方法文章

三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

17K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52469

⸱

2015年2月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

本文内容

摘要

本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。

摘要

癌症的发生（起始、生长、侵袭和转移）是通过恶性细胞与周围肿瘤间质细胞相互作用而实现的。肿瘤微环境由多种细胞类型组成，例如成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、周细胞以及骨髓来源的细胞，这些细胞嵌入在细胞外基质（ECM）中。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌可溶性因子、促进血管生成以及重塑ECM，在肿瘤发生过程中发挥促瘤作用。目前针对癌细胞存活、增殖、迁移和侵袭的实验模型，主要依赖于二维的单细胞或单层组织培养，或Boyden小室实验。然而，这些实验并不能精确反映病变器官中的生理或病理条件。为了更深入地理解肿瘤间质或肿瘤基质之间的相互作用，多细胞和三维培养体系为研究细胞间通讯以及细胞外基质对癌细胞行为的依赖性调控提供了更强大的工具。作为此类研究的平台，我们提出一种实验模型，即在嵌有原代培养的CAFs的胶原凝胶上共培养癌细胞。

引言

癌组织可被视为一种器官，其演化过程依赖于癌细胞与肿瘤间质微环境之间的密切相互作用，后者由癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞、肿瘤血管以及细胞外基质（ECM）构成。CAFs 是多种可溶性因子（如细胞因子、生长因子和趋化因子）的主要来源，这些因子对癌细胞具有促有丝分裂、促迁移和促侵袭的作用。此外，CAFs 还能促进肿瘤血管生成，并募集骨髓来源细胞（BMDC）等前体细胞。活化的 CAFs 参与 ECM 的合成与重塑，从而促进癌细胞的生长与扩散1。CAFs 还可形成有利于肿瘤细胞定植和转移的微环境，并能够将干细胞样表型赋予邻近的癌细胞。病理学观察表明，癌组织中的间质反应或纤维化改变提示预后不良。近期研究还发现，肿瘤间质特征（如基因表达谱）可用于预测患者的预后。此外，CAFs 分泌的因子可调节肿瘤对化疗的敏感性，凸显了 CAFs 在决定药物敏感性与耐药性中的关键作用2。

由于癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过介导CAFs与肿瘤微环境中不同类型细胞之间相互作用的信号通路，在促进肿瘤进展中发挥多重作用，因此它们作为癌症治疗的新靶点正受到越来越多的关注。癌症微环境中细胞群体的异质性为靶向CAFs带来了挑战。已有若干CAFs的标志物被提出，例如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）和成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1：也称为S100A4）；然而，这些分子标志物并不能特异性地区分CAFs与非癌组织中存在的其他细胞3。因此，需要进一步研究以更深入地了解CAFs的特异性特性。为此，将原代培养的CAFs与患者匹配的正常成纤维细胞进行比较表征具有重要意义。

近期，多项研究报道了来源于不同癌症类型的患者源性癌相关成纤维细胞（CAFs）的分析结果，揭示了其相较于非癌组织来源的成纤维细胞具有独特的基因表达模式和细胞行为特征。我们利用从人肺癌组织中分离得到的CAFs，建立了一种三维共培养方法，可用于评估肺来源CAFs的生物学特性。在该模型中，我们研究了CAFs对肺癌细胞侵袭、增殖以及胶原凝胶收缩的影响，从而在实验上重现了肺CAFs促进肿瘤发展的功能作用4。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本研究已获得相应伦理委员会的批准。

1. 人肺成纤维细胞的原代培养

  1. 肺组织的采集：
    1. 直接从外科手术室获取人肺组织样本。从癌变和非癌变肺组织中分别采集约 1 cm3 的组织块，非癌变组织样本应尽可能远离肿瘤部位采集。
    2. 将组织样本悬浮于添加了 100 单位/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 0.25 μg/ml 两性霉素 B 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中（无血清培养基）。将悬浮的样本置于无菌的 50 ml 离心管中，并转移至实验室。
      注：成纤维细胞相较于上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等其他细胞类型具有更强的迁移性和增殖能力。组织块外翻法正是利用了成纤维细胞的这些特性，从组织切片中长出的细胞以成纤维细胞为主。经过数次传代后，其他类型的细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中无法存活和扩增，从而获得纯化的成纤维细胞培养物。细胞可在原代培养后第 3–7 代使用。
  2. 组织块培养及细胞外翻的准备：
    1. 采用先前报道的方法并加以改进进行成纤维细胞的原代培养5。
    2. 在实验室中，将组织样本置于 10 cm 组织培养皿中，不加培养基，使用无菌镊子和手术刀将其切成约 2–3 mm 大小的小块。操作过程中应避免组织干燥，否则将影响细胞外翻的效率。
  3. 上皮细胞层与结缔组织的分离：
    1. 将切好的组织块浸泡于含有 2,000 PU/ml 分散酶 I 的培养基中，在 4 °C 下孵育 16 小时。
    2. 将组织块转移至培养皿中，分离上皮细胞层与其相邻的结缔组织。在超净工作台中进行操作，以避免微生物污染。
      注：若需进行上皮细胞的原代培养，请执行步骤 1.3；若仅需分离成纤维细胞，则可省略步骤 1.3，因为后续的组织块培养和细胞传代不利于上皮细胞生长，从而获得纯化的成纤维细胞群体。
  4. 组织块的贴附：
    1. 使用两把手术刀将组织切成 1 mm 大小的碎片。若碎片过大，则容易从培养皿上脱落，导致细胞无法在皿表面外翻生长。
    2. 将小块肺组织彼此分开放置，使每一块周围均留有空隙区域。使用手术刀片在组织培养皿表面划痕，以促进组织块的贴附。
      注：划痕似乎也有助于细胞外翻，为细胞迁移提供路径。
      1. 或者，将切碎的组织块分别放入 6 孔板的各个孔中，并用盖玻片覆盖。使用硅脂将盖玻片固定在孔板表面。
      2. 使用无菌针头在每个孔中相距 1.5 cm 的两个位置点加硅脂。覆盖组织块可提高细胞外翻效率，并在多次传代后增强细胞扩增效果。
  5. 后续组织块培养：
    1. 在组织块干燥前轻柔地加入培养基，因为一旦样本干燥，细胞外翻效率将显著下降。加入培养基时不可过快，以免导致组织块脱落。
    2. 在含 10% FBS 的 DMEM 中培养细胞。加入足够覆盖组织的培养基，但不宜过多，以免组织漂浮；过多的浮力会促进组织块从皿上脱落。
  6. 细胞传代：
    1. 始终小心操作培养基，频繁移动培养皿可能导致组织块脱落。
    2. 将培养皿置于 37 °C 培养箱中培养 5–7 天。每隔一天更换一次培养基，换液过程中尽量减少对培养皿的操作。成纤维细胞将在接下来的几周内从组织块边缘向外生长。
      注：约 2–3 周后，外翻的成纤维细胞几乎达到汇合状态，具体取决于培养表面积的大小。
    3. 用 1× PBS 洗涤细胞，然后向培养板中加入 1 ml 胰蛋白酶 I。
    4. 胰酶消化后，加入 9 ml 含 10% FBS 的 DMEM 终止消化并吹打下细胞。将悬浮于培养基中的细胞连同组织块一起收集至 10 ml 离心管中。离心后形成细胞沉淀，将沉淀重悬于新鲜培养基中。
    5. 将细胞和组织块接种至新的培养皿中，此时组织块无法贴壁，而细胞则贴壁并继续生长。次日通过吸除去除漂浮的组织块，并更换培养基。贴壁的成纤维细胞将在后续培养中持续扩增。

2. 人肺成纤维细胞与癌细胞的三维共培养

  1. 细胞与试剂的准备：
    1. 每个孔大约使用 2 × 105 个上皮细胞和 2.5 × 105 个成纤维细胞。准备 I 型胶原蛋白（3 mg/ml，pH 3）、胎牛血清（FBS，100%）、重构缓冲液（50 mM NaOH、260 mM NaHCO3、200 mM HEPES）、5× DMEM、含 10% FBS 的 DMEM（用于成纤维细胞培养），以及 3D 共培养培养基（成纤维细胞培养基与癌细胞培养基按 1:1 混合）。
    2. 在含 10% FBS 的 DMEM 中培养 A549 肺腺癌细胞、成纤维细胞以及 A549 3D 共培养体系。
  2. 胶原凝胶的形成：
    1. 用 1× PBS 洗涤在 10 cm 培养皿中培养的成纤维细胞，加入 1 ml 胰蛋白酶 I。在 37 °C 下消化约 5 分钟后，用 9 ml 含 10% FBS 的 DMEM 终止消化并吹打收集细胞。将细胞悬液收集至 10 ml 离心管中，在 200–300 × g 条件下离心形成细胞沉淀。
    2. 将所得细胞沉淀重悬于 100% FBS 中，细胞密度为 5 × 105/ml。
    3. 在冰上制备胶原凝胶。在操作前将试剂、移液器和离心管预先冷却至冰箱中。即使在冰上，混合物也会部分凝固，总体积小于各组分体积之和。
    4. 在每个孔中，通过混合以下成分制备胶原凝胶：0.5 ml 含成纤维细胞的 FBS 悬液（2.5 × 105 个细胞）、2.3 ml I 型胶原蛋白、670 μl 5× DMEM 和 330 μl 重构缓冲液。将凝胶置于室温下使其迅速凝固。
      1. 剧烈吹打以确保混合均匀。吹打过程中避免产生气泡。
    5. 将混合液（3 ml）加入 6 孔板的每个孔中，在 37 °C 培养箱中静置 30–60 分钟，使其充分凝胶化。
  3. 在胶原凝胶上进行癌细胞培养：
    1. 采用先前报道的方法并加以改进进行三维共培养6。
    2. 将癌细胞重悬于 3D 共培养培养基中（对于 A549 细胞可使用含 10% FBS 的 DMEM），细胞密度为 1 × 105/ml。
    3. 将 2 ml 重悬的细胞悬液（含 2 × 105 个细胞）均匀铺加至每块凝胶表面。根据实验条件可调整共培养中癌细胞或成纤维细胞的数量。
  4. 凝胶收缩：
    1. 将凝胶在 37 °C 培养过夜，使癌细胞充分贴附于胶原凝胶。随后将每块凝胶剥离，于 6 孔板的每个孔中建立“悬浮培养”体系。
      注：通过悬浮培养，共培养的癌细胞与成纤维细胞之间的细胞相互作用可介导机械张力和胶原降解，从而引起凝胶尺寸的多种变化。
    2. 使用倾斜的 21 G 针头或小刮铲将每块凝胶从孔壁边缘分离。每隔 2–3 天更换 2 ml 新鲜的 3D 共培养培养基。连续 5 天每天测量每块凝胶的尺寸。
  5. 胶原凝胶的分析：
    1. 使用胶原定量方法（如 Sircol 法）测定每块凝胶中的胶原含量。从凝胶中提取 RNA 后，进行转录组分析或定量 RT-PCR5。

3. 气液界面培养与侵袭实验

  1. 将胶原凝胶在 37 °C 下培养 5 天后，通过将其置于新 6 孔板中的筛网（70 μm 孔径）上使其暴露于空气中。筛网可由市售的流式细胞术用细胞滤器制成。
  2. 用无菌移液器轻轻向每孔加入 11 ml 3D 共培养基。
  3. 使用无菌勺子将凝胶放置在筛网上，并去除凝胶表面残留的培养基。在此条件下，使凝胶浸没于培养基中，同时将凝胶的上表面暴露于空气。将此培养条件定义为空气-液体界面。
    注意：在 37 °C 培养箱中维持空气-液体界面培养 5–7 天后，侵袭性癌细胞会迁移进入凝胶。根据细胞类型以及细胞间相互作用的结果，空气-液体界面培养可诱导癌细胞出现不同程度的形态学改变。
  4. 用于组织学评估时，将凝胶在室温下用福尔马林溶液固定过夜，并包埋于石蜡中。对垂直切片（4 μm）进行苏木精-伊红（H&E）染色。对切片进行免疫组织化学分析4。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

这种共培养方法通过模拟肿瘤微环境，成为研究癌细胞与嵌入胶原凝胶中的成纤维细胞之间相互作用的有效工具。在先前的研究中，该实验模型评估了三个参数：胶原凝胶收缩、癌细胞侵袭以及形态学变化。同时通过Ki67免疫染色法估测癌细胞的增殖情况4。肺组织样本取自切除肺叶中的癌变区域和非癌变区域（图1A）。将样本切碎成小块，并在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中进行培养（图1B）。在显微镜下观察从组织块中迁移生长出的成纤维细胞（图1C）。将原代培养的肺成纤维细胞嵌入胶原凝胶中（图2A, a），并在凝胶上共培养A549肺癌细胞（图2A, b）。在培养基中进行漂浮培养后（图2A, c），将凝胶进一步置于气-液界面条件下继续培养（图2A, d）。随后用福尔马林固定凝胶，用于免疫组织化学分析（图2A, e）。对于气-液界面培养，将凝胶置于6孔板中一个网格支架上（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

CAFs 构成癌细胞周围细胞外基质（ECM）的主要部分，不仅为肿瘤提供结构支架，还积极参与肿瘤的发展7。越来越多的证据揭示了 CAFs 或其相关分子对最终预后的影响，凸显了 CAF 介导的肿瘤进展的关键作用8。

在之前的研究中，我们采用组织块法分离肺部CAFs4。在本实验中，维持组织切片与培养皿表面的黏附至关重要。若组织切片漂浮于培养基中，则细胞无法从组织中迁移出来；一旦组织切片脱离表面，便无法在同一培养皿上继续用于细胞外生长。切割组织时产生的渗出物可作为黏附于培养皿表面的“胶水”。使用盖玻片固定组织切片时，所用封固剂的量也十分关键：用量过少会导致盖玻片无法固定，而用量过多则会遮蔽细胞培养区域。利用盖玻片并施加适当压力固定组织切片，是促进细胞外生长的关键步骤。

目前，癌细胞增殖和侵袭的实验模型主要依赖于二维单层组织培养或Boyden小室实验。为了更深入地理解细胞间通讯以及细胞外基质（ECM）对癌细胞行为的调控作用，三维共培养是一种强有力的工具。类器官培养也有助于...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本研究得到了科学研究费补助金（KAKENHI）（26461185 和 25460137）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Ⅰ型胶原蛋白ANitta gelatin Inc.CELL-1A
重悬缓冲液Nitta gelatin Inc.
盖玻片NUNC174934
硅脂Dow Corning Toray高真空润滑脂
Dispase IWAKO386-02271
6孔板BD Falcon353046
细胞筛（70 μm）BD Falcon352350

参考文献

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62(2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747(2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章