑战，其不受控制的发展会形成分类学上高度多样化的多物种群落³。这些多样化群落中的细菌成分对抗微生物药物的耐受性可比其浮游（浮游态）状态下的同类高出多达1000倍^4-6。若未能有效治疗这些可导致龋齿和牙周病的口腔生物膜群落，将带来重大的公共卫生负担：在美国，每年因口腔问题就诊牙科诊所的次数超过5亿次，用于治疗或预防牙周病和龋齿的费用约为1080亿美元⁷。

“尽管许多微生物学家主张在自然条件下研究微生物行为，但真正做到的人却很少。这是因为实验室培养工作的便利性极具吸引力，不断削弱了他们克服困难的动力。” —Smith ⁸。

目前，口腔生物膜研究采用多种方法进行 体内 和 体外 方法，各有其优势与局限性 ^9,10. 体外 方法通常采用相对易于构建的模型生物膜系统，但可能缺乏临床或实际应用的相关性 ^10,11. 在体 方法通常依赖于动物模型系统，这些系统可能再现人类口腔环境的某些方面，但由于动物与人类在解剖学、生理学、微生物学和免疫学方面的差异，仍存在局限性 ^12,13需要注意的是，口腔生物膜也可以在固定于人体志愿者口腔内支架上的牙釉质表面形成，但这种方法目前相对成本较高且费时费力 ^14,15最终，用于改善口腔健康的新型药物或技术将在受控的临床试验条件下进行人体测试。 ¹¹目前，一种常用的方法 运作方式 用于识别和评估新型口腔保健制剂的方法是首先进行实验室研究以确定其潜在功效，随后开展动物实验和由临床医生参与评估技术有效性的“现场试验”。 ^9,16,17遗憾的是，实验室研究往往依赖于占地面积大、技术上难以操作的模型系统，且通常仅包含单一或最多少数几个物种的简化群落，以期推导出潜在的实际意义 ^10,18由于牙菌斑生物膜包含多种微生物，并在复杂的唾液流动环境中形成，因此在人工培养基中培养单一或少数几种微生物所形成的生物膜，难以模拟真实情况下微生物群落的行为特征 ^10,19为解决传统实验室生物膜模型系统在时间、成本、培训要求以及相较于真实环境代表性不足等方面的问题，我们近期开发了一种高通量且更贴近环境实际的生物膜系统 ²⁰ (图1）。该系统采用无细胞的混合人源唾液（CFS）作为培养基，以及未经处理的含细菌细胞的混合人源唾液（CCS）作为接种物，具有显著优势。独特之处在于，该系统还结合了微流控技术、共聚焦激光扫描显微镜以及无需培养的细菌多样性分析技术。因此，该模型系统在环境相关性方面表现优异（使用唾液作为接种物，在37 °C下培养多物种生物膜） °C 的滤膜除菌流动唾液）中，且口腔生物膜包含多种物种（包括 链球菌, 奈瑟菌属, 韦荣球菌，以及 卟啉单胞菌属 在早期龈上菌斑中具有代表性的丰度的物种 ²⁰.

考虑到本研究描述了新开发模型系统的应用，需特别关注共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、微流控技术以及无需培养的多样性分析技术的整合。这些技术的整合由本研究团队有意实现，不仅为新开发的模型系统增添了高通量能力，还使得研究者能够提出以往其他系统难以解决的科学问题。首先，相较于传统显微镜，CLSM具有显著优势，能够实现对生物膜的三维分析。这一优势常被忽视，但实际上极为重要，因为生物膜在物种组成、空间分布以及不同空间位置所处的生理条件方面均具有高度异质性。 ^6,21结合三维重建软件和图像分析软件，可对生物膜的结构、组分菌种之间的空间关系以及抗菌杀灭效果进行分析 ^22-24这些能力无法通过标准的透射光显微镜或落射荧光显微镜实现。接下来，微流控技术在微生物学领域受到特别关注，因为它能够在严格控制的条件（如流动、温度、pH值）下研究生物膜。 等等。）且仅需少量液体 ^25-27作为对比，在流细胞模型系统（该系统可被视为目前许多口腔生物膜研究的主要模型）中，以与微流控系统相当的流速和剪切力培养口腔生物膜20小时，至少需要200 ml人唾液，而微流控装置仅需800 µl ^28-31因此，微流控模型生物膜系统能够在明确定义的条件下研究有限数量的材料。最后，在过去十年中，焦磷酸测序技术已得到优化，仅需少量材料即可进行群落分析，并具有足够的灵活性以调控测序深度，从而鉴定出罕见的生物膜物种。该技术的应用，例如细菌标签编码的FLX扩增子焦磷酸测序（bTEFAP），使得有关生物膜生态学的重要问题得以解答 ^32,33此类问题在过去曾带来诸多困难，因为当时尚无焦磷酸测序技术，构建质粒文库需要耗费大量时间和成本，且获取数据所需的技术操作与分析步骤极为复杂。 ^33,34当然，采用无需培养的方法（如焦磷酸测序）的一大优势在于，能够鉴定那些无法在常规实验室培养基中独立培养的细菌物种（即 可在该模型系统中培养并鉴定出可存活但不可培养的物种，并对其在群落中的相对丰度进行定量 ^35,36为了提供参考，早在1963年，已故的Sigmund Socransky就估计，从人口腔龈沟中分离出的材料中，约有50%的细菌无法通过实验室培养条件进行培养。 ³⁷.

本方法学论文的目的是描述在商业化微流控（Bioflux）系统中建立口腔多物种生物膜的方法，具体条件包括：（i）模拟人口腔环境的条件；（ii）物种组成和丰度与龈上菌斑相近。此外，我们利用免费软件和商业软件，重点介绍如何从共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）数据中提取生物膜基本结构参数，特别是量化生物膜生物量、粗糙度和活性（基于活/死染色）的方法。最后，本文还描述了采集生物膜样本以进行bTEFAP多样性分析所需的步骤。

方案

本文所述唾液采集方案已通过密歇根大学人类受试者研究机构审查委员会（IRB）的审核。
注意：对于此类涉及人类受试者的研究，应事先从所在机构获得相应的安排和许可。具体而言，根据机构要求，可能需要在开始从人类志愿者采集唾液前申请并获得机构审查委员会（IRB）或伦理委员会的批准。为协助准备申请材料，可参考美国国立卫生研究院（NIH）提供的实用算法/流程图，网址如下：http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. 制备混合唾液作为环境相关性生长培养基

1. 招募 >5 名志愿者提供唾液样本。不得收集任何可识别个人信息，确保志愿者在生病期间、过去3个月内使用过口服抗生素、或在采集前2小时内摄入过食物或除水以外的液体时，不得捐献唾液。
2. 使用50 ml塑料离心管收集唾液。将收集的唾液汇集至塑料烧杯中，并置于冰上。请勿使用玻璃器皿，因为唾液中的聚合物会黏附在玻璃内表面。
3. 加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为2.5 mM（使用100倍储存液，储存液分装后于–20 °C冷冻保存）。在冰上用塑料烧杯搅拌10分钟。
4. 为去除颗粒物质，将混合唾液在17,500 × g条件下离心30分钟。
5. 用3倍体积的去离子水（dH₂O）稀释唾液，得到四分之一浓度的唾液溶液。
6. 使用0.22 µm聚醚砜（PES）低蛋白结合滤膜对唾液进行过滤除菌。建议选用大表面积滤膜，或使用多个小面积滤膜。过滤过程中将唾液保持在塑料容器中并置于冰上。
7. 将混合唾液分装至50 ml塑料离心管中，于–80 °C冷冻保存，待后续培养细菌时使用。每管仅限一次性使用，每管装液量不应超过35 ml，因为每个微流控孔的最大容量为1.2 ml（1.2 ml × 24孔 = 28.8 ml），且唾液在冷冻过程中会膨胀，需预留空间。
8. 使用时，将混合唾液在室温下解冻。解冻后再次进行过滤除菌（0.22 µm聚醚砜滤膜，低蛋白结合，以去除可能形成的沉淀物）。

2. 用作接种物的混合唾液的制备

1. 招募 >5 名唾液捐献者。不得收集任何可识别个人信息，确保患病者、过去3个月内服用过口服抗生素者，或在捐献前2小时内摄入过食物或除水以外液体的个体不得捐献唾液。在30分钟内完成样本采集。
2. 在室温下使用50 ml塑料管收集唾液，并在室温下将收集的唾液汇集至一个塑料烧杯中。
3. 用经高压灭菌的普通试剂级甘油稀释混合唾液，制备终浓度为25%甘油、75%含细胞唾液[CCS]的储存液。
4. 将唾液在–80 °C下以3 ml单次使用分装量冷冻保存，直至使用前。
5. 当需要接种微流控系统时，将分装样品在室温下解冻，并在涡旋振荡器上轻轻振荡5秒，然后按照下文方案第3步所述，用移液器加入微流控系统中。

3. 口腔多物种生物膜的培养

1. CFS 预处理
   1. 首先用 CFS 包被 Bioflux 微流控通道。向每个出口孔中加入 100 µl CFS。使用 Bioflux 控制软件，选择“手动”模式，并设置将要使用的通道“B1-B24”的流速。
   2. 接下来，将剪切力设为1.0 dyne/cm²，在室温下启动流动，持续2分钟，以确保CFS在整个通道内均匀分布。检查每个入口通道中均有液体流过，以确认CFS已均匀流经所有通道。
   3. 室温孵育平板20分钟。
   4. 移除出口孔中残留的CFS/预处理溶液，并将其转移至入口孔。这100 µl的总体积将用于平衡从出口孔施加到接种物上的压力。
2. 接种
   1. 向每个出口孔中加入 100 µl CCS 菌液。将微流控板置于加热板上（温度设定为 37 °C），在控制软件中选择手动模式，并设置流体从出口孔流向入口孔（即，反向）在1.0 dyne/cm²下持续6秒。
   2. 将微流控板在37 °C孵育40分钟，以促进接种液中细菌的初始黏附和生长。
3. 过夜培养
   1. 对于正在使用的接种通道，从每个出口孔中吸出废弃的接种液。向每个入口孔中加入最多1 ml总体积的CFS（可加在已有的CFS之上）。
   2. 将微流控板在37 °C下孵育，选择手动模式并将程序设置为0.2 dyne/cm²运行20小时。
4. 染色前洗涤
   1. 吸出入口井和出口井中的全部液体，向每个入口井中加入 100 µl PBS（pH 7.4）。以 0.2 dyne/cm² 的流速灌注 20 分钟。
5. 染色液混合物的添加
   1. 为细胞活力染色，每个待染色通道配制 100 µl 染色混合液。具体操作为：使用商业细胞活力染色试剂盒（如 LIVE/DEAD），每毫升 PBS 中加入 3 µl SYTO 9 和 3 µl 碘化丙啶，得到含 10 µM SYTO 9 和 60 µM 碘化丙啶的染色混合液。
   2. 吸出入口孔中残留的 PBS，然后向每个入口孔加入 100 µl 细胞活力染色混合液。调节流速至 0.2 dyne/cm² 在室温下将溶液从入口端运行至出口端，持续45分钟。
6. 染色后洗涤
   1. 吸出每个入口孔中残留的染料，向每个入口孔加入100 µl PBS。调节流速至0.2 dyne/cm²，在室温下将PBS溶液从入口流向出口，运行20分钟，以去除多余的染料。

4. 图像采集、三维重建与图像分析

1. 使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）从微流控系统中采集生物膜图像数据。确保CLSM能够承受Bioflux板的重量，该重量可高达150 g。
   注意：鉴于微流控通道的尺寸、对生物膜结构分辨的灵敏度需求，以及对不同强度荧光信号的检测要求，应为CLSM配备40倍、数值孔径（NA）为1.25的物镜，或具有相似光学质量、放大倍数和数值孔径的物镜。
2. 标准化发射光采集门控参数，保持增益和偏移量恒定。确保激光功率不超过25%，以避免发生光漂白。
3. 将CLSM文件从Leica Image File格式（LIF）转换为OME（Open Microscopy Environment）格式，以提高文件在不同软件程序间的可访问性和兼容性。可使用IMARIS等商业软件完成此类转换。

图像/图示的 3D 渲染

4. 转换为 OME 格式后，使用 commercially available software（如 IMARIS）对图像进行三维重建。可通过结合使用“Easy3D”和“Surpass”选项完成此操作。
   注意：应注意背景信号和阈值设定。可利用 IMARIS 中的直方图功能确定信号采集范围，并在分析不同图像时保持该范围一致。
5. 使用“snapshot”功能保存图像，并在保存文件前仔细考虑图像分辨率。
6. 使用图像编辑软件（如 CorelDraw 或 Adobe Illustrator）将图像组合成图版。

用于图表的三维图像分析

7. 使用免费的 IMAGEJ ²³ 和 COMSTAT/COMSTAT2 ³⁸ 进行图像分析。分别从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 和 http://comstat.dk/ 下载相应软件包，并确保已安装最新版本的 Java。
   注意：在使用图像分析软件之前，需预先安装软件平台 JAVA。
   1. 使用 IMAGEJ 软件并加载 COMSTAT2 插件，以“hyperstack” 模式导入每个生物膜图像的 OME 文件，并使用“split channels” 功能进行查看。
   2. 使用 IMAGEJ 的“histogram” 功能分别分析两个通道（红色/碘化丙啶/死亡为通道 0，绿色/SYTO-9/活细胞为通道 1）。该功能列出 8 位 OME 文件在每个灰度强度（0 到 255，显示为“value”）下的像素总数（显示为“count”），其中 0 表示无信号像素（背景），255 表示信号完全饱和的像素。
   3. 将数据导出至电子表格程序，并通过将每个像素的计数值乘以其对应的 8 位数值（0–255）对所有信号值进行加权标准化。
   4. 对每个采集的生物膜图像的两个通道，分别求取 0–255 范围内所有加权值的总和。将两个通道的加权总和进行比较，以确定任一通道的信号占总信号的百分比。由此计算各处理组中红色信号与绿色信号的相对比例或百分比（即 各处理组中“死亡”百分比与“活细胞”百分比）。
   5. 进行统计学分析，例如采用适用于非等方差的双尾 Student's T 检验。p <0.05 视为具有显著性，p <0.01 视为具有高度显著性。

5. 收集生物膜细胞用于非培养依赖性分析

1. 清除入口和出口孔中的所有残留及未使用的唾液。用1 ml无菌蒸馏水清洗孔三次。
2. 向入口孔中加入100 µl无菌蒸馏水，并通过软件控制界面，以>8.0 dyne/cm²（流速>745 µl/hr，剪切力为800 sec^-1）的压力将无菌蒸馏水向前通过通道至少5分钟。然后反向重复冲洗至少5分钟，并再次重复正向和反向的清洗步骤。
3. 通过明场显微镜或落射荧光显微镜（若细胞已染色或标记）检查生物膜是否彻底清除（图2）。收集100 µl细胞悬液，并于-80 °C保存，用于非培养依赖性分析。可通过采用Nance et al. ²⁰所述方法进行细菌标签编码FLX扩增子焦磷酸测序（bTEFAP），以经济高效地分析群落组成。

结果

生物膜的三维成像

代表性结果如图3所示。IMARIS软件中一个有用的工具是可逐层查看所采集的生物膜图像堆栈，并将其合并生成三维重建图像。此外，还可添加人工阴影效果，以帮助直观地解读三维结构。渲染后的生物膜图像可任意旋转方向并调整放大倍数，以观察生物膜或微菌落的结构。图3中展示的图像为口腔多物种生物膜经处理后的结果。值得注意的是，经70%乙醇处理后，大部分生物膜呈现明显的颜色变化（由绿色变为红色），提示细胞大量死亡或受损。较大的微菌落似乎比其下方（现暴露的）微菌落含有更多的死细胞。这一结果可能归因于乙醇作为膜活性抗菌剂导致生物膜细胞脱附。通过将文件转换为OME格式，并在IMAGEJ中分析渲染后的图像堆栈，应用直方图函数可发现，未经处理与经乙醇处理的生物膜中红色与绿色信号的强度呈反比关系。

生物膜特性的定量分析

讨论

本文方法学论文重点介绍了建立和运行微流控系统所需的基本步骤，以促进利用混合人唾液来源的接种物在滤膜过滤除菌的25%混合人唾液培养基中形成口腔多物种生物膜。文中提供了对生物膜进行表征的方法，但需注意，这些方法均可根据需要进行修改，并可引入其他技术手段，例如染色或标记方法。举例而言，可使用标记的抗体或引入荧光标记菌株，以可视化并分析特定物种在口腔多物种生物膜中的空间分布位置。此外，根据所使用的微流控系统型号不同，还可在厌氧条件下培养生物膜（例如，在使用Bioflux系统时，可在Fluxion.com网站上获取关于此问题的技术说明文档）。

Bioflux 微流控系统的一个关键特性是其与多种技术的兼容性，这一点通过能够进行无需培养的多样性分析得到了充分体现（图3）。尽管微流控系统内部表面不易直接接触，但通过强烈的正向和反向流可以去除大量生物膜生物量。虽然并非所有生物膜都能被轻易清除，这可能被视为该系统的一个局限性，但值得注意的是，许多模型生物膜系统也存在类似问题，因此在解读由此类采集数据得出的结论时，必须考虑到这一因素。例如，链球菌在生物膜中的实际丰度可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml 圆锥形离心管（Falcon）	Fisher Scientific	14-432-22
15 ml 圆锥形离心管（Falcon）	Fisher Scientific	14-959-49D
二硫苏糖醇（DTT，白色晶体或粉末/电泳级），Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval 超速离心机 （兼容 SS-34 转子）	Thermoscientific	取决于设备型号
Thermo Scientific SS-34 角转子	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific 一级试剂级去离子水	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene 快流速滤器单元及瓶顶滤器，PES 膜，无菌	VWR	73520-986
甘油	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux 微流控系统	Fluxion	Bioflux 200 系统
Bioflux 24 通道板	Fluxion	910-0004
PBS（Gibco）	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD 染色试剂（Invitrogen）	Invitrogen	L7012
共聚焦激光扫描显微镜	Lecia	SPE 或同等系统
落射荧光显微镜	多种选择	多种选择
焦磷酸测序平台	多种选择	多种选择
Decon SaniHol 70% 乙醇溶液	Fisher Scientific	04-355-122
超低温冰箱 -80 °C	多种选择	多种选择
移液器吸头（20、200 和 1,000 μl）	多种选择	多种选择
单通道可调体积移液器（20、200、1,000 μl）	多种选择	多种选择
软件
Bioflux 专用软件	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	免费软件（http://imagej.nih.gov/ij/）
COMSTAT/COMSTAT 2	免费软件（http://www.comstat.dk/）